2. Materials and methods2.1. Chemic

2. Materials and methods
2.1. Chemicals and reagents
Methanol, dipotassium hydrogen phosphate trihydrate and
sodium dihydrogen phosphate dihydrate (all in analytical grade)
were purchased from Sinopharm chemical Co., Ltd. (Shanghai,
China). Sodium 3-trimethylsilyl [2,2,3,3-2D4] propionate (TSP)
and Deuterated water (D2O, 99.9% in D) were purchased from
Cambridge Isotope Laboratories. (Miami, FL, USA). Phosphate
buffer (K2HPO4/NaH2PO4, 0.1 M, pH 7.4) was prepared in H2O
containing 90% D2O to provide an NMR field lock and 0.005%
TSP (w/v) as an internal standard (Xiao, Dai, Liu, Wang, &
Tang, 2008).
2.2. Sample treatment
Eight alive P. trituberculatus (about 200 g) and ingredients
including salt, sugar, monosodium glutamate, and liquor were purchased from a supermarket at Ningbo city in Zhejiang province,
southeast China. The crabs were kept on the ice and brought into
the laboratory in one hour. The crabs were all cleaned with tap
water and then cut into pieces, respectively. To make crab paste,
each group of crab meat was mixed thoroughly with ingredients
including 2% salt, 4% sugar, 1% monosodium glutamate, and 1%
liquor and then kept at 4 C. The crab paste samples were collected
at 0 day prior to fermentation and 1, 3, 5, and 7 days after fermentation. All samples were then snap-frozen in liquid nitrogen and
stored at 80 C until metabolomics analysis.
2.3. Metabolite extraction of crab paste
Each crab paste sample (0.5 g) was extracted twice with 600 lL
of ice-cold methanol/H2O (2:1 v/v) solution via discontinuous
ultrasonication on wet ice for 150 cycles with each cycle consisting
of 2 s sonication and 2 s break. After 10 min centrifugation at
12,000 rpm and 4 C (Eppendorf centrifuge, International
Equipment Company, Dunstable, U.K.), the methanol was removed
in vacuo and the supernatants were lyophilized. Each sample
extract was reconstituted into 600 lL of phosphate buffer.
Following 10 min centrifugation at 12,000 rpm and 4 C, 550 lL
of the supernatant from each extract was transferred into a
5 mm NMR tube for NMR analysis.
2.4. NMR analysis
All NMR analyses for crab paste extracts were conducted on a
Bruker Avance III 400 MHz spectrometer (Bruker Biospin,
Germany). 1H NMR spectra were acquired at 298 K using a
NOESYGPPR1D pulse sequence with an inverse probe. The water
signal was suppressed with weak continuous wave irradiation during a 2 s relaxation delay and a 100 ms mixing time. Meanwhile, a
90 pulse length was adjusted to approximately 10 ls. Sixty-four
transients were collected into 32 k data points for each spectrum
with a spectral width of 20 ppm. For metabolite signal assignment
purposes, five two-dimensional (2D) NMR spectra were acquired at
298 K for selected samples and processed with similar parameters
described previously (Aue, Bartholdi, & Ernst, 1976a, 1976b;
Braunschweiler & Ernst, 1983). These 2D spectra included 1H
J-resolved spectroscopy, 1H–1H correlation spectroscopy, 1H–1H
total correlation spectroscopy, 1H–13C heteronuclear single quantum coherence, and 1H–13C heteronuclear multiple bond correlation spectra.
2.5. NMR data processing and multivariate data analysis
One dimensional 1H NMR spectra were multiplied by an exponential function with a line broadening factor of 1 Hz and
zero-filled to 128 k prior to Fourier transformation. These spectra
were phase- and baseline-corrected manually using TOPSPIN software (Bruker Biospin, Germany) with chemical shift referenced to
the TSP signal as d 0.00.
For multivariate data analysis, the region d 0.7–9.3 of each one
dimensional 1H NMR spectrum was uniformly bucketed into bins
with a 2.0 Hz width. The regions d 4.7–5.1 and d 3.35–3.37 were
removed to eliminate solvent signals. These binned data were further normalized to the total sum of all integrals for each spectrum
to compensate for the overall concentration differences prior to the
multivariate data analysis. Principal component analysis (PCA) was
carried out using the mean-centered data whereas the orthogonal
projection to latent structure discriminant analysis (OPLS-DA) was
conducted from the unit-variance scaled data with the software
package SIMCA-P+ (V12.0, Umetrics, Sweden). For OPLS-DA,
7-fold cross validation was used with NMR data as the X-matrix
and the group information as the Y-matrix. The quality of all
OPLS-DA models were evaluated with R2X and Q2 values, respectively indicating the explained variations and model predictabilities, and further validated for their robustness with a cross
validation-analysis of variance (CV-ANOVA) approach with
p < 0.05 as significant level (Eriksson, Trygg, & Wold, 2008). The
coefficient plots for OPLS-DA models were generated from the
back-transformed data (Cloarec et al., 2005) with an in-house
developed MATLAB script (MATLAB 7.1, Mathworks Inc., USA). A
cutoff value of 0.666 was used in this study and the metabolites
with absolute value of r above 0.666 were considered to be statistically significant (p < 0.05).
3. Results and discussion
3.1. NMR spectra for crab paste extracts
1H NMR spectroscopy was performed first to investigate the
metabolic profiling of aqueous extracts of crab paste to obtain a
detailed overview of the metabolome of crab paste. Fig. 1 shows
the representative 1H NMR spectra of crab paste extracts obtained
from aqueous methanol solvent. Twenty-eight metabolites were
readily assignable unambiguously according to our previously
reported findings (Ye et al., 2012) and published results (Fan,
1996) and further confirmed with a series of 2D NMR spectra.
These crab paste metabolites included 13 amino acids (isoleucine,
leucine, valine, alanine, methionine, glutamate, lysine, arginine,
glycine, tyrosine, phenylalanine, histidine, and tryptophan), six
organic acids (lactate, acetate, succinate, taurine, fumarate, and
formate), five metabolites of purines and pyrimidines (hypoxanthine, inosine, adenosine diphosphate (ADP), 2-pyridinemethanol,
and trigonelline), three organic bases (betaine, trimethylamine
(TMA), trimethylamine-N-oxide (TMAO)), and sucrose (Table 1).
Inspection of the spectra from different fermentation time
points of crab paste indicates that differed from each other mainly
in terms of metabolite concentration. However, a particular attention has been paid in the signal of TMA which was only observed in
the crab paste extracts on day 5 and day 7, whereas not in the samples from day 0 to day 3. TMA is a basic aliphatic tertiary amine
and its content is strongly correlated to the freshness of fish such
as cod (Burt, Gibson, Jason, & Sanders, 1976; Gill, 1990). Fish freshness lowers with the increasing concentration of TMA (Zhao et al.,
2002). Hence TMA concentration is one of the most important indicator for the assessment of quality in many marine fish (Botta,
Lauder, & Jewer, 1984; Heising, van Boekel, & Dekker, 2014;

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2. วัสดุและวิธีการ2.1. เคมีและ reagentsเมทานอล trihydrate dipotassium ไฮโดรเจนฟอสเฟต และโซเดียมไดไฮโดรเจนฟอสเฟต dihydrate (ทั้งในระดับวิเคราะห์)ซื้อจาก Sinopharm chemical Co., Ltd. (เซี่ยงไฮ้ประเทศจีน) โซเดียม 3-trimethylsilyl [2,2,3,3 2 D 4] propionate (ช้อนชา)และซื้อน้ำ Deuterated (D2O, 99.9% D) จากห้องปฏิบัติการไอโซโทปเคมบริดจ์ (Miami, FL สหรัฐอเมริกา) ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (K2HPO4/NaH2PO4, 0.1 M, pH 7.4) ถูกเตรียมใน H2Oประกอบด้วย 90% D2O ให้การล็อกฟิลด์ NMR และ 0.005%ช้อนชา (w/v) เป็นการภายใน (เสี่ยว ได หลิว วัง &ถัง 2008)2.2 การตัวอย่างรักษา8 trituberculatus P. ชีวิต (ประมาณ 200 กรัม) และส่วนผสมได้แก่เกลือ น้ำตาล กลูตาเมต และเหล้าซื้อจากซูเปอร์มาร์เก็ตในเมืองหนิงโปในจังหวัดเจ้อเจียงจีนตะวันออกเฉียงใต้ ปูเก็บไว้บนน้ำแข็ง และนำเข้าห้องปฏิบัติการในหนึ่งชั่วโมง ปูได้ทั้งหมดความสะอาด ด้วยเคาะน้ำแล้ว ตัดเป็นชิ้น ตามลำดับ ต้องวาง ปูแต่ละกลุ่มของปูถูกผสมอย่างละเอียด ด้วยส่วนผสมเกลือ 2%, 4% น้ำตาล กลูตาเมต 1%, 1% และสุราแล้ว เก็บไว้ที่ค. 4 ตัวอย่างการวางปูถูกเก็บรวบรวมในวันที่ 0 ก่อนหมัก และ 1, 3, 5 และ 7 วันหลังจากหมัก ตัวอย่างทั้งหมดแล้วมีสแนปแช่ในไนโตรเจนเหลว และเก็บไว้ที่ 80 C จน metabolomics วิเคราะห์2.3. metabolite สกัดวางปูแต่ละตัวอย่างวางปู (0.5 กรัม) ถูกสกัด ด้วย 600 สองจะของเมทานอลฉ่ำ H2O (2:1 v/v) ผ่านไม่ต่อเนื่องultrasonication บนเปียกน้ำแข็ง 150 รอบโดยแต่ละวงจรประกอบด้วย2 s sonication และ s 2 แบ่ง หลังจาก 10 นาที centrifugation ที่12000 รอบต่อนาทีและ 4 C (Eppendorf เครื่องหมุนเหวี่ยง นานาชาติบริษัทอุปกรณ์ ดัลส์เทเบิล สหราชอาณาจักร), เมทานอลถูกเอาออกใน vacuo และ supernatants มี lyophilized แต่ละตัวอย่างสารสกัดที่ reconstituted เป็น 600 จะบัฟเฟอร์ฟอสเฟตต่อ 10 นาที centrifugation 12000 rpm และ 4 C, 550 จะของ supernatant จากสารสกัดแต่ละถูกโอนย้ายไปหลอด 5 มม. NMR วิเคราะห์ NMR2.4 การการวิเคราะห์ NMRทั้งหมด NMR วิเคราะห์สำหรับปูวางบางส่วนได้ดำเนินการในการBruker Avance III 400 MHz สเปกโตรมิเตอร์ (Bruker Biospinเยอรมนี) 1H NMR แรมสเป็คตราได้รับมาที่ 298 K ใช้เป็นลำดับชีพจร NOESYGPPR1D กับโพรบการผกผัน น้ำสัญญาณถูกระงับ ด้วยวิธีการฉายรังสีต่อเนื่อง wave อ่อนแอในระหว่างผ่อน s 2 ms 100 ที่ผสมเวลา ในขณะเดียวกัน การความยาวของชีพจร 90 ถูกปรับประมาณ 10 ls หกสี่แม้แต่ผู้ได้รวบรวมลงในจุดข้อมูล k 32 สำหรับสเปกตรัมแต่ละกว้างสเปกตรัมของ 20 หน้าต่อนาที สำหรับการกำหนดสัญญาณ metaboliteวัตถุประสงค์ ห้าสองมิติ (2D) NMR แรมสเป็คตราได้รับมาที่298 K สำหรับเลือกตัวอย่าง และดำเนินการกับพารามิเตอร์ที่เหมือนกันอธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (Aue, Bartholdi และเอิร์นสท์ 1976a, 1976bBraunschweiler และเอิร์นสท์ 1983) แรมสเป็คตราเหล่านี้ 2D รวม 1Hแก้ไขเจก กความสัมพันธ์ 1H 1H, 1H 1Hรวมสหก 1H – 13C heteronuclear ควอนตัมเดียวโปรเจค และ 1H 13C heteronuclear หลายพันธะความสัมพันธ์แรมสเป็คตรา2.5. NMR multivariate และประมวลผลข้อมูลวิเคราะห์ข้อมูลหนึ่งมิติ 1H NMR แรมสเป็คตราถูกคูณ โดยฟังก์ชันเอ็กซ์โพเนนเชีย ด้วยเส้น broadening ปัจจัย 1 Hz และศูนย์เต็มไปด้วยการ 128 k ก่อนการแปลงฟูรีเย แรมสเป็คตราเหล่านี้แก้ไขระยะ และพื้นฐานด้วยตนเองใช้ TOPSPIN ซอฟต์แวร์ (Bruker Biospin เยอรมนี) กับกะเคมีที่อ้างอิงถึงยังสัญญาณช้อนชาเป็น 0.00 dสำหรับการวิเคราะห์ข้อมูลตัวแปรพหุ ภูมิภาค d 0.7 – 9.3 ของแต่ละคนมิติ 1H NMR สเปกตรัมไม่สม่ำเสมอเมื่อเทียบเคียง bucketed ลงในช่องกว้าง 2.0 Hz ภูมิภาค d 4.7 – 5.1 และ d 3.35 – 3.37เอาออกเพื่อกำจัดสัญญาณตัวทำละลาย ข้อมูลเหล่านี้ binned ถูกตามปกติผลรวมรวมของปริพันธ์ทั้งหมดสำหรับคลื่นแต่ละเพิ่มเติมเพื่อชดเชยความแตกต่างความเข้มข้นโดยรวมก่อนการการวิเคราะห์ข้อมูลตัวแปรพหุ มีส่วนประกอบหลักการวิเคราะห์ (PCA)ดำเนินการโดยใช้ข้อมูลค่าเฉลี่ยแปลกขณะ orthogonalคาดการณ์การวิเคราะห์ discriminant โครงสร้างแฝงอยู่ (OPLS-ดา)ดำเนินการจากข้อมูลหน่วยต่างปรับกับซอฟต์แวร์แพคเกจ SIMCA-P + (V12.0, Umetrics สวีเดน) สำหรับดา OPLSตรวจสอบไขว้ 7-fold ใช้กับข้อมูล NMR เป็นเมตริกซ์ Xและข้อมูลกลุ่มเป็นเมตริกซ์ Y คุณภาพของทั้งหมดรุ่น OPLS-ดาถูกประเมินกับ R2X และ Q2 ค่า ตามลำดับแสดงอธิบายรูปแบบและรุ่น predictabilities และตรวจสอบเพิ่มเติม สำหรับเสถียรภาพของพวกเขากับการข้ามตรวจสอบวิเคราะห์ความแปรปรวน (CV-การวิเคราะห์ความแปรปรวน) วิธีด้วยพี < 0.05 ระดับสำคัญ (วงการเกม Trygg, & จะ 2008) ที่ผืนสัมประสิทธิ์สำหรับรุ่น OPLS ดาสร้างขึ้นจากการหลังแปลงข้อมูล (Cloarec et al., 2005) ในบ้านพัฒนาสคริปต์ MATLAB (MATLAB 7.1, Mathworks Inc., USA) Aใช้ในการศึกษานี้และ metabolites ตัดยอดค่า 0.666มีค่าสัมบูรณ์ของ r ข้าง 0.666 ได้ถือเป็น อย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ (p < 0.05)3. ผลลัพธ์ และสนทนา3.1. NMR แรมสเป็คตราสำหรับปูวางสารสกัดจากก 1H NMR ทำก่อนการตรวจสอบการสร้างโพรไฟล์เผาผลาญสารสกัดจากอควีของปูวางได้รับการภาพรวมรายละเอียดของ metabolome ปูวาง แสดง fig. 1การพนักงาน 1H NMR แรมสเป็คตราปูวางได้รับสารสกัดจากจากตัวทำละลายเมทานอลอควี มียี่สิบแปด metabolitesพร้อมสามารถกำหนดได้อย่างชัดเจนตามการของเราก่อนหน้านี้รายงานการค้นพบ (Ye et al., 2012) และประกาศผล (พัดลมปี 1996) และยืนยันเพิ่มเติม มีชุดแรมสเป็คตรา NMR 2Dเหล่านี้ปูวาง metabolites รวม 13 กรดอะมิโน (isoleucine, leucine วาลีน อะลานีน methionine, glutamate แอล-ไลซีนอาร์จิ นีนglycine, tyrosine, phenylalanine, histidine และทริปโตเฟน), 6กรดอินทรีย์ (lactate, acetate, succinate, taurine, fumarate และรูปแบบเอกสาร), ห้า metabolites ของ purines และ pyrimidines (hypoxanthine, inosine อะดี diphosphate (ADP) 2-pyridinemethanolและ trigonelline), อินทรีย์สามฐาน (betaine, trimethylamine(TMA), trimethylamine-เอ็นออกไซด์ (TMAO)), และซูโครส (ตารางที่ 1)ตรวจสอบแรมสเป็คตราจากเวลาหมักแตกต่างกันบ่งชี้จุดวางปูที่แตกต่างกันส่วนใหญ่ในแง่ของความเข้มข้นของ metabolite อย่างไรก็ตาม ความสนใจเฉพาะได้ถูกจ่ายในสัญญาณของ TMA ซึ่งเท่าที่สังเกตในปูวางบางส่วนในวันที่ 5 และวันที่ 7 ในขณะที่ไม่ได้อยู่ในตัวอย่างจากวัน 0 วัน 3 TMA เป็น amine aliphatic ต่อพื้นฐานและเนื้อหาเป็นอย่างยิ่ง correlated กับความสดของปลาดังกล่าวเป็น cod (เบิร์ต กิบสัน Jason และแซ นเดอร์ส์ 1976 เหงือก 1990) ปลาสดลด ด้วยเพิ่มความเข้มข้นของ TMA (เจียว et al.,2002) ดังนั้น TMA สมาธิเป็นหนึ่งในตัวบ่งชี้ที่สำคัญที่สุดสำหรับการประเมินคุณภาพในปลาทะเลมาก (BottaLauder ราก & Jewer, 1984 Heising, van Boekel และ Dekker, 2014

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2. วัสดุและวิธีการ
2.1 สารเคมีและสารเคมีเมทานอล dipotassium trihydrate ฟอสเฟตไฮโดรเจนและโซเดียมไดไฮโดรเจนฟอสเฟต(ในชั้นประถมศึกษาวิเคราะห์) ที่ซื้อมาจาก Sinopharm เคมี จำกัด (เซี่ยงไฮ้ประเทศจีน) โซเดียม 3 trimethylsilyl [2,2,3,3-2D4] propionate (TSP) และน้ำ deuterated (D2O, 99.9% ใน D) ที่ซื้อมาจากเคมบริดจ์ไอโซโทปห้องปฏิบัติการ (ไมอามี่, ฟลอริด้า, สหรัฐอเมริกา) ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (K2HPO4 / NaH2PO4 0.1 M ค่า pH 7.4) ถูกจัดทำขึ้นใน H2O ที่มี 90% D2O เพื่อให้ล็อคสนาม NMR และ% 0.005 TSP (w / v) เป็นมาตรฐานภายใน (Xiao ไดหลิววังและถัง 2008). 2.2 การรักษาตัวอย่างแปดชีวิตพี trituberculatus (ประมาณ 200 กรัม) และส่วนผสมรวมทั้งเกลือน้ำตาลผงชูรสและสุราที่ซื้อมาจากซูเปอร์มาร์เก็ตที่เมืองหนิงในมณฑลเจ้อเจียงทางตะวันออกเฉียงใต้ของประเทศจีน ปูถูกเก็บไว้บนน้ำแข็งและนำเข้ามาในห้องปฏิบัติการในหนึ่งชั่วโมง ปูถูกทำความสะอาดทุกด้วยการแตะน้ำแล้วหั่นเป็นชิ้นตามลำดับ เพื่อให้การวางปูกลุ่มของเนื้อปูแต่ละผสมที่มีส่วนผสมรวมทั้งเกลือ2%, 4% น้ำตาลผงชูรส 1% และ 1% สุราแล้วเก็บไว้ที่ 4 องศาเซลเซียส กลุ่มตัวอย่างที่วางปูถูกเก็บที่ 0 วันก่อนที่จะมีการหมักและ 1, 3, 5 และ 7 วันหลังจากการหมัก ตัวอย่างทั้งหมดได้รับการสแน็ปอินแล้วแช่แข็งในไนโตรเจนเหลวและเก็บไว้ที่? 80? C จนถึงการวิเคราะห์ metabolomics. 2.3 สกัด metabolite ของปูวางแต่ละตัวอย่างวางปู(0.5 กรัม) ถูกสกัดเป็นครั้งที่สอง 600 LL เมทานอลเย็น / H2O (2: 1 v / v) การแก้ปัญหาผ่านทางต่อเนื่องultrasonication บนน้ำแข็งเปียก 150 รอบกับแต่ละรอบประกอบด้วย2 s sonication และ 2 วินาทีพัก หลังจาก 10 นาทีการหมุนเหวี่ยงที่12,000 รอบต่อนาทีและ 4? C (centrifuge Eppendorf นานาชาติอุปกรณ์บริษัท สเตเบิ้ลสหราชอาณาจักร), เมทานอลจะถูกลบออกในสุญญากาศและsupernatants ถูกแห้ง แต่ละตัวอย่างสารสกัดถูกสร้างขึ้นลงใน 600 LL ของฟอสเฟตบัฟเฟอร์. หลังจาก 10 นาทีการหมุนเหวี่ยงที่ 12,000 รอบต่อนาทีและ 4 องศาเซลเซียส 550 LL ของสารละลายสารสกัดจากแต่ละถูกย้ายเป็น5 มมหลอด NMR สำหรับการวิเคราะห์ NMR. 2.4 การวิเคราะห์ NMR ทั้งหมด NMR วิเคราะห์สารสกัดวางปูได้ดำเนินการในBruker Avance III 400 MHz สเปกโตรมิเตอร์ (Bruker BIOSPIN, เยอรมนี) สเปกตรัม 1H NMR ได้มาที่ 298 K ใช้ลำดับชีพจรNOESYGPPR1D กับการสอบสวนที่ตรงกันข้าม น้ำสัญญาณถูกระงับด้วยการฉายรังสีคลื่นที่อ่อนแออย่างต่อเนื่องในช่วง 2 ล่าช้าผ่อนคลายและ 100 มิลลิวินาทีเวลาผสม ขณะที่90? ระยะเวลาในการเต้นของชีพจรมีการปรับประมาณ 10 คำสั่ง ls หกสิบสี่ชั่วคราวถูกเก็บเข้า 32 k จุดข้อมูลสำหรับแต่ละคลื่นความถี่ที่มีความกว้างของราง20 ppm สำหรับสัญญาณ metabolite การกำหนดวัตถุประสงค์ในห้าสองมิติ(2D) NMR สเปกตรัมได้มาที่298 K สำหรับกลุ่มตัวอย่างที่เลือกและการประมวลผลด้วยพารามิเตอร์ที่คล้ายกันอธิบายไว้ก่อนหน้า(ซ Bartholdi และเอิร์นส์, 1976a, 1976b; Braunschweiler และเอิร์นส์, 1983) เหล่านี้สเปกตรัม 2D รวม 1H สเปกโทรสโกมีมติ-J, 1H-1H สเปกโทรสโกความสัมพันธ์ 1H-1H สเปกโทรสโกสัมพันธ์รวม 1H-13C วิวิธพันธ์เชื่อมโยงกันควอนตัมเดียวและ 1H-13C วิวิธพันธ์หลายสเปกตรัมสัมพันธ์พันธบัตร. 2.5 NMR การประมวลผลข้อมูลและการวิเคราะห์ข้อมูลหลายตัวแปรหนึ่งมิติสเปกตรัม1H NMR ถูกคูณด้วยฟังก์ชั่นการชี้แจงกับเส้นขยายปัจจัย 1 เฮิร์ตซ์และเป็นศูนย์ที่เต็มไปด้วยถึง128 k ก่อนที่จะมีการเปลี่ยนแปลงฟูริเยร์ สเปกตรัมเหล่านี้เป็นพื้นฐานและ phase--แก้ไขด้วยตนเองโดยใช้ซอฟแวร์ topspin (Bruker BIOSPIN, เยอรมนี) ที่มีการเปลี่ยนแปลงทางเคมีอ้างอิงสัญญาณTSP เป็น 0.00 d. สำหรับการวิเคราะห์ข้อมูลหลายตัวแปรภูมิภาคง 0.7-9.3 ของแต่ละคนมิติสเปกตรัม1H NMR เป็น สม่ำเสมอ bucketed ในถังขยะมีความกว้าง2.0 เฮิร์ตซ์ ภูมิภาค d 4.7-5.1 และง 3.35-3.37 ถูกลบออกเพื่อขจัดสัญญาณตัวทำละลาย ข้อมูล binned เหล่านี้เป็นปกติต่อไปเพื่อผลรวมของอินทิกรัทั้งหมดในแต่ละคลื่นความถี่เพื่อชดเชยความแตกต่างของความเข้มข้นโดยรวมก่อนที่จะมีการวิเคราะห์ข้อมูลหลายตัวแปร การวิเคราะห์องค์ประกอบหลัก (PCA) ได้รับการดำเนินการโดยใช้ข้อมูลค่าเฉลี่ยเป็นศูนย์กลางในขณะที่ฉากฉายในการวิเคราะห์จำแนกโครงสร้างแฝง(OPLS-DA) ได้รับการดำเนินการจากความแปรปรวนหน่วยปรับข้อมูลกับซอฟต์แวร์แพคเกจSIMCA-P + (V12.0, Umetrics, สวีเดน) สำหรับ OPLS-DA, การตรวจสอบข้าม 7 เท่าถูกนำมาใช้กับข้อมูล NMR เป็น X-เมทริกซ์และข้อมูลกลุ่มเป็นY-เมทริกซ์ คุณภาพของทุกรุ่น OPLS-DA ได้รับการประเมินด้วย R2X และค่านิยมของไตรมาสที่ 2 ตามลำดับแสดงให้เห็นรูปแบบที่อธิบายและ predictabilities รุ่นและตรวจสอบต่อไปเพื่อความแข็งแรงของพวกเขาด้วยการข้ามการตรวจสอบการวิเคราะห์ความแปรปรวน(CV-ANOVA) วิธีการที่มีp <0.05 เป็น ระดับนัยสำคัญ (Eriksson, Trygg และ Wold 2008) แปลงค่าสัมประสิทธิ์สำหรับรุ่น OPLS-DA ถูกสร้างขึ้นจากข้อมูลกลับเปลี่ยน(Cloarec et al., 2005) ที่มีในบ้านสคริปต์MATLAB พัฒนา (MATLAB 7.1 Mathworks อิงค์สหรัฐอเมริกา) ค่าตัดของ 0.666 ถูกนำมาใช้ในการศึกษาครั้งนี้และสารที่มีค่าสัมบูรณ์ของอาร์ดังกล่าวข้างต้น0.666 ได้รับการพิจารณาให้เป็นนัยสำคัญทางสถิติ (p <0.05). 3 และการอภิปรายผล3.1 NMR สเปกตรัมสำหรับสารสกัดจากปูวางสเปคโทร1H NMR เป็นครั้งแรกเพื่อตรวจสอบโปรไฟล์การเผาผลาญของสารสกัดน้ำของปูวางเพื่อให้ได้รายละเอียดภาพรวมของmetabolome วางปู รูป 1 แสดงสเปกตรัมตัวแทน1H NMR ของสารสกัดวางปูที่ได้รับจากเมทานอลเป็นตัวทำละลายในน้ำ สารยี่สิบแปดมอบหมายได้อย่างง่ายดายอย่างไม่น่าสงสัยตามที่ก่อนหน้านี้เราค้นพบรายงาน(Ye et al., 2012) และผลการตีพิมพ์ (พัดลม, 1996) และได้รับการยืนยันต่อไปด้วยชุดของสเปกตรัม 2D NMR. สารวางปูเหล่านี้รวมถึง 13 กรดอะมิโน ( isoleucine, leucine, วาลีน, อะลานีน, methionine, กลูตาเมต, ไลซีน, อาร์จินี, glycine, ซายน์, phenylalanine, ฮิสติดีนและโพรไบโอ) หกกรดอินทรีย์(นมอะซิเตท, succinate, ทอรีน, fumarate และรูปแบบ) ห้าสารของพิวรีน และไซ (hypoxanthine, inosine, adenosine เพท (ADP) 2 pyridinemethanol, และ trigonelline) สามฐานอินทรีย์ (betaine, trimethylamine (TMA) trimethylamine-N-ออกไซด์ (TMAO)) และน้ำตาลซูโครส (ตารางที่ 1). การตรวจสอบ ของสเปกตรัมจากเวลาในการหมักที่แตกต่างกันจุดที่วางปูแสดงให้เห็นว่าแตกต่างไปจากคนอื่นๆ ส่วนใหญ่ในแง่ของความเข้มข้นของสาร แต่ความสนใจโดยเฉพาะอย่างยิ่งได้รับการจ่ายสัญญาณของ TMA ซึ่งพบเฉพาะในสารสกัดวางปูในวันที่5 และ 7 วันในขณะที่ไม่ได้อยู่ในตัวอย่างจากวันที่ 0 วัน 3. TMA เป็นเอมีนในระดับอุดมศึกษาพื้นฐาน aliphatic และของ เนื้อหามีความสัมพันธ์อย่างยิ่งกับความสดของปลาดังกล่าวเป็นปลา(เบิร์ตกิบสัน, เจสันและแซนเดอ 1976; กิลล์ 1990) ความสดปลาลดที่มีความเข้มข้นที่เพิ่มขึ้นของ TMA (Zhao et al., 2002) ดังนั้นความเข้มข้นของ TMA เป็นหนึ่งในตัวชี้วัดที่สำคัญที่สุดสำหรับการประเมินคุณภาพในหลาย ๆ ปลาทะเล (Botta, อเดอร์และ Jewer 1984; Heising รถตู้ Boekel และ Dekker 2014;

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2 . วัสดุและวิธีการ
2.1 . เคมีและสารเคมี
เมทานอล ไดไฮโดรเจนฟอสเฟตโซเดียมฟอสเฟต dihydrogen ต่างๆและ
2 ( ในอิตเทอร์เบียม )
ซื้อมาจาก sinopharm Chemical Co . , Ltd ( Shanghai
จีน ) โซเดียม 3-trimethylsilyl [ 2,2,3,3-2d4 ] propionate ( TSP ) และน้ำ (
deuterated d2o 99.9% ใน D ) ซื้อมาจาก
เคมบริดจ์ของห้องปฏิบัติการ ( Miami , FL ,สหรัฐอเมริกา ) ฟอสเฟตบัฟเฟอร์
( k2hpo4 / nah2po4 0.1 M pH 7.4 ) ถูกเตรียมใน H2O
ที่มี 90% d2o ให้ล็อค NMR ฟิลด์และ 0.005 %
TSP ( w / v ) เป็นมาตรฐานภายใน ( เสี่ยวไท หลิว หวัง &
ถัง , 2008 ) .
2.2 .
รักษาตัวอย่างแปดมีชีวิตอยู่หน้า trituberculatus ( ประมาณ 200 กรัม ) และส่วนผสม
ได้แก่ เกลือ น้ำตาล ผงชูรส ,และเหล้า ซื้อจากซูเปอร์มาร์เก็ตในเมือง Ningbo ในจังหวัด Zhejiang ,
ตะวันออกเฉียงใต้ของจีน ปูไว้บนน้ำแข็งและพามา
ปฏิบัติการในหนึ่งชั่วโมง ปูเป็นคนทำความสะอาดกับแตะ
น้ำแล้วหั่นเป็นชิ้น ตามลำดับ เพื่อให้วางปู
แต่ละกลุ่มของปูก็ละเอียดผสมกับส่วนผสม ได้แก่ เกลือ 2 %
4 % 1% ผงชูรส , น้ำตาลและ 1 %
เหล้าแล้วเก็บที่ 4 องศาเซลเซียส  ปูแปะตัวอย่าง
0 วันก่อนการหมักและ 1 , 3 , 5 และ 7 วัน หลังการหมัก ตัวอย่างทั้งหมดจะถูกแช่แข็งในไนโตรเจนเหลว และก็ถ่าย
เก็บไว้ที่  80  C จนถึงการวิเคราะห์เมตะโบโลมิก .
2.3 การสร้างสารสกัดปูกะปิ
แต่ละปูแปะตัวอย่าง ( 0.5 กรัม สกัดสองครั้งกับ 600 จะ
เย็นเมทานอล / H2O ( 21 v / v ) โซลูชั่นทางขาดตอน
ultrasonication บนน้ำแข็งเปียก 150 รอบแต่ละรอบประกอบด้วย
2 S sonication 2 แบ่ง . หลังจาก 10 นาทีปั่นที่
12 , 000 รอบต่อนาที และ 4  C ( เพนดอร์ฟ centrifuge , นานาชาติ
อุปกรณ์บริษัท Dunstable , สหราชอาณาจักร ) , เมทานอลถูกลบออก
ใน vacuo และ supernatants เป็นแห้ง . แต่ละตัวอย่าง
สารสกัดสามารถเป็น 600 จะของฟอสเฟตบัฟเฟอร์
ต่อไปนี้ 10 นาทีปั่นที่ 12 , 000 รอบต่อนาที และ 4  C , 550 ll
ของที่นำสารสกัดจากแต่ละถูกโอนเข้าสู่
5 มม. คุณหลอดเพื่อการวิเคราะห์ NMR
2.4 . โดยการวิเคราะห์
ทั้งหมดคุณวิเคราะห์สารสกัดน้ำพริกปูได้ดำเนินการบน
BRUKER วนซ์ 3 400 MHz Spectrometer (
biospin บรุคเกอร์ , เยอรมนี )1H NMR spectra ได้มาที่ 298 K ใช้
noesygppr1d ชีพจรลำดับกับตัวผกผัน สัญญาณน้ำ
ถูกปราบปรามด้วยอ่อนแอต่อเนื่องคลื่นรังสีในระหว่าง 2 s ผ่อนคลายล่าช้าและ MS ผสม 100 ครั้ง ในขณะเดียวกัน ,
 ชีพจร 90 ความยาวปรับประมาณ 10 มี . หกสิบสี่
ชั่วคราวครั้งนี้เป็น 32 จุด K ข้อมูลสำหรับแต่ละสเปกตรัม
กับความกว้างของสเปกตรัมของ 20 ppmสำหรับระดับสัญญาณงาน
วัตถุประสงค์ห้าสองมิติ ( 2D ) NMR spectra ได้มาที่ 298 K
ตัวอย่างและประมวลผลกับพารามิเตอร์ที่คล้ายกัน
อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ( เอื้อบาร์โตลดี& , เออร์เนส 1976a 1976b ;
, braunschweiler & Ernst , 1983 ) สเปกตรัม 2D เหล่านี้รวม 1
j-resolved spectroscopy , 1 ( 1 ) spectroscopy , 1 – 1
รวมความสัมพันธ์สเปกโทรสโคปี1 ) heteronuclear 13C ควอนตัมใน 1 เดียว และหลาย heteronuclear – 13C พันธบัตรความสัมพันธ์ Spectra .
2.5 โดยการประมวลผลข้อมูลและตัวแปรหลายตัวการวิเคราะห์ข้อมูล 1H NMR สเปกตรัม
1 มิติคือคูณด้วยฟังก์ชันเอกซ์โพเนนเชียลกับเส้นขยายปัจจัย 1 Hz และ
ศูนย์เต็ม 128 K ก่อนการแปลงฟูรีเย . โดย
เหล่านี้มีขั้นตอนและพื้นฐานการแก้ไขด้วยตนเองโดยใช้ซอฟต์แวร์สุดยอด ( BRUKER biospin , เยอรมนี ) กับเคมีกะอ้างอิง
สัญญาณ TSP เป็น D 0.00 .
สำหรับการวิเคราะห์ข้อมูลหลายตัวแปร , ภูมิภาค D 0.7 – 9.3 ของแต่ละมิติ 1H NMR สเปกตรัมได้เหมือนกัน

bucketed ในถังขยะที่มีความกว้าง 2.0 เฮิร์ต ภูมิภาค D และ D เท่ากับ 5.1 และ 4.7 – 3.37 ถูก
ลบออกเพื่อขจัดสัญญาณตัวทำละลายเหล่านี้ binned ข้อมูลเพิ่มเติมปกติกับผลรวมของทุกส่วนประกอบสำหรับ
สเปกตรัมแต่ละเพื่อชดเชยความแตกต่างความเข้มข้นรวมก่อน
การวิเคราะห์ข้อมูลหลายตัวแปร การวิเคราะห์องค์ประกอบหลัก ( PCA ) คือ
โดยใช้ค่าเฉลี่ยเป็นศูนย์กลางข้อมูลและประมาณการเพื่อการวิเคราะห์โครงสร้างแฝง )

( opls-da ) คือดำเนินการปรับข้อมูลจากหน่วยความแปรปรวนกับแพคเกจซอฟต์แวร์
simca-p ( v12.0 umetrics , สวีเดน ) สำหรับ opls-da
7-fold ข้าม , การใช้ข้อมูลที่คุณ x-matrix
และข้อมูลกลุ่มเป็น y-matrix . คุณภาพของแบบประเมินด้วย opls-da ทั้งหมด
r2x และ Q2 ค่าตามลำดับที่ระบุรูปแบบและรูปแบบ predictabilities อธิบาย ,และยังตรวจสอบความแข็งแกร่งของพวกเขากับข้าม
ตรวจสอบการวิเคราะห์ความแปรปรวน ( cv-anova ) เข้าใกล้กับ
p < 0.05 และระดับนัยสำคัญ ( & Trygg ริคสัน , , เวิลด์ , 2008 )
1 แปลง opls-da รุ่นถูกสร้างขึ้นจาก
กลับเปลี่ยนข้อมูล ( cloarec et al . , 2005 ) ที่มีคุณภาพ
พัฒนาสคริปต์ ( MATLAB MATLAB 7.1 , แมธเวิร์คส์ อิงค์ สหรัฐอเมริกา ) มีการตัดค่า
0ที่ใช้ในการศึกษาครั้งนี้และสาร
กับค่าสัมบูรณ์ของ R ข้างต้น 0.666 เป็นอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ ( p < 0.05 )
3 ผลและการอภิปราย
3.1 . NMR สเปกตรัมสำหรับปูหมักสกัด
1 NMR สเปกโทรสโกปีการแรกเพื่อศึกษา
โปรไฟล์ของสารละลายสกัดของการเผาผลาญมันปูขอรับ
ภาพรวมรายละเอียดของเมตาบ ลมของวางปู ภาพประกอบ1 แสดงให้เห็นตัวแทน 1H NMR สเปกตรัม

จากสารสกัดที่ได้วางปูน้ำเมทานอลเป็นตัวทำละลาย ยี่สิบแปดหลายชนิดถูก
พร้อมกันได้ ตามรายงานการพบของเราก่อนหน้านี้
( ท่าน et al . , 2012 ) และตีพิมพ์ผล ( พัดลม ,
1996 ) และยืนยันเพิ่มเติมด้วยชุด 2D NMR สเปกตรัม .
เหล่านี้ปูวางสารรวม 13 กรดอะมิโนไอโซลิวซีน , ลิวซีน (
,เวลีนอะลานีน , เมทไธโอนีน , ผงชูรส , ไลซีน , อาร์
glycine , ไทโรซีน , ฟีนิลอะลานีน , ฮิสติดีน และทริป ) 6
กรดอินทรีย์ ( lactate , acetate , Succinate Taurine , ฟูมาเรตและ
รูปแบบ ) , ห้าของไพริมิดีน ( สารพิวรีน และอินโนไฮโปแซนทีน , , อะดีโนซีน ไดฟอสเฟต ( ADP ) 2-pyridinemethanol , ,
และ ไตรโกเนลลีน ) , สามฐานอินทรีย์ ( บีเทน ไตรเมทิลามีน ,
( TMA )trimethylamine-n-oxide ( tmao ) และซูโครส ( ตารางที่ 1 ) .
ตรวจสอบสเปกตรัมจากเวลาที่แตกต่างกัน
การหมักจุดวางปู พบว่าแตกต่างจากแต่ละอื่น ๆส่วนใหญ่
ในแง่ของอุณหภูมิ ความเข้มข้น อย่างไรก็ตาม ความสนใจเฉพาะได้จ่ายสัญญาณของ TMA ซึ่งเพิ่งสังเกต
ปูวางสารสกัดจากวันที่ 5 และ วันที่ 7 ,ในขณะที่ไม่ได้ในตัวอย่างจากวันที่ 0 ถึงวันที่ 3 . ก็มีพื้นฐานทางด้านเอมีน
และเนื้อหามีความสัมพันธ์อย่างยิ่งกับความสดของปลาเช่น
เป็นปลา ( เบิร์ท กิ๊บสัน เจสัน & Sanders , 1976 ; กิลล์ , 2533 ) ความสดของปลาลดกับเพิ่มความเข้มข้นของ TMA ( จ้าว
et al . , 2002 )ดังนั้น TMA สมาธิเป็นหนึ่งในตัวบ่งชี้ที่สำคัญที่สุดในการประเมินคุณภาพในปลาทะเล บอตตามากมาย (
, ลอเดอร์ , & jewer , 1984 ; ไฮซิง , รถตู้ boekel &เดกเกอร์ , 2014 ;