EXAMPLE 12: Effect of ไอโซไทป์ and

EXAMPLE 12: Effect of ไอโซไทป์ and ไอโซไทป์ mutations on พีพี
[00286] The primary Fc dependent functions of an antibody (e.g., a CD47 antibody) for target cell elimination are complement dependent cytotoxicity (CDC) initiated by
binding Clq to the Fc region; antibody dependent cytotoxicity (ADCC) mediated by the interaction of the Fc region with Fey receptors (FcyRs), primary FcyRIIIa on immune
effector cells (e.g., NK cells and Neutrophils); and antibody dependent cellular
phagocytosis (ADCP) which is carried out by มาโครฟาจ through the recognition of opsinized target cells via FcyRI. Antibody subclasses have differences in their abilities to


86






mediate Fc-dependent effector activities. In humans the IgG1 and IgG3 subclasses have the high potency for CDC due to binding Clq. In addition the IgG1 subclass has the highest แอฟฟินิตี้ for FcyRs and is thereby the most potent in terms of ADCC and Fc-dependent
ADCP. The IgG4 subclass is devoid of Clq binding ability and has greatly reduced FcyR แอฟฟินิตี้ยึดเกาะ and thereby has significantly diminished effector function.
[00287] The effect of antibodies that bind CD47 on พีพี was
investigated. Treatment of a ไซโนมอลกัส monkey with a single dose of an antibody of the IgG1 subclass that binds to CD47 resulted in significant depletion of platelets at all doses tested (10, 30, 100 mg/kg) (Figure 12C-D), compared to no significant depletion of platelets when vehicle was ให้ (Figure 12A-B). Thus, antibodies of the IgG1 subclass that bind CD47 can result in the depletion of platelets in a Fc-dependent manner.
[00288] To determine whether a different subclass of antibody also causes platelet
depletion, the experiment was repeated with a CD47 antibody of the IgG4 subclass. The
IgG4 subclass of antibody that binds CD47 (IgG4P, with the mutation S228P to stabilize the hinge region of the antibody) also resulted in depletion of platelets at all concentrations
tested, albeit to a lesser degree relative to the IgG1 subclass version (Figure E-F). Next, a mutant form of the IgG4 subclass of anti-CD47 antibody (IgG4PE, with the S228P mutation as well as a L235E mutation to reduce FcyR binding) was tested for พีพี
(Figure 12G-H). Surprisingly, the IgG4PE antibody did not result in depletion of platelets even at very high (100 mg/kg) doses. Thus, a CD47 binding antibody with severely reduced FcyR binding and effector function does not result in พีพี.
EXAMPLE 13: Red blood cell (RBC) depleting activity of the CD47 antibodies
[00289] Weiskopf et al found that when a CD47 antibody which bound mouse CD47 or an แอฟฟินิตี้ evolved SIRPa-Fc fusion protein was ให้ to mice และ / หรือ
ไซโนมอลกัส monkeys, red blood cell loss and ภาวะโลหิตจาง were observed. (See, Weiskopf et al. Engineered SIRPa Variants as Immunotherapeutic Adjuvants to Anticancer Antibodies; Science 2013; 341:88). Prior to the การประดิษฐ์ presented herein, all known CD47 binding molecules (e.g., CD47 antibodies and recombinant SIRPa-Fc fusion proteins) that block SIRPa and contain an Fc domain also induced ดีดีของ RBC.
[00290] Experiments were performed to determine the effect of the SIRPa blocking, non-hemagglutinating CD47 antibodies of the การประดิษฐ์ on รีรี in vivo. Surprisingly, non-hemagglutinating CD47 antibodies of the การประดิษฐ์ do not cause
significant รีรี after การให้. Specifically, the IgG4-P and IgG4-

87






PE variants of the AB06.12 antibody were given to ไซโนมอลกัส monkeys at doses of 10, 30, and 100 mg/kg via intravenous infusion. Three monkeys were used per dose group for each antibody. Red blood cell counts were monitored over time and compared to vehicle treated monkeys. Figure 13 depicts the mean RBC counts from antibody-treated monkeys,
normalized to the mean RBC counts of the vehicle-treated monkeys. No significant ดีดีของ RBC in the antibody treated monkeys was observed compared to vehicle treated
animals, demonstrating that non-hemagglutinating CD47 can be ให้ at high doses and without inducing amenia in the เป้าหมาย.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ตัวอย่างที่ 12: ผลของไอโซไทป์และไอโซไทป์การกลายพันธุ์บนพีพี[00286] ฟังก์ชันขึ้น Fc หลักของแอนติบอดีที่ (เช่น แอนติบอดี CD47) สำหรับการตัดเซลล์เป้าหมายจะเสริมขึ้น cytotoxicity (CDC) เริ่มต้นด้วย ผูก Clq ภูมิภาค Fc แอนติบอดีขึ้น cytotoxicity (ADCC) mediated โดยโต้ตอบภาค Fc กับ receptors Fey (FcyRs), FcyRIIIa หลักในภูมิคุ้มกัน เซลล์ effector (เช่น NK และเซลล์ Neutrophils); และแอนติบอดีขึ้นมือ phagocytosis (ADCP) ซึ่งจะดำเนินการ โดยมาโครฟาจผ่านการรู้ opsinized เซลล์เป้าหมายผ่าน FcyRI ระดับแอนติบอดีมีความแตกต่างในความสามารถในการ86 สื่อกลางขึ้นอยู่กับ Fc effector กิจกรรม ในมนุษย์ IgG1 และ IgG3 ชั้นมีศักยภาพสูงสำหรับการติดต่อเนื่องจากผูก Clq นอกจากนี้ย่อย IgG1 มีแอฟฟินิตี้สูงสุดสำหรับ FcyRs และทำ ส่วนใหญ่มีศักยภาพ ADCC และขึ้นอยู่กับสโมสรฟุตบอล ADCP ย่อย IgG4 เป็นไร้ความสามารถในการผูก Clq และมีการลดลงอย่างมาก FcyR แอฟฟินิตี้ยึดเกาะ และทำได้อย่างมีนัยสำคัญลดลง effector ฟังก์ชัน[00287] ถูกผลของแอนตี้ที่ผูก CD47 บนพีพีตรวจสอบ รักษาลิงไซโนมอลกัส มีปริมาณของแอนติบอดีเป็นของย่อย IgG1 ที่ binds ไป CD47 เดียวส่งผลให้เกิดการลดลงของสำคัญของเกล็ดเลือดที่ทั้งหมดปริมาณทดสอบ (10, 30, 100 mg/kg) (รูปที่ 12C-D), เปรียบเทียบการลดลงของไม่สำคัญของเกล็ดเลือดเมื่อรถ ให้ (รูปที่ 12A-B) ดังนั้น แอนตี้ของย่อย IgG1 ที่ผูก CD47 สามารถส่งผลในการลดลงของเกล็ดเลือดใน Fc-ขึ้นอยู่กับลักษณะของ[00288] เพื่อกำหนดว่า ย่อยที่แตกต่างของแอนติบอดียังทำให้เกิดเกล็ดเลือดการลดลงของ ทดลองถูกทำซ้ำกับแอนติบอดี CD47 ของระดับชั้นย่อย IgG4 ที่ ที่ระดับชั้นย่อย IgG4 ของแอนติบอดีที่ binds CD47 (IgG4P มีการกลายพันธุ์ S228P ภูมิภาคบานพับของแอนติบอดีที่อยู่ดี) ยังมีผลในการลดลงของเกล็ดเลือดที่ความเข้มข้นทั้งหมด ทดสอบ แม้ว่าการศึกษาน้อยกว่าเมื่อเทียบกับรุ่นย่อย IgG1 (รูป E-F) ถัดไป ฟอร์ม mutant ของย่อย IgG4 ของแอนติบอดีต่อต้าน-CD47 (IgG4PE การกลายพันธุ์ S228P เป็นการกลายพันธุ์ L235E ลด FcyR ผูก) ได้รับการทดสอบสำหรับพีพี (รูป 12G-H) จู่ ๆ แอนติบอดี IgG4PE ไม่ได้ผลในการลดลงของเกล็ดเลือดได้มากปริมาณสูง (100 mg/kg) ดังนั้น การ CD47 ผูกแอนติบอดีกับผูกและ effector ผลในพีพี FcyR ลดลงอย่างรุนแรง ตัวอย่างที่ 13: เม็ดเลือดแดง (RBC) พึ่งการแอนตี้ CD47[00289] Weiskopf et al พบว่า แอนติบอดี CD47 ซึ่งผูกเมาส์ CD47 หรือแอฟฟินิตี้การพัฒนา SIRPa-Fc ฟิวชั่นโปรตีนเมื่อมีให้กับหนูและ / หรือ ลิงไซโนมอลกัส สูญเสียเม็ดเลือดแดง และภาวะโลหิตจางได้ดำเนินการ (ดู Weiskopf et al. วิศวกรรมย่อย SIRPa เป็น Immunotherapeutic Adjuvants เพื่อแอนตี้ Anticancer วิทยาศาสตร์ 2013 341:88) ก่อนการประดิษฐ์นำเสนอนี้ ทั้งหมดรู้จัก CD47 ผูกโมเลกุล (เช่น CD47 แอนตี้และ recombinant โปรตีนฟิวชั่น SIRPa-Fc) ที่บล็อก SIRPa และประกอบด้วยโดเมนเป็น Fc ยังเกิดจากดีดีของ RBC[00290] ทดลองได้ดำเนินการเพื่อกำหนดผลของการ SIRPa บล็อก hemagglutinating ไม่ใช่ CD47 ที่แอนตี้ของการประดิษฐ์บนรีรีในสัตว์ทดลอง จู่ ๆ hemagglutinating ไม่ใช่ CD47 ที่แอนตี้ของการประดิษฐ์ไม่ก่อให้เกิด รีรีอย่างมีนัยสำคัญหลังจากการให้ เฉพาะ การ IgG4-P และ IgG4-87 PE ย่อยของแอนติบอดี AB06.12 ได้รับการไซโนมอลกัสลิงที่ปริมาณ 10, 30 และ 100 มิลลิกรัม/กิโลกรัมผ่านคอนกรีตฉีด ลิงสามถูกใช้ต่อกลุ่มยาสำหรับแต่ละแอนติบอดี ตรวจนับเม็ดเลือดแดงถูกตรวจสอบช่วงเวลา และเปรียบเทียบกับรถถือว่าลิง รูปที่ 13 แสดงให้เห็นจำนวน RBC เฉลี่ยจากแอนติบอดีถือว่าลิง ตามปกติในการนับจำนวน RBC เฉลี่ยของรถถือว่าลิง RBC ไม่ดีดีของสำคัญในลิงถือว่าแอนติบอดีถูกสังเกตเปรียบเทียบกับรถที่ถือว่า สัตว์ เห็นว่า ไม่ใช่ hemagglutinating CD47 สามารถให้ ในปริมาณสูง และไม่ มี inducing amenia ในเป้าหมาย

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ตัวอย่างที่ 12: ผลของไอโซไทป์และไอโซไทป์กลายพันธุ์บนพีพี
[00286] ฟังก์ชั่นขึ้นอยู่กับ Fc หลักของแอนติบอดี (เช่นแอนติบอดี CD47) สำหรับการขจัดเซลล์เป้าหมายที่มีส่วนประกอบเป็นพิษขึ้นอยู่กับ (CDC)
ที่ริเริ่มโดยมีผลผูกพันClq ในภูมิภาค Fc; แอนติบอดีขึ้นอยู่กับความเป็นพิษ (ADCC) ไกล่เกลี่ยโดยการทำงานร่วมกันของภูมิภาค Fc กับตัวรับชอบกล (ที่ FcyRs) FcyRIIIa
หลักในการภูมิคุ้มกันเซลล์effector (เช่นเซลล์ NK และ Neutrophils); และขึ้นอยู่กับโทรศัพท์มือถือแอนติบอดี้เซลล์ทำลาย (ADCP) ซึ่งจะดำเนินการโดยมาโครฟาจผ่านการรับรู้ของเซลล์เป้าหมาย opsinized ผ่าน FcyRI
subclasses แอนติบอดีมีความแตกต่างในความสามารถของพวกเขาไป86 ไกล่เกลี่ยกิจกรรม effector Fc ขึ้นอยู่กับ ในมนุษย์ IgG1 และ subclasses IgG3 มีความแรงสูงสำหรับ CDC เนื่องจากการมีผลผูกพัน Clq นอกจากนี้รอง IgG1 มีสูงสุดแอฟฟินิตี้สำหรับ FcyRs และจึงมีศักยภาพมากที่สุดในแง่ของ ADCC และ Fc ขึ้นอยู่กับADCP รอง IgG4 ไร้ความสามารถ Clq ผูกพันและได้ลดลงอย่างมาก FcyR แอฟฟินิตี้ยึดเกาะและจึงลดลงอย่างมีนัยสำคัญได้ฟังก์ชั่น effector. [00287] ผลของแอนติบอดีที่ผูก CD47 บนพีพีที่ได้รับการตรวจสอบ การรักษาของไซโนมอลกัสลิงที่มีขนาดเดียวของแอนติบอดีของรอง IgG1 ที่ผูกกับ CD47 ส่งผลให้เกิดการสูญเสียที่สำคัญของเกล็ดเลือดในปริมาณที่ทดสอบทั้งหมด (10, 30, 100 mg / kg) (รูปที่ 12C-D ) เมื่อเทียบกับไม่มีการสูญเสียที่สำคัญของเกล็ดเลือดเมื่อรถให้เป็น (รูปที่ 12A-B) ดังนั้นแอนติบอดีของรอง IgG1 ที่ผูก CD47 สามารถทำให้เกิดการสูญเสียของเกล็ดเลือดในลักษณะ Fc ขึ้นอยู่กับ. [00288] การตรวจสอบไม่ว่าจะเป็นคลาสที่แตกต่างกันของแอนติบอดียังทำให้เกล็ดเลือดพร่องทดลองซ้ำกับแอนติบอดีCD47 ของ รอง IgG4 รอง IgG4 แอนติบอดีที่ผูก CD47 (IgG4P มีการกลายพันธุ์ S228P เพื่อรักษาเสถียรภาพในภูมิภาคบานพับของแอนติบอดีที่) นอกจากนี้ยังส่งผลให้เกิดการสูญเสียของเกล็ดเลือดที่ความเข้มข้นทุกการทดสอบแม้ว่าในระดับน้อยเมื่อเทียบกับรุ่นรองIgG1 (รูปที่ EF) . ถัดไปเป็นรูปแบบของการกลายพันธุ์รอง IgG4 แอนติบอดีต่อต้าน CD47 (IgG4PE กับการกลายพันธุ์ S228P เช่นเดียวกับการกลายพันธุ์ L235E เพื่อลด FcyR ผูกพัน) ได้รับการทดสอบสำหรับพีพี(รูป 12G-H) น่าแปลกที่แอนติบอดี IgG4PE ไม่ได้ผลในการสูญเสียของเกล็ดเลือดแม้ที่สูงมาก (100 มก. / กก.) ปริมาณ ดังนั้น CD47 แอนติบอดีที่มีผลผูกพันกับลดลงอย่างรุนแรง FcyR ผูกพันและฟังก์ชั่น effector ไม่ได้ผลในพีพี. ตัวอย่าง 13: เซลล์เม็ดเลือดแดง (RBC) กิจกรรมบรรยากาศของแอนติบอดี CD47 [00289] Weiskopf et al, พบว่าเมื่อแอนติบอดี CD47 ที่ถูกผูกไว้ เมาส์ CD47 หรือแอฟฟินิตี้พัฒนา Sirpa-Fc โปรตีนเป็นฟิวชั่นให้หนูและ / หรือไซโนมอลลิงกัส, การสูญเสียเซลล์เม็ดเลือดแดงและภาวะโลหิตจางถูกตั้งข้อสังเกต (ดู Weiskopf et al, วิศวกรรม Sirpa สายพันธุ์เป็น immunotherapeutic Adjuvants การต้านมะเร็งแอนติบอดี; วิทยาศาสตร์ 2013; 341:. 88) ก่อนที่จะมีการประดิษฐ์ที่นำเสนอในที่นี้ทั้งหมดที่รู้จักกัน CD47 ผูกพันโมเลกุล (เช่นแอนติบอดี CD47 และ recombinant Sirpa-Fc โปรตีนฟิวชั่น) ที่บล็อก Sirpa และมีโดเมน Fc ชักนำยังดีดีของ RBC. [00290] การทดลองได้ดำเนินการเพื่อตรวจสอบ ผลกระทบจากการปิดกั้น Sirpa แอนติบอดีที่ไม่ hemagglutinating CD47 ของการประดิษฐ์ในรีรีในร่างกาย น่าแปลกที่แอนติบอดี้ที่ไม่ hemagglutinating CD47 ของการประดิษฐ์ไม่ก่อให้เกิดรีรีอย่างมีนัยสำคัญหลังจากการให้ โดยเฉพาะ IgG4-P และ IgG4- 87 สายพันธุ์ PE ของแอนติบอดี AB06.12 ถูกมอบให้กับไซโนมอลกัสลิงในขนาด 10, 30, และ 100 มิลลิกรัม / กิโลกรัมผ่านฉีดเข้าเส้นเลือดดำ ลิงสามถูกนำมาใช้ต่อกลุ่มยาสำหรับแต่ละแอนติบอดี จำนวนเซลล์เม็ดเลือดแดงถูกตรวจสอบเมื่อเวลาผ่านไปและเมื่อเทียบกับรถได้รับการรักษาลิง รูปที่ 13 แสดงให้เห็นถึงความหมาย RBC นับจากลิงแอนติบอดีรับการรักษาปกติหมายถึงการนับRBC ของลิงยานพาหนะที่ได้รับ ไม่ดีอย่างมีนัยสำคัญดีของ RBC ในลิงได้รับการรักษาแอนติบอดีพบว่าเมื่อเทียบกับรถได้รับการรักษาสัตว์ที่แสดงให้เห็นว่าCD47 ที่ไม่ hemagglutinating ที่สามารถให้ในปริมาณที่สูงและไม่มีการกระตุ้นให้เกิด Amenia ในเป้าหมาย

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ตัวอย่าง 12 : ผลของไอโซไทป์ และไอโซไทป์การกลายพันธุ์ในพีพี
[ 00286 ] FC หลักขึ้นอยู่กับการทำงานของแอนติบอดี ( ได้แก่ cd47 แอนติบอดี ) สำหรับการขจัดเซลล์เป้าหมายจะเติมเต็มอุปการะเซลล์ ( CDC ) ริเริ่มโดย
ผูก clq กับ เอฟซี ตามภูมิภาค แอนติบอดีต่อ ( adcc ) ) โดยการปฏิสัมพันธ์ของ ชลบุรี เอฟซี ภูมิภาคกับเฟย์ ตัวรับ ( fcyrs )fcyriiia หลักในเซลล์ภูมิคุ้มกัน
( ( เช่น เซลล์ NK และ นิวโทรฟิล ) และแอนติบอดีขึ้นอยู่กับเซลล์ฟาโกไซโตซิส (
adcp ) ซึ่งดำเนินการโดยมาโครฟาจผ่านการรับรู้ของ opsinized เซลล์เป้าหมายผ่าน fcyri . แอนติบอดีย่อยมีความแตกต่างในความสามารถ

.






เป็น FC ) ( กิจกรรมในมนุษย์ ( igg3 คลาสและมีศักยภาพสูงสำหรับ CDC เนื่องจากผูกพัน clq . นอกจากนี้รอง ( มีแอฟฟินิตี้สูงสุด fcyrs และงบส่วนใหญ่มีศักยภาพในแง่ของ adcc และ FC ขึ้น
adcp .การไร้ความสามารถในการซับเล็กน้อย คือ clq และได้ลดลงอย่างมาก fcyr แอฟฟินิตี้ยึดเกาะและจึงได้ลดลงอย่างมีนัยสำคัญ ( ฟังก์ชัน 00287
[ ] ผลของแอนติบอดีที่ผูก cd47 บนพีพีคือ
สอบสวนการรักษาของลิงไซโนมอลกัสด้วยฤทธิ์ของแอนติบอดีของ ( subclass ที่ผูกกับ cd47 ส่งผลให้เกิดการสำคัญของเกล็ดเลือดที่ได้รับการทดสอบทั้งหมด ( 10 , 30 , 100 มก. / กก. ) ( รูปที่ 12c-d ) เมื่อเทียบกับการไม่สําคัญของเกล็ดเลือดเมื่อรถถูกให้ ( รูป 12a-b ) ดังนั้นแอนติบอดีของ ( subclass ที่มัด cd47 สามารถส่งผลในการสูญเสียของเกล็ดเลือดใน ชลบุรี เอฟซี ขึ้นอยู่กับลักษณะ 00288
[ ] เพื่อตรวจสอบว่า subclass ที่แตกต่างกันของแอนติบอดียังทำให้เกิดเกล็ดเลือด
พร่องและทำการทดลองซ้ำ กับ cd47 แอนติบอดีของเล็กน้อยซับ .
เล็กน้อย subclass ของแอนติบอดีที่ผูก ( igg4p cd47 ,กับการกลายพันธุ์ s228p ทรงบานพับภูมิภาคของแอนติบอดี ) ยังก่อให้เกิดการพร่องของเกล็ดเลือดที่เข้มข้น
ทดสอบ แม้ว่าในระดับน้อย ( เมื่อเทียบกับรุ่นรอง ( รูป e-f ) ต่อไปเป็นรูปที่กลายพันธุ์ของเล็กน้อย anti-cd47 subclass ของแอนติบอดี ( igg4pe ที่มีการกลายพันธุ์ s228p รวมทั้งการกลายพันธุ์ l235e ลด fcyr ผูกพัน ) คือการทดสอบพีพี