A 1 lg aliquot of DNase-treated tot

A 1 lg aliquot of DNase-treated total RNA (DNase I Amplification Grade, Invitrogen) was reverse-transcribed as described above. Semi-quantitative RT-PCR analysis was performed by amplifying 1 ll of cDNA with 15 pmol of specific primers for PpAOS1 (5#- TCC AGC TAC ACG GAG CTT TT-3#, sense; 5#-AGG GGG TCT TCG ATG AAC TT-3#, antisense) or peach 18S rRNA (5#- ATG GCC GTT CTT AGT TGG TG-3#, sense; 5#-TAC GTC CCT GCC CTT TGT AC-3#, antisense). These primers amplified fragments of 238 bp and 356 bp, respectively, with a melting point at ;58C. The PCR conditions were: 5 min at 95 C, followed by 28 cycles at 95 C for 45 s, 58 C for 45 s, 72 C for 45 s. To verify primer specificity, the PCR products were purified with the Qiaquick PCR Purification Kit (Qiagen) and sequenced. For each sample, 10 ll of the amplification reaction was size-fractionated on a 2% (w/v) agarose gel and stained with ethidium bromide. To ensure that amplifications were in the linear range, for each template and primer pair, PCRs were run every three cycles starting from cycle 15 up to cycle 40.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ส่วนลงตัว lg 1 ของ DNase ถือว่ารวมอาร์เอ็นเอ (เกรดขยาย DNase I, Invitrogen) ได้กลับทับศัพท์ตามที่อธิบายไว้ข้างต้น ทำ RT-PCR กึ่งเชิงปริมาณวิเคราะห์ โดยมือ 1 จะของ cDNA กับ pmol 15 ของไพรเมอร์เฉพาะสำหรับ PpAOS1 (TCC 5 #อยู่มาตรวัดจีบปิดปาก CTT TT-3 รู้สึก 5 #-AGG GGG TCT TCG ATG AAC TT-3 #, antisense) หรือโรงแรมพี 18S rRNA (ATG 5 # GCC GTT CTT AGT TGG TG-3 รู้สึก มาตรวัด 5 # GTC CCT GCC CTT TGT AC-3 #, antisense) ไพรเมอร์เหล่านี้ขยายชิ้นส่วนของ 238 bp และ 356 bp ตามลำดับ กับการละลายชี้ 58C เงื่อนไข PCR ได้: 5 นาทีที่ 95 C ตามรอบ 28 ที่ 95 C สำหรับ 45 s, C 58 สำหรับ 45 s, C 72 สำหรับ 45 s การตรวจสอบพื้น specificity ผลิตภัณฑ์ PCR ที่บริสุทธิ์ที่ มีชุดฟอก PCR Qiaquick (Qiagen) และเรียงลำดับ สำหรับแต่ละอย่าง 10 จะปฏิกิริยาขยายเป็นขนาดแบ่งบนวุ้น agarose 2% (w/v) และสีกับโบรไมด์ ethidium เพื่อให้แน่ใจว่า amplifications อยู่ในช่วงเชิงเส้น สำหรับแต่ละแม่แบบและพื้นคู่ PCRs ถูกเรียกรอบสามทุกที่เริ่มต้นจากวงจร 15 ถึง 40 รอบ

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

aliquot 1 ของจีอาร์เอ็นเอรวม DNase รับการรักษา (DNase ฉันขยายเกรด Invitrogen) ย้อนกลับได้รับการคัดลอกที่อธิบายข้างต้น กึ่งวิเคราะห์เชิงปริมาณ RT-PCR ได้ดำเนินการโดยขยาย 1 LL ของยีนที่มี 15 pmol ของไพรเมอร์ที่เฉพาะเจาะจงสำหรับ PpAOS1 (5 # - ทีซีซีอาซาฮี TAC ACG GAG CTT TT-3 # ความรู้สึก 5 # -AGG GGG TCT TCG ATG AAC TT -3 # antisense) หรือพีช 18S rRNA (5 # - ATG GCC GTT CTT AGT TGG TG-3 # ความรู้สึก 5 # -TAC GTC CCT GCC CTT TGT AC-3 # antisense) ไพรเมอร์เหล่านี้ขยายชิ้นส่วนของ 238 bp และ 356 bp ตามลำดับโดยมีจุดหลอมละลายที่; 58C เงื่อนไข PCR ได้: 5 นาทีที่ 95 C ตามด้วย 28 รอบที่ 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 45 วินาที, 58 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 45 วินาที, 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 45 วินาที เพื่อตรวจสอบความจำเพาะไพรเมอร์ผลิตภัณฑ์ PCR ถูกทำให้บริสุทธิ์ด้วยวิธี PCR Qiaquick บริสุทธิ์ Kit (Qiagen) และลำดับขั้นตอน สำหรับแต่ละตัวอย่าง 10 LL ของการเกิดปฏิกิริยาการขยายเป็นขนาด fractionated บน 2% (w / v) เจล agarose และย้อมด้วย ethidium bromide เพื่อให้แน่ใจว่าเครื่องขยายเสียงอยู่ในช่วงเชิงเส้นสำหรับแต่ละแม่แบบและคู่ไพรเมอร์, PCRs วิ่งทุกสามรอบเริ่มจากรอบ 15 ถึง 40 รอบ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

1 ) การตรวจหา ADNase ส่วนลงตัวของ RNA ทั้งหมด ( ตรวจหา ADNase ผม ( เกรด Invitrogen ) คือย้อนกลับการทับศัพท์ตามที่อธิบายไว้ข้างต้น กึ่งปริมาณ โดยวิธีวิเคราะห์ข้อมูล 1 จะขยาย cDNA ด้วย 15 pmol ไพรเมอร์จำเพาะสำหรับ ppaos1 ( 5 # - TCC บริษัท TAC ACG มุขดั้งเดิม tt-3 # , ความรู้สึก ; 5 # - agg GGG TCT TCG ATG AAC tt-3 # antisense , ) หรือพีช 18S rRNA ( 5 # - ATG GCC gtt ซีทีที agt tgg tg-3 # ,ความรู้สึก ; 5 # - TAC GTC CCT GCC ซีทีที TGT ac-3 # antisense , ) ชิ้นส่วนของชนิดเหล่านี้ของคุณ BP และ 356 คู่เบส ตามลำดับ มีจุดหลอมเหลวที่ 58c เงื่อนไขทั้งหมดจะถูก : 5 นาทีที่ 95 C ตามด้วย 28 รอบ 95 C 45 , 58 c 45 S , 72 C 45 S . ตรวจสอบผลิตภัณฑ์รองพื้นวิธี PCR เป็นบริสุทธิ์ กับ qiaquick PCR ฟอก Kit ( เพิ่ม ) และนี้สำหรับแต่ละตัวอย่าง 10 จะขยายขนาดของปฏิกิริยาที่พบใน 2 % ( w / v ) และเจล ( เปื้อนทิเดียมโบรไมด์ . เพื่อให้แน่ใจว่า amplifications มีค่าอยู่ในช่วงเชิงเส้นสำหรับแต่ละแม่แบบและไพรเมอร์คู่ pcrs มีวิ่งทุกสามรอบเริ่มจากรอบ 15 ถึงรอบ 40