Fig. 1.Transient co-expression of e

Fig. 1.Transient co-expression of endosomal markers Ara6-GFP (a) with DsRed-FYVE (b) in onion epidermal bulb scale
cells. Simultaneous two-channel confocal imaging revealed
that these two fusion proteins co-localize in several smaller
compartments while a few larger FYVE-labeled compartments
are not positive for Ara6 (c). Transient co-expression of eYFPRabF2a (d) and DsRed-FYVE (e) in epidermal bulb scale cells
showed a complete co-localization of both markers (f). To
confirm the endosomal nature of the FYVE-labeled compartments, we applied endocytic tracer FM4-64 on transgenicM.
truncatula roots expressing the double GFP-FYVE construct.
After 5 min of exposure to FM4-64, FYVE-labeled endosomes
(g) were enriched also with FM4-64 (h), as evidenced also by
the two-channel image (i). Yellow arrowheads indicate colocalization between Ara6 and FYVE (a–c), as well as between
FM4-64 and FYVE (i). Bars¼10mm
al., 2001). Therefore, we were interested to know if the
tandem FYVE domain would be sufficient for targeting
to endocytic compartments in plants. To this end, the
FYVE domain from the mouse Hrs protein was
tandemly fused (Gillooly et al., 2000) to the C-terminus
of GFP or DsRedT4, respectively. Particle bombardment was employed to transiently express the fusion
proteins (GFP-FYVE; DsRed-FYVE) in onion epidermal bulb scale cells. Confocal imaging revealed fluorescently labeled motile organelles, which were positive also
for the endosome-specific plant Rab GTPases Ara6 and
RabF2a, when pDsRed-FYVE and Ara6-GFP or YFPRabF2a were transiently coexpressed. In the case of
Ara6 and FYVE, the merged images showed a colocalization between the two fusion proteins in small
and punctate, motile organelles (Fig. 1, yellow arrowheads in c), but not in larger static organelles, which
were binding the GFP-FYVE reporter exclusively
(Fig. 1c, red arrowheads). Coexpression of pDsRedFYVE and pYFP-RabF2a also showed complete colocalization within small motile organelles (Fig. 1d–f;
see also Movie 1; all 24 movies are part of the
supplementary material).
Previously, Ara6-labeled compartments have been
shown to accumulate newly endocytosed FM4-64 (Ueda
et al., 2001). To determine, whether FYVE-labeled
compartments have endosomal identity, we performed
double labeling by treating the stably transformed
M. truncatulaexpressing GFP-FYVE with the red fluorescent styryl dye FM4-64. This endocytic tracer binds
to the plasma membrane and becomes rapidly incorporated into the cell through bulk-flow endocytosis (Ueda
et al., 2001). Upon the exposure of root hairs to FM4-64
for 5 min, a fluorescent signal was observed on all
FYVE-labeled endosomes (Fig. 1g–i; Movie 2).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

Fig. 1.ชั่วคราวร่วมค่าของ endosomal เครื่องหมาย Ara6 GFP (ก) กับ DsRed-FYVE (บี) ในมาตราส่วนหลอด epidermal หอมเซลล์ พร้อมกัน 2 ช่อง confocal ภาพเปิดเผยว่า โปรตีนเหล่านี้ผสมผสานสองร่วมแปลในขนาดเล็กช่องในขณะที่บางช่อง FYVE ชื่อใหญ่ไม่บวกสำหรับ Ara6 (c) นิพจน์แบบฉับพลันร่วม (d) eYFPRabF2a และ DsRed-FYVE (e) ในเซลล์ขนาดหลอด epidermalแสดงให้เห็นว่าการแปลร่วมทำเครื่องหมายทั้งสอง (f) ถึงยืนยันลักษณะ endosomal ของช่องชื่อ FYVE เราใช้ endocytic ติดตาม FM4 64 transgenicMtruncatula รากกำลังสอง GFP FYVE สร้างหลังจาก 5 นาทีของการสัมผัสกับ FM4-64 ป้าย FYVE endosomes(g) อุดมไปยัง ด้วย FM4-64 (h), ตามที่เป็นหลักฐานโดยยังรูปสองแชนเนล (i) Colocalization ระหว่าง Ara6 และ FYVE (a-c), เช่นเป็นระหว่างบ่งชี้หัวลูกศรสีเหลืองFM4 64 และ FYVE (i) Bars¼10mmal., 2001) ดังนั้น เราก็สนใจที่จะทราบว่าการโด FYVE ตัวตามกันไปจะเพียงพอสำหรับการกำหนดเป้าหมายช่อง endocytic ไปในพืช เพื่อการนี้ การมีโดเมน FYVE จากเมาส์โปรตีนน.fused (Gillooly et al., 2000) กับ C-นัส tandemlyGFP หรือ DsRedT4 ตามลำดับ การระดมยิงอนุภาคถูกจ้าง transiently แสดงการฟิวชั่นโปรตีน (GFP-FYVE DsRed-FYVE) ในเซลล์ขนาดหลอด epidermal หอม Organelles motile ซึ่งได้บวกยังติดป้ายภาพ confocal เปิดเผย fluorescentlyสำหรับเอนโดโซมพืช Rab GTPases Ara6 และRabF2a เมื่อ pDsRed FYVE และ Ara6 GFP หรือ YFPRabF2a ได้ transiently coexpressed ในกรณีของAra6 และ FYVE, colocalization ระหว่างโปรตีนสองฟิวชั่นในขนาดเล็กแสดงให้เห็นภาพรวมและ punctate, motile organelles (Fig. 1 หัวลูกศรสีเหลืองใน c), แต่ organelles ใหญ่คงไม่ได้อยู่ใน ที่ถูกผูกโปรแกรมรายงาน GFP FYVE โดยเฉพาะ(Fig. 1c แดงหัวลูกศร) Coexpression pDsRedFYVE และ pYFP-RabF2a ยังพบ colocalization เสร็จสมบูรณ์ภายในเล็ก organelles motile (Fig. 1d-fดูภาพยนตร์ 1 ภาพยนตร์ทั้งหมด 24 เป็นส่วนหนึ่งของการเสริมวัสดุ)ก่อนหน้านี้ Ara6 ชื่อช่องได้แสดงการสะสมใหม่ endocytosed FM4-64 (ดะและ al., 2001) การตรวจสอบ ว่าชื่อ FYVEช่องที่มีรหัสประจำตัว endosomal เราทำติดฉลากคู่ โดยรักษาแปร stablyม. truncatulaexpressing GFP FYVE กับย้อมฟลูออเรส styryl แดง FM4 64 ติดตามนี้ endocytic bindsการพลาสมาเมมเบรน และจะรวมอยู่ในเซลล์ผ่านขั้นตอนจำนวนมาก endocytosis (ดะอย่างรวดเร็วและ al., 2001) เมื่อความเสี่ยงของเส้นขนราก FM4 64สำหรับ 5 นาที สัญญาณฟลูออเรสถูกสังเกตในทั้งหมดชื่อ FYVE endosomes (Fig. 1g-i ภาพยนตร์ 2)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

มะเดื่อ 1.Transient ร่วมแสดงออกของเครื่องหมาย endosomal Ara6-GFP (ก) กับ DsRed-FYVE (ข) ในระดับหลอดหอมผิวหนัง
เซลล์ พร้อมกันสองช่องการถ่ายภาพ confocal เปิดเผย
ว่าทั้งสองโปรตีนร่วม จำกัด วงในขนาดเล็กหลาย
ช่องในขณะที่ไม่กี่ขนาดใหญ่ช่อง FYVE ติดฉลาก
ไม่ได้ในเชิงบวกสำหรับ Ara6 (c) Transient ร่วมแสดงออกของ eYFPRabF2a (ง) และ DsRed-FYVE (จ) ในเซลล์ผิวหนังขนาดหลอดไฟ
แสดงให้เห็นว่าผู้ร่วมการแปลที่สมบูรณ์ของทั้งสองเครื่องหมาย (ฉ) เพื่อ
ยืนยันธรรมชาติ endosomal ของช่อง FYVE ป้ายเราใช้ FM4-64 รอย endocytic ใน transgenicM.
ราก truncatula แสดงคู่ GFP-FYVE สร้าง.
หลังจาก 5 นาทีของการสัมผัสกับ FM4-64, endosomes FYVE ติดฉลาก
(ช) ได้ อุดมด้วย FM4-64 (ซ) เป็นหลักฐานโดย
ภาพสองช่องทาง (i) หี่เหลืองบ่งชี้ colocalization ระหว่าง Ara6 และ FYVE (-C), รวมทั้งระหว่าง
FM4-64 และ FYVE (i) Bars¼10mm
al., 2001) ดังนั้นเราจึงมีความสนใจที่จะทราบว่า
โดเมน FYVE ตีคู่จะเพียงพอสำหรับการกำหนดเป้าหมาย
ไปยังช่อง endocytic ในพืช ด้วยเหตุนี้
โดเมน FYVE จากโปรตีนชั่วโมงเมาส์ถูก
หลอมรวม tandemly (Gillooly et al., 2000) ไปที่ C-ปลายทาง
ของ GFP หรือ DsRedT4 ตามลำดับ การโจมตีของอนุภาคถูกจ้างมาเพื่อแสดงความ transiently ฟิวชั่น
โปรตีน (GFP-FYVE; DsRed-FYVE) ในเซลล์ผิวหนังขนาดหลอดหอม การถ่ายภาพ Confocal เปิดเผยติดป้าย fluorescently organelles เคลื่อนที่ซึ่งยังเป็นบวก
สำหรับโรงงาน endosome เฉพาะกระต่าย GTPases Ara6 และ
RabF2a เมื่อ pDsRed-FYVE และ Ara6-GFP หรือ YFPRabF2a ถูก coexpressed transiently ในกรณีที่
Ara6 และ FYVE, ภาพที่แสดงให้เห็นว่าที่ผสาน colocalization ระหว่างสองโปรตีนในขนาดเล็ก
และ punctate อวัยวะเคลื่อนที่ (รูป. 1, หี่เหลืองในค) แต่ไม่ได้อยู่ใน organelles คงขนาดใหญ่ซึ่ง
ถูกผูกพัน GFP- FYVE นักข่าวเฉพาะ
(รูป. 1c บรรจบสีแดง) Coexpression ของ pDsRedFYVE และ pYFP-RabF2a ยังแสดงให้เห็น colocalization เสร็จสมบูรณ์ภายใน organelles เคลื่อนที่ขนาดเล็ก (รูปที่ 1D-ฉ.
ดูหนัง 1; ทั้งหมด 24 ภาพยนตร์เป็นส่วนหนึ่งของ
วัสดุเสริม).
ก่อนหน้านี้ช่อง Ara6 ป้ายได้รับการ
แสดงที่จะสะสมใหม่ endocytosed FM4-64 (อุเอดะ
et al., 2001) การตรวจสอบไม่ว่าจะ FYVE ป้าย
ช่องมีตัวตน endosomal เราดำเนินการ
ติดฉลากคู่โดยการรักษาเปลี่ยนเสถียร
M. truncatulaexpressing GFP-FYVE กับ styryl เรืองแสงสีแดงสีย้อม FM4-64 ตามรอย endocytic นี้กระหม่อม
จะเมมเบรนพลาสม่าและกลายเป็นนิติบุคคลที่จัดตั้งขึ้นอย่างรวดเร็วในเซลล์ผ่าน endocytosis จำนวนมากไหล (อุเอดะ
et al., 2001) เมื่อสัมผัสของรากขนจะ FM4-64
5 นาทีสัญญาณเรืองแสงได้รับการสังเกตในทุก
endosomes FYVE ป้าย (รูปที่ 1 กรัมฉัน. ภาพยนตร์ 2)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

รูปที่ 1 แสดง Co ชั่วคราวของ endosomal เครื่องหมาย ara6 GFP ( ) กับ dsred fyve ( B ) ในหอมตรงหลอดไฟขนาด
เซลล์ พร้อมกันสองช่องด้วยภาพเปิดเผย
สองเหล่านี้ฟิวชั่นโปรตีน Co จำกัด ในช่องเล็ก
ในขณะที่หลายขนาดใหญ่ไม่กี่ fyve ติดป้ายช่อง
ไม่บวกสำหรับ ara6 ( C )การแสดงออก Co ชั่วคราวของ eyfprabf2a ( D ) และ dsred fyve ( E ) ในระดับเซลล์พบว่าหลอดไฟตรง
จำกัด Co ที่สมบูรณ์ของทั้งสองเครื่องหมาย ( F )

ยืนยันธรรมชาติ endosomal ของ fyve ติดป้ายช่องที่เราใช้ endocytic Tracer fm4-64 บน transgenicm .
ราก truncatula แสดง gfp-fyve คู่สร้าง
หลังจาก 5 นาทีของการ fm4-64 fyve endosomes
, ป้าย( กรัม ) อุดมด้วย fm4-64 ( H ) เป็น evidenced โดย
2 ช่องภาพ ( ฉัน ) หัวลูกศรสีเหลืองแสดง colocalization และระหว่าง ara6 fyve ( ( C ) , รวมทั้งระหว่าง
fm4-64 fyve ( และฉัน ) บาร์¼ 10mm
al . , 2001 ) ดังนั้นเราจึงมีความสนใจที่จะทราบว่าถ้า
ควบคู่ fyve โดเมนจะเพียงพอสำหรับเป้าหมาย
เพื่อ endocytic ช่องในพืช ด้วยเหตุนี้
fyve โดเมนจากชั่วโมงเมาส์
tandemly โปรตีนผสม ( gillooly et al . , 2000 ) เพื่อ c-terminus
ของ GFP หรือ dsredt4 ตามลำดับ เครื่องยิงโดยบุคคลหรือสิ่งที่อยู่ชั่วคราวด่วนฟิวชั่น
โปรตีน ( gfp-fyve ; dsred fyve ) ต้นหอม epidermal หลอดไฟขนาดเซลล์ การถ่ายภาพด้วย fluorescently ป้ายเคลื่อนที่พบออร์แกเนลล์ซึ่งเป็นบวกยัง
สำหรับโครโมโซมเฉพาะโรงงานรับ gtpases ara6 และ
rabf2a เมื่อ pdsred fyve ara6 GFP และหรือ yfprabf2a เป็นบุคคลหรือสิ่งที่อยู่ชั่วคราว coexpressed . ในกรณีของ
ara6 fyve และผสานภาพ , แสดง colocalization ระหว่างสองผสมโปรตีนในเล็ก ๆและอวัยวะ punctate
, มือถือ ( รูปที่ 1 , หัวลูกศรสีเหลืองใน C ) แต่ไม่ใช่อวัยวะคงที่ขนาดใหญ่ซึ่ง
ถูกผูก gfp-fyve นักข่าวโดยเฉพาะ
( ภาพที่ 1c หัวลูกศร , สีแดง ) coexpression ของ pdsredfyve pyfp-rabf2a และยังพบ colocalization เสร็จภายในอวัยวะเคลื่อนที่ขนาดเล็ก ( ภาพ 1D ( F ;
ดูหนัง 1 ; ทั้งหมด 24 ภาพยนตร์เป็นส่วนหนึ่งของวัสดุเสริม

) ก่อนหน้านี้ ara6 ติดป้ายช่องได้รับ
แสดงสะสมใหม่ endocytosed fm4-64 ( อุเอดะ
et al . , 2001 ) เพื่อกําหนดไม่ว่า fyve ป้าย
ช่องมีเอกลักษณ์ endosomal เราปฏิบัติ
คู่ฉลากโดยรักษาแปลง
เสถียรม. truncatulaexpressing gfp-fyve กับสีแดงเรืองแสง styryl ย้อม fm4-64 . ติดตาม endocytic นี้ผูก
กับเยื่อหุ้มเซลล์ และกลายเป็นที่จัดตั้งขึ้นอย่างรวดเร็วในเซลล์ผ่านการไหลของกลุ่มเอนโดไซโทซิส ( อุเอดะ
et al . , 2001 ) เมื่อแสงของรากขน เพื่อ fm4-64
เป็นเวลา 5 นาที สัญญาณฟลูออเรสเซนต์ พบทั้งหมด
fyve ป้าย endosomes ( รูปที่ 1 ) I ; ภาพยนตร์ 2 )