Cloning and heterologous expression

Cloning and heterologous expression
Degenerate primers, which were designed according to conserved
protein sequences of known plant PR-1 proteins (NCBI Gen-
Bank), were used for amplification of a fragmental cDNA sequence.
Cloning the 50- and 30-end of N. mirabilis PR-1 (NmPR-1) cDNA was
accomplished by rapid amplification of cDNA ends (RACE PCR)
using total RNA and the FirstChoice RLM-RACE Kit (Applied Biosystems/
Ambion, Darmstadt, Germany) guided by the manufacturer’s
protocol. Primers were designed by using DNASTAR
Lasergene Software (GATC BIOTECH, Konstanz, Germany). The
resulting amplified products were cloned into a pCR4-TOPO-
vector, and the resulting plasmid was subjected to nucleotide
sequencing (Eurofins MWG Operon, Ebersberg, Germany). The
complete NmPR-1 cDNA sequence was amplified by PCR using
Pfu DNA Polymerase (Fermentas, St. Leon-Rot, Germany), and the
primers: forward 50-CCAAATGGCTTTTTCCAACTC-30 and reverse
50-TCAGGTCACATAACAAGACATGAA-30 (PCR-protocol: 0.5 min at
98 C; 35 cycles of 10 s at 98 C, 15 s at 66 C, 15 min at 72 C;
and 5 min at 72 C).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

โคลน และ heterologous นิพจน์อนุรักษ์ไพรเมอร์ degenerate ซึ่งถูกออกแบบมาตามลำดับโปรตีนโปรตีนพืชรู้จัก PR 1 NCBI Gen (-ธนาคาร), ใช้สำหรับขยายลำดับ fragmental cDNA50 - และ 30-สิ้น N. mirabilis PR-1 (NmPR 1) cDNA โคลนถูกทำได้ โดยการขยายอย่างรวดเร็วของ cDNA ปลาย (PCR การแข่งขัน)ใช้ RNA รวมและชุดการแข่งขัน RLM FirstChoice (ใช้ศาสตร์เชิงชีวภาพ /Ambion ดาร์มสตัดท์ เยอรมนี) นำ โดยผู้ผลิตโพรโทคอ ออกแบบไพรเมอร์ โดยใช้ DNASTARซอฟต์แวร์ Lasergene (ไบโอเทค GATC คอน เยอรมนี) การผลิตภัณฑ์ขยายผลถูกโคลนในการ pCR4 - ภูมิประเทศ-เวกเตอร์ และ plasmid เป็นผลลัพธ์ได้ภายใต้การนิวคลีโอไทด์ลำดับ (Eurofins MWG Operon อันดับ เยอรมนี) การลำดับ cDNA NmPR 1 สมบูรณ์ถูกขยาย โดย PCR โดยใช้Pfu ดีเอ็นเอพอลิเมอเรส (Fermentas, St. Leon Rot เยอรมนี), และไพรเมอร์: 50-CCAAATGGCTTTTTCCAACTC-30 ไปข้างหน้า และย้อนกลับ50-TCAGGTCACATAACAAGACATGAA-30 (PCR-โพรโทคอล: 0.5 นาทีที่98 C รอบ 35 10 s ที่ 98 C, 15 วินาทีที่ 66 C, 15 นาทีที่ 72 Cและ 5 นาทีที่ 72 C)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การโคลนและการแสดงออกของ heterologous
เลวไพรเมอร์ซึ่งได้รับการออกแบบตามอนุรักษ์
ลำดับโปรตีนของพืชที่รู้จักกัน PR-1 โปรตีน (NCBI Gen-
ธนาคาร) ถูกนำมาใช้สำหรับการขยายลำดับ fragmental cDNA
โคลน 50- และ 30-end N. mirabilis PR-1 (NMPR-1) ยีนได้รับการ
ประสบความสำเร็จโดยการขยายตัวอย่างรวดเร็วของยีนปลาย (แข่ง PCR)
โดยใช้อาร์เอ็นเอและรวม FirstChoice? ชุดแข่งอาร์แอล (Applied Biosystems /
Ambion, Darmstadt, เยอรมนี) ได้รับคำแนะนำจากผู้ผลิต
โพรโทคอ ไพรเมอร์ได้รับการออกแบบโดยใช้ DNASTAR
Lasergene? ซอฟแวร์ (GATC ชีวภาพ Konstanz, เยอรมนี)
ผลิตภัณฑ์ขยายผลให้ถูกโคลนเป็น pCR4 -TOPO? -
เวกเตอร์
และพลาสมิดที่เกิดได้ภายใต้การ nucleotide ลำดับ (Eurofins MWG Operon, Ebersberg, เยอรมนี)
สมบูรณ์ NMPR-1 cDNA ลำดับถูกขยายโดยใช้วิธี PCR
Pfu DNA Polymerase (Fermentas เซนต์ Leon-Rot เยอรมนี) และ
ไพรเมอร์: ไปข้างหน้า 50 CCAAATGGCTTTTTCCAACTC-30 และย้อนกลับ
50 TCAGGTCACATAACAAGACATGAA-30 (PCR โปรโตคอล: 0.5 นาทีที่
98 C; 35 รอบของ 10 วินาทีที่ 98 C, 15 วินาทีที่ 66 C, 15 นาทีที่ 72 C;?
? และ 5 นาทีที่ 72 C) 35 รอบของ 10 วินาทีที่ 98 C, 15 วินาทีที่ 66 C, 15 นาทีที่ 72 C?; และ 5 นาทีที่ 72? C) 35 รอบของ 10 วินาทีที่ 98 C, 15 วินาทีที่ 66 C, 15 นาทีที่ 72 C?; และ 5 นาทีที่ 72? C)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การโคลนและการแสดงออกด้วยตัวเองเสื่อมสภาพ ไพรเมอร์ที่ออกแบบตามปีลำดับของโปรตีนที่รู้จักกัน pr-1 โปรตีน ( ncbi Gen - โรงงานธนาคาร ) , ถูกใช้เพื่อขยายของลำดับยีน fragmental .การโคลนและ 50 - 30 ปลายเอ็น มิราบิลิส pr-1 ( nmpr-1 ) ยีน คือได้ โดยการเพิ่มอย่างรวดเร็วของ cDNA Ends ( PCR การแข่งขัน )ใช้อาร์เอ็นเอทั้งหมดและเฟิรส์ช้อยส์ rlm-race Kit ( Applied Biosystems /ambion ดาร์มสตัดท์ , เยอรมนี ) , แนะนำของผู้ผลิตโปรโตคอล ไพรเมอร์ที่ออกแบบโดยการใช้ dnastarซอฟต์แวร์ lasergene ( gatc ชีวภาพ Konstanz , เยอรมนี ) ที่ผลของผลิตภัณฑ์ที่ถูกโคลนเข้าไปใน pcr4 สถานที่เวกเตอร์ และผลของพลาสมิดที่ถูกยัดเยียดให้นิวคลีโอไทด์ลำดับ ( eurofins mwg โอเปอรอน ebersberg , เยอรมนี ) ที่สมบูรณ์ nmpr-1 cDNA ถูกขยายโดยวิธี PCR โดยใช้ลำดับดีเอ็นเอพอลิเมอเรสพีเอฟยู ( fermentas เซนต์ลีออนเน่า , เยอรมัน ) , และโดย : ไปข้างหน้าและย้อนกลับ 50-ccaaatggctttttccaactc-3050-tcaggtcacataacaagacatgaa-30 ( PCR ) : 0.5 นาทีที่98 C ; 35 รอบ 10 ที่ 98 C 15 s ที่ 66 องศาเซลเซียส 15 นาทีที่ 72 C ;และ 5 นาทีที่ 72 C )