- ข้อความ
- ประวัติศาสตร์
2. Experimental2.1. Materials and c
2. Experimental
2.1. Materials and chemicals
KDML 105 rice bran was obtained from Patum Rice Mill and
Granary Company, Ltd. (Bangkok, Thailand). The samples were
packed in aluminum foil bags and kept at 18 C until use.
Fluorescein, DL-Dithiothreitol (DTT), 2,20-Azobis (2-methylpropionamidine)
dihydrochloride (AAPH) and 6-hydroxy-2,5,7,8-tetrame
thylchroman-2-carboxylic acid (Trolox) were purchased from
Sigma Co. (St. Louis, MO, USA). Bovine serum albumin (BSA) and
papain were purchased from Fluka BioChemika (Buchs,
Switzerland). Trypsin and ProteaseMax were from Promega
Corporation (Madison, WI, USA). All other chemicals used in the
experiments were of analytical grade. Ultra filtration concentrator
units (Vivaspin 20 MWCO: 5000) were from GE Healthcare
Bio-Sciences AB (Uppsala, Sweden).
2.2. Preparation of rice bran protein (RBP)
KDML 105 full-fat rice bran was defatted by extracting twice
with three volumes of hexane. The defatted rice bran was
air-dried overnight in a fume hood, ground and sieved through a
0.5 mm screen.
Free phenolic compounds in defatted rice bran were extracted
by shaking with 80% chilled ethanol (defatted rice bran: 80%
chilled ethanol, 1:5) for 30 min. After centrifugation at 3600g
for 15 min, the supernatant was discarded, and the extraction
was repeated two times (Adom & Liu, 2002). The residue was
air-dried overnight in a fume hood, ground and kept at 20 C until
use.
RBP was fractionated according to the method of Chanput et al.
(2009) with slight modification. The defatted rice bran (10 g) was
first fractionated by extracting with distilled water for 60 min (rice
bran: water, 1:6 w/v), filtered through nylon cloth (100 mesh) and
centrifuged at 10,000g for 30 min at 20 C to obtain the albumin
fraction (AF). The supernatants were pooled and ammonium
sulfate was added at a final concentration of 70%. The resulting
precipitate was collected, washed with distilled water to remove
salt, and concentrated using ultra filtration concentrator units.
The rice bran residue was extracted with 60 mL of 2% NaCl to
recover the globulin fraction (GbF). The residue after extraction
of globulin was further extracted with 0.1 N NaOH to yield the glutelin
fraction (GlF). Then the residue was extracted with 70% ethanol
to obtain the prolamin fraction (PF). To further improve the
yield of the protein fractions, each extraction step was repeated
with 40 mL solution.
AF was dialyzed in water, while GbF and GlF were dialyzed in
50 mM ammonium bicarbonate buffer pH 7.8 for desalting. Then,
they were concentrated using ultra filtration cartridges with a
MWCO of 5000 Da. The concentrated protein fractions were
freeze-dried and stored at 20 C until use. Crude protein content
was determined by Bradford’s method (Bradford, 1976).
2.3. Preparation of rice bran protein hydrolysates (RBPHs)
Aliquots of RBPFs were dispersed in 50 mM ammonium bicarbonate
buffer pH 7.8 to obtain a protein concentration of 0.2%
and hydrolyzed with trypsin either in native or denatured form.
Denatured protein was obtained by adding ProteasMax and DTT
to the protein solution, followed by incubation at 56 C for
20 min, and then chloroacetamide was added (0.55 M), and the
mixture incubated in the dark at room temperature for 15 min
before hydrolysis. For papain hydrolysis, 20 mM phosphate buffer
pH 7.0 was used and the hydrolysis was carried out as described
for trypsin digestion. Hydrolysis was carried out at 37 C for 3 h.
The enzyme was rapidly inactivated by adding TFA to a final concentration
of 0.5%. The mixture was centrifuged at 12,000g for
20 min at 20 C. The supernatant was freeze-dried and kept at
20 C for further studies.
2.4. Determination of antioxidant activity
The antioxidant activity of the samples was examined using the
ORAC assay. ORAC was measured according to the method of Ou,
Hampsch-Woodill & Prior (2001) with slight modifications. The
method measures the antioxidant scavenging activity against peroxyl
radical generated by decomposition of AAPH at 37 C. All
reagents and samples were prepared in 75 mM of potassium phosphate
buffer, pH 7.4. Briefly, 25 lL of buffer solution (blank),
diluted sample solutions, or standards were manually transferred
in triplicate to a 96-well flat bottom polystyrene microplate, followed
by adding 150 lL of 8.16 nM fluorescein solution. The fluorescein
solution and samples were incubated at 37 C for 15 min
directly in a microplate reader (TECAN model Infinite M200), and
25 lL of 153 mM AAPH was added. The mixture was incubated
for 30 s before the initial fluorescence was measured with excitation,
485 nm; emission, 535 nm, and the fluorescence was
recorded at 37 C every min until the reading remained constant.
Trolox solutions (6.25, 12.5, 25 and 50 lM) were used for defining
the standard curve. All reaction mixtures of standards or samples
were prepared in triplicate. The net area under the curve (AUC)
was calculated as;
AUC ¼ 0:5 þ f 1=f 0 þ f i=f 0 þ þf 34=f 0
2.1. Materials and chemicals
KDML 105 rice bran was obtained from Patum Rice Mill and
Granary Company, Ltd. (Bangkok, Thailand). The samples were
packed in aluminum foil bags and kept at 18 C until use.
Fluorescein, DL-Dithiothreitol (DTT), 2,20-Azobis (2-methylpropionamidine)
dihydrochloride (AAPH) and 6-hydroxy-2,5,7,8-tetrame
thylchroman-2-carboxylic acid (Trolox) were purchased from
Sigma Co. (St. Louis, MO, USA). Bovine serum albumin (BSA) and
papain were purchased from Fluka BioChemika (Buchs,
Switzerland). Trypsin and ProteaseMax were from Promega
Corporation (Madison, WI, USA). All other chemicals used in the
experiments were of analytical grade. Ultra filtration concentrator
units (Vivaspin 20 MWCO: 5000) were from GE Healthcare
Bio-Sciences AB (Uppsala, Sweden).
2.2. Preparation of rice bran protein (RBP)
KDML 105 full-fat rice bran was defatted by extracting twice
with three volumes of hexane. The defatted rice bran was
air-dried overnight in a fume hood, ground and sieved through a
0.5 mm screen.
Free phenolic compounds in defatted rice bran were extracted
by shaking with 80% chilled ethanol (defatted rice bran: 80%
chilled ethanol, 1:5) for 30 min. After centrifugation at 3600g
for 15 min, the supernatant was discarded, and the extraction
was repeated two times (Adom & Liu, 2002). The residue was
air-dried overnight in a fume hood, ground and kept at 20 C until
use.
RBP was fractionated according to the method of Chanput et al.
(2009) with slight modification. The defatted rice bran (10 g) was
first fractionated by extracting with distilled water for 60 min (rice
bran: water, 1:6 w/v), filtered through nylon cloth (100 mesh) and
centrifuged at 10,000g for 30 min at 20 C to obtain the albumin
fraction (AF). The supernatants were pooled and ammonium
sulfate was added at a final concentration of 70%. The resulting
precipitate was collected, washed with distilled water to remove
salt, and concentrated using ultra filtration concentrator units.
The rice bran residue was extracted with 60 mL of 2% NaCl to
recover the globulin fraction (GbF). The residue after extraction
of globulin was further extracted with 0.1 N NaOH to yield the glutelin
fraction (GlF). Then the residue was extracted with 70% ethanol
to obtain the prolamin fraction (PF). To further improve the
yield of the protein fractions, each extraction step was repeated
with 40 mL solution.
AF was dialyzed in water, while GbF and GlF were dialyzed in
50 mM ammonium bicarbonate buffer pH 7.8 for desalting. Then,
they were concentrated using ultra filtration cartridges with a
MWCO of 5000 Da. The concentrated protein fractions were
freeze-dried and stored at 20 C until use. Crude protein content
was determined by Bradford’s method (Bradford, 1976).
2.3. Preparation of rice bran protein hydrolysates (RBPHs)
Aliquots of RBPFs were dispersed in 50 mM ammonium bicarbonate
buffer pH 7.8 to obtain a protein concentration of 0.2%
and hydrolyzed with trypsin either in native or denatured form.
Denatured protein was obtained by adding ProteasMax and DTT
to the protein solution, followed by incubation at 56 C for
20 min, and then chloroacetamide was added (0.55 M), and the
mixture incubated in the dark at room temperature for 15 min
before hydrolysis. For papain hydrolysis, 20 mM phosphate buffer
pH 7.0 was used and the hydrolysis was carried out as described
for trypsin digestion. Hydrolysis was carried out at 37 C for 3 h.
The enzyme was rapidly inactivated by adding TFA to a final concentration
of 0.5%. The mixture was centrifuged at 12,000g for
20 min at 20 C. The supernatant was freeze-dried and kept at
20 C for further studies.
2.4. Determination of antioxidant activity
The antioxidant activity of the samples was examined using the
ORAC assay. ORAC was measured according to the method of Ou,
Hampsch-Woodill & Prior (2001) with slight modifications. The
method measures the antioxidant scavenging activity against peroxyl
radical generated by decomposition of AAPH at 37 C. All
reagents and samples were prepared in 75 mM of potassium phosphate
buffer, pH 7.4. Briefly, 25 lL of buffer solution (blank),
diluted sample solutions, or standards were manually transferred
in triplicate to a 96-well flat bottom polystyrene microplate, followed
by adding 150 lL of 8.16 nM fluorescein solution. The fluorescein
solution and samples were incubated at 37 C for 15 min
directly in a microplate reader (TECAN model Infinite M200), and
25 lL of 153 mM AAPH was added. The mixture was incubated
for 30 s before the initial fluorescence was measured with excitation,
485 nm; emission, 535 nm, and the fluorescence was
recorded at 37 C every min until the reading remained constant.
Trolox solutions (6.25, 12.5, 25 and 50 lM) were used for defining
the standard curve. All reaction mixtures of standards or samples
were prepared in triplicate. The net area under the curve (AUC)
was calculated as;
AUC ¼ 0:5 þ f 1=f 0 þ f i=f 0 þ þf 34=f 0
0/5000
2. ทดลอง2.1. วัสดุและสารเคมีรำข้าวมะลิ 105 ได้รับจากโรงสีข้าว Patum และบริษัทแกรนารี (กรุงเทพมหานคร ประเทศไทย) จำกัด ตัวอย่างถูกบรรจุในถุงอลูมิเนียมฟอยล์ และเก็บไว้ที่ 18 C จนถึงใช้Fluorescein, DL-Dithiothreitol (DTT), 2,20-Azobis (2-methylpropionamidine)dihydrochloride (AAPH) และ 6-ไฮดร็อกซี่-2,5,7,8-tetramethylchroman 2 carboxylic กรด (Trolox) ซื้อมาจากบริษัทซิกม่า (St. Louis, MO สหรัฐอเมริกา) วัว serum albumin (บีเอสเอ) และซื้อเอนไซม์ปาเปนจาก Fluka BioChemika (ของฉันสวิตเซอร์แลนด์) ทริปซินและ ProteaseMax มา Promegaคอร์ปอเรชั่น (เมดิสัน WI สหรัฐอเมริกา) สารเคมีอื่น ๆ ที่ใช้ในการการทดลองของเกรดวิเคราะห์ได้ หัวกรองพิเศษหน่วย (Vivaspin 20 MWCO: 5000) จาก GE ดูแลสุขภาพวิทยาศาสตร์ชีวภาพ AB (อุปซาลา สวีเดน)2.2. การเตรียมโปรตีนรำข้าว (RBP)มะลิ 105 รำข้าวไขมันถูก defatted โดยแยกสองครั้งกับไดรฟ์ข้อมูลที่สามของเฮกเซน มีการรำair-dried ค้างคืนในควัน พื้นดิน และแหลกลาญผ่านการหน้าจอของ 0.5 มม.สกัดสารฟีนอฟรีในรำโดยการเขย่าด้วย 80% เอทานอลที่แช่เย็น (defatted รำข้าว: 80%แช่เย็นเอทานอล 1:5) 30 นาที หลังจากหมุนเหวี่ยงที่ 3600 กรัม15 นาที supernatant ถูกทิ้ง และสกัดซ้ำครั้งสองครั้ง (Adom และหลิว 2002) สารถูกair-dried ค้างคืนในควัน พื้นดิน และเก็บไว้ที่ 20 C จนถึงการใช้งานRBP ถูกแบ่งตามวิธีของ Chanput et al(2009) มีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย คือรำข้าวสกัดไขมัน (10 กรัม)ครั้งแรก แบ่ง โดยแยกด้วยน้ำกลั่น 60 นาที (ข้าวรำ: น้ำ 1:6 w/v), กรองผ่านผ้าไนล่อน (100 ตาข่าย) และเหวี่ยงที่ 10,000 g 30 นาทีที่ 20 C รับ albuminเศษส่วน (AF) Supernatants ถูกพู และแอมโมเนียซัลเฟตถูกเพิ่มที่ความเข้มข้นสุดท้าย 70% ผลตะกอนการรวบรวม ล้าง ด้วยน้ำกลั่นเพื่อเอาเกลือ และเข้มข้นใช้กรองพิเศษหัวหน่วยงานกากรำข้าวถูกสกัด ด้วย 60 มล. 2% NaCl ไปกู้คืนเศษส่วนกลอบูลิน (GbF) สารตกค้างหลังจากสกัดของกลถูกเพิ่มเติมแยกมา ด้วย 0.1 N NaOH ให้ผล glutelinเศษส่วน (GlF) แล้ว สารถูกสกัด ด้วยเอทานอล 70%การขอรับเศษ prolamin (PF) เพื่อปรับปรุงการผลผลิตซ้ำแต่ละขั้นตอนการสกัดของเศษโปรตีนด้วยการแก้ไขปัญหามลAF เป็น dialyzed ในน้ำ ในขณะที่ GbF และ GlF ถูก dialyzed ใน50 มม.แอมโมเนียมไบคาร์บอเนตบัฟเฟอร์ pH 7.8 สำหรับกระบวนการกำจัด แล้วพวกเขาก็เข้มข้นใช้ตลับกรองพิเศษด้วยการMWCO ของดา 5000 มีเศษโปรตีนเข้มข้นกรอบ และเก็บไว้ที่ 20 C จนถึงใช้ โปรตีนเนื้อหาถูกกำหนด โดยวิธีการของแบรดฟอร์ด (แบรดฟอร์ด 1976)2.3. เตรียมของ hydrolysates โปรตีนรำข้าว (RBPHs)Aliquots ของ RBPFs ที่กระจายในแอมโมเนียมไบคาร์บอเนต 50 มม.บัฟเฟอร์ pH 7.8 รับโปรตีนเข้มข้น 0.2%และ hydrolyzed กับทริปซินแบบฟอร์มใดในท้องถิ่น หรือเอทิลแอลกอฮอล์เอทิลแอลกอฮอล์โปรตีนที่ได้รับ โดยการเพิ่ม ProteasMax และ DTTการแก้ปัญหาโปรตีน ตาม ด้วยการบ่มที่ 56 C สำหรับ20 นาที และ chloroacetamide เพิ่ม (0.55 M), และส่วนผสมที่ได้รับการกกในมืดที่อุณหภูมิห้อง 15 นาทีก่อนที่จะสลาย สำหรับสลายเอนไซม์ปาเปน บัฟเฟอร์ฟอสเฟต 20 มม.ใช้ pH 7.0 และสลายการดำเนินการตามที่อธิบายไว้สำหรับทริปซินย่อย ย่อยได้ดำเนินการ 37 c เป็นเวลา 3 ชมเอนไซม์ถูกยก โดยการเพิ่มความเข้มข้นสุดท้าย TFA อย่างรวดเร็ว0.5% ส่วนผสมถูกเหวี่ยงที่ 12,000 g สำหรับ20 นาทีที่ 20 c ใน supernatant ชนิดแห้ง และเก็บไว้ที่20 C การศึกษาต่อไป2.4. ความมุ่งมั่นของอนุมูลกิจกรรมการต้านอนุมูลอิสระตัวอย่างถูกตรวจสอบโดยใช้การORAC ทดสอบ ORAC คือวัดตามวิธีการของ OuHampsch-Woodill และก่อน (2001) ด้วยการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย การวิธีวัดสารต้านอนุมูลอิสระ scavenging กิจกรรมกับ peroxylอนุมูลอิสระที่สร้างขึ้น โดยการสลายตัวของ AAPH ที่ 37 C. หมดมีเตรียมตัวอย่างและสารใน 75 มม.ของโพแทสเซียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ ค่า pH 7.4 สั้น ๆ 25 จะของโซลูชันบัฟเฟอร์ (ว่าง),ตัวอย่างที่เจือจาง วิธีการหรือมาตรฐานได้ด้วยตนเองโอนลข้อจะมีด้านล่างแบน 96 ดีสไต microplate ตามโดยการเพิ่ม 150 จะ 8.16 nM fluorescein โซลูชัน การ fluoresceinตัวอย่างและการแก้ไขปัญหาได้รับการกกที่ 37 C 15 นาทีโดยตรงในอ่าน microplate (TECAN รุ่น M200 อนันต์), และ25 จะ 153 มม. AAPH เพิ่มขึ้น ได้รับการกกส่วนผสม30 s ก่อนเรืองแสงเริ่มต้นถูกวัด ด้วยไฟฟ้า485 nm ปล่อย 535 นาโนเมตร และการเรืองแสงบันทึกที่ 37 C ทุกนาทีจนกว่าการอ่านอยู่คงใช้สำหรับกำหนดโซลูชัน Trolox (lM 6.25, 12.5, 25 และ 50)กราฟมาตรฐานการ ส่วนผสมปฏิกิริยาทั้งหมดของมาตรฐานหรือตัวอย่างมีเตรียมลข้อ พื้นที่ใต้เส้นโค้ง (AUC) สุทธิคำนวณเป็นAUC ¼ 0:5 þ f 1 = f f 0 þฉัน = f 0 þ þf 34 = f 0
การแปล กรุณารอสักครู่..
2. การทดลอง
2.1 วัสดุและสารเคมี
ขาวดอกมะลิ 105 รำข้าวที่ได้รับจากปทุมข้าวโรงสีและ
บริษัท ฉาง จำกัด (Bangkok, Thailand) กลุ่มตัวอย่างที่ได้รับการ
บรรจุในถุงอลูมิเนียมฟอยล์และเก็บไว้ที่? 18? C จนถึงการใช้งาน.
Fluorescein, DL-dithiothreitol (DTT) 2,20-Azobis (2 methylpropionamidine)
dihydrochloride (AAPH) และ 6 ไฮดรอกซี-2,5, 7,8-tetrame
thylchroman-2-คาร์บอกซิ Acid (Trolox) ที่ซื้อมาจาก
ซิกม่า จำกัด ( St. Louis, มิสซูรี, สหรัฐอเมริกา) เซรั่มอัลบูมิวัว (BSA) และ
ปาเปนที่ซื้อมาจาก Fluka BioChemika (Buchs,
วิตเซอร์แลนด์) trypsin และ ProteaseMax จาก Promega
คอร์ปอเรชั่น (Madison, WI, USA) สารเคมีอื่น ๆ ทั้งหมดที่ใช้ใน
การทดลองเป็นของเกรดวิเคราะห์ อัลตร้ากรองหัว
หน่วย (20 Vivaspin MWCO: 5000) จาก GE Healthcare
Bio-AB วิทยาศาสตร์ (Uppsala, สวีเดน).
2.2 การเตรียมความพร้อมของโปรตีนรำข้าว (RBP)
ข้าวขาวดอกมะลิ 105 ไขมันเต็มรำข้าวโปรตีนโดยแยกเป็นครั้งที่สอง
กับสามเล่มของเฮกเซน รำสกัดเป็น
อากาศแห้งค้างคืนในตู้ดูดควัน, พื้นดินและร่อนผ่าน
หน้าจอ 0.5 มม.
สารประกอบฟีนอลฟรีในรำสกัดถูกสกัด
โดยการเขย่าด้วย 80% แช่เย็นเอทานอล (รำสกัด: 80%
เอทานอลแช่เย็น 1 : 5) เป็นเวลา 30 นาที หลังจากการหมุนเหวี่ยงที่ 3600? กรัม
เป็นเวลา 15 นาที, สารละลายที่ถูกทิ้งและการสกัด
ซ้ำสองครั้ง (ตบแต่งและหลิว, 2002) ที่เหลือเป็น
อากาศแห้งค้างคืนในควันเครื่องดูดควัน, พื้นดินและเก็บไว้ที่ 20 องศาเซลเซียสจน
การใช้งาน.
RBP ถูก fractionated ตามวิธีการของ Chanput et al,.
(2009) มีการดัดแปลงเล็กน้อย รำสกัด (10 กรัม) คือ
ครั้งแรก fractionated โดยแยกด้วยน้ำกลั่นเป็นเวลา 60 นาที (ข้าว
รำ: น้ำ, 1: 6 w / v) กรองผ่านผ้าไนลอน (100 ตาข่าย) และ
? หมุนเหวี่ยงที่ 10,000 กรัมเป็นเวลา 30 นาที ที่ 20 องศาเซลเซียสเพื่อให้ได้โปรตีนชนิดหนึ่ง
ส่วน (AF) supernatants ถูกรวบรวมและแอมโมเนียม
ซัลเฟตที่ถูกเพิ่มความเข้มข้นสุดท้ายของ 70% ส่งผลให้
ตะกอนที่ถูกเก็บรวบรวม, การล้างด้วยน้ำกลั่นเพื่อเอา
เกลือและเข้มข้นใช้กรองพิเศษหน่วยหัว.
ที่เหลือรำข้าวถูกสกัดด้วย 60 มล NaCl 2% ในการ
กู้คืนส่วน globulin นี้ (GBF) ที่เหลือหลังจากการสกัด
ของผลไม้สกัดต่อไปด้วย 0.1 N NaOH ที่จะให้ผลผลิต glutelin
ส่วน (GLF) แล้วที่เหลือถูกสกัดด้วยเอทานอล 70%
ที่จะได้รับส่วน prolamin นี้ (PF) ที่สามารถปรับปรุง
ผลผลิตของเศษส่วนโปรตีนในแต่ละขั้นตอนการสกัดซ้ำ
กับวิธีการแก้ปัญหา 40 มล.
AF ถูก dialyzed ในน้ำขณะ GBF และ GLF ถูก dialyzed ใน
ขนาด 50 มมแอมโมเนียมไบคาร์บอเนตบัฟเฟอร์ค่า pH 7.8 สำหรับ desalting จากนั้น
พวกเขามีความเข้มข้นโดยใช้ตลับกรองพิเศษที่มี
MWCO 5000 ดา โดยเศษโปรตีนเข้มข้นถูก
แห้งและเก็บไว้ที่ 20 องศาเซลเซียสจนการใช้งาน โปรตีน
ถูกกำหนดโดยวิธีการของ Bradford (แบรด, 1976).
2.3 การเตรียมการของไฮโดรไลเซโปรตีนรำข้าว (RBPHs)
aliquots ของ RBPFs ก็แยกย้ายกันในขนาด 50 มมแอมโมเนียมไบคาร์บอเนต
บัฟเฟอร์ค่า pH 7.8 เพื่อให้ได้ความเข้มข้นของโปรตีน 0.2%
และไฮโดรไลซ์ด้วย trypsin ทั้งในรูปแบบพื้นเมืองหรือเอทิลแอลกอฮอล์.
โปรตีนเอทิลแอลกอฮอล์ที่ได้รับโดยการเพิ่ม ProteasMax และ DTT
เพื่อแก้ปัญหาโปรตีนตามด้วยการบ่มที่ 56 องศาเซลเซียสเป็น
เวลา 20 นาทีและจากนั้น chloroacetamide ถูกเพิ่มเข้ามา (0.55 เมตร) และ
ส่วนผสมบ่มในที่มืดที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 15 นาที
ก่อนที่จะย่อยสลาย สำหรับไฮโดรไลซิปาเปน 20 มิลลิฟอสเฟตบัฟเฟอร์
ค่า pH 7.0 ได้ถูกใช้ในการย่อยสลายและได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้
สำหรับ trypsin การย่อยอาหาร ย่อยสลายได้ดำเนินการที่ 37? C เป็นเวลา 3 ชม.
เอนไซม์ถูกยกเลิกอย่างรวดเร็วโดยการเพิ่ม TFA ความเข้มข้นสุดท้าย
0.5% ส่วนผสมที่ถูกหมุนเหวี่ยงที่ 12,000? G สำหรับ
20 นาทีที่ 20 องศาเซลเซียส ใสถูกแช่แข็งแห้งและเก็บไว้ที่
20 องศาเซลเซียสสำหรับการศึกษาต่อไป.
2.4 ความมุ่งมั่นของสารต้านอนุมูลอิสระ
ต้านอนุมูลอิสระของกลุ่มตัวอย่างถูกตรวจสอบโดยใช้
การทดสอบ ORAC ORAC วัดตามวิธีการของ Ou ที่
Hampsch-Woodill และก่อน (2001) ที่มีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย
วิธีการวัดกิจกรรมการขับสารต้านอนุมูลอิสระกับ peroxyl
รุนแรงที่เกิดจากการสลายตัวของ AAPH ที่ 37 องศาเซลเซียส ทั้งหมด
น้ำยาและตัวอย่างที่ถูกจัดทำขึ้น 75 มิลลิเมตรของโพแทสเซียมฟอสเฟต
บัฟเฟอร์ค่า pH 7.4 สั้น ๆ , 25 LL ของสารละลายบัฟเฟอร์ (ว่าง)
ตัวอย่างการแก้ปัญหาปรับลดหรือมาตรฐานถูกย้ายด้วยตนเอง
ในเพิ่มขึ้นสามเท่ากับไมโครสไตรีนแบน 96 หลุมด้านล่างตาม
ด้วยการเพิ่ม 150 LL ของการแก้ปัญหา 8.16 fluorescein นาโนเมตร fluorescein
วิธีการแก้ปัญหาและตัวอย่างที่ถูกบ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสนาน 15 นาที
โดยตรงในการอ่าน microplate (TECAN รุ่น M200 อินฟินิท) และ
25 LL 153 มิลลิ AAPH ถูกเพิ่มเข้ามา ส่วนผสมที่ถูกบ่ม
เป็นเวลา 30 วินาทีก่อนที่จะเริ่มต้นการเรืองแสงได้รับการวัดที่มีการกระตุ้น
485 นาโนเมตร; ปล่อยก๊าซเรือนกระจก 535 นาโนเมตรและมีการเรืองแสงที่ถูก
บันทึกไว้ที่ 37 องศาเซลเซียสทุกนาทีจนอ่านคง.
โซลูชั่น Trolox (6.25, 12.5, 25 และ 50 LM) ถูกนำมาใช้สำหรับการกำหนด
เส้นโค้งมาตรฐาน ผสมปฏิกิริยาทั้งหมดของมาตรฐานหรือตัวอย่าง
ได้จัดทำขึ้นเพิ่มขึ้นสามเท่า พื้นที่ใต้เส้นโค้งสุทธิ (AUC) เดอะ
ถูกคำนวณเป็น;
AUC ¼ 0: 5 F 1 F = 0 Þ ?? ? Fi f = 0 Th? ? ? THF 34 F = 0
2.1 วัสดุและสารเคมี
ขาวดอกมะลิ 105 รำข้าวที่ได้รับจากปทุมข้าวโรงสีและ
บริษัท ฉาง จำกัด (Bangkok, Thailand) กลุ่มตัวอย่างที่ได้รับการ
บรรจุในถุงอลูมิเนียมฟอยล์และเก็บไว้ที่? 18? C จนถึงการใช้งาน.
Fluorescein, DL-dithiothreitol (DTT) 2,20-Azobis (2 methylpropionamidine)
dihydrochloride (AAPH) และ 6 ไฮดรอกซี-2,5, 7,8-tetrame
thylchroman-2-คาร์บอกซิ Acid (Trolox) ที่ซื้อมาจาก
ซิกม่า จำกัด ( St. Louis, มิสซูรี, สหรัฐอเมริกา) เซรั่มอัลบูมิวัว (BSA) และ
ปาเปนที่ซื้อมาจาก Fluka BioChemika (Buchs,
วิตเซอร์แลนด์) trypsin และ ProteaseMax จาก Promega
คอร์ปอเรชั่น (Madison, WI, USA) สารเคมีอื่น ๆ ทั้งหมดที่ใช้ใน
การทดลองเป็นของเกรดวิเคราะห์ อัลตร้ากรองหัว
หน่วย (20 Vivaspin MWCO: 5000) จาก GE Healthcare
Bio-AB วิทยาศาสตร์ (Uppsala, สวีเดน).
2.2 การเตรียมความพร้อมของโปรตีนรำข้าว (RBP)
ข้าวขาวดอกมะลิ 105 ไขมันเต็มรำข้าวโปรตีนโดยแยกเป็นครั้งที่สอง
กับสามเล่มของเฮกเซน รำสกัดเป็น
อากาศแห้งค้างคืนในตู้ดูดควัน, พื้นดินและร่อนผ่าน
หน้าจอ 0.5 มม.
สารประกอบฟีนอลฟรีในรำสกัดถูกสกัด
โดยการเขย่าด้วย 80% แช่เย็นเอทานอล (รำสกัด: 80%
เอทานอลแช่เย็น 1 : 5) เป็นเวลา 30 นาที หลังจากการหมุนเหวี่ยงที่ 3600? กรัม
เป็นเวลา 15 นาที, สารละลายที่ถูกทิ้งและการสกัด
ซ้ำสองครั้ง (ตบแต่งและหลิว, 2002) ที่เหลือเป็น
อากาศแห้งค้างคืนในควันเครื่องดูดควัน, พื้นดินและเก็บไว้ที่ 20 องศาเซลเซียสจน
การใช้งาน.
RBP ถูก fractionated ตามวิธีการของ Chanput et al,.
(2009) มีการดัดแปลงเล็กน้อย รำสกัด (10 กรัม) คือ
ครั้งแรก fractionated โดยแยกด้วยน้ำกลั่นเป็นเวลา 60 นาที (ข้าว
รำ: น้ำ, 1: 6 w / v) กรองผ่านผ้าไนลอน (100 ตาข่าย) และ
? หมุนเหวี่ยงที่ 10,000 กรัมเป็นเวลา 30 นาที ที่ 20 องศาเซลเซียสเพื่อให้ได้โปรตีนชนิดหนึ่ง
ส่วน (AF) supernatants ถูกรวบรวมและแอมโมเนียม
ซัลเฟตที่ถูกเพิ่มความเข้มข้นสุดท้ายของ 70% ส่งผลให้
ตะกอนที่ถูกเก็บรวบรวม, การล้างด้วยน้ำกลั่นเพื่อเอา
เกลือและเข้มข้นใช้กรองพิเศษหน่วยหัว.
ที่เหลือรำข้าวถูกสกัดด้วย 60 มล NaCl 2% ในการ
กู้คืนส่วน globulin นี้ (GBF) ที่เหลือหลังจากการสกัด
ของผลไม้สกัดต่อไปด้วย 0.1 N NaOH ที่จะให้ผลผลิต glutelin
ส่วน (GLF) แล้วที่เหลือถูกสกัดด้วยเอทานอล 70%
ที่จะได้รับส่วน prolamin นี้ (PF) ที่สามารถปรับปรุง
ผลผลิตของเศษส่วนโปรตีนในแต่ละขั้นตอนการสกัดซ้ำ
กับวิธีการแก้ปัญหา 40 มล.
AF ถูก dialyzed ในน้ำขณะ GBF และ GLF ถูก dialyzed ใน
ขนาด 50 มมแอมโมเนียมไบคาร์บอเนตบัฟเฟอร์ค่า pH 7.8 สำหรับ desalting จากนั้น
พวกเขามีความเข้มข้นโดยใช้ตลับกรองพิเศษที่มี
MWCO 5000 ดา โดยเศษโปรตีนเข้มข้นถูก
แห้งและเก็บไว้ที่ 20 องศาเซลเซียสจนการใช้งาน โปรตีน
ถูกกำหนดโดยวิธีการของ Bradford (แบรด, 1976).
2.3 การเตรียมการของไฮโดรไลเซโปรตีนรำข้าว (RBPHs)
aliquots ของ RBPFs ก็แยกย้ายกันในขนาด 50 มมแอมโมเนียมไบคาร์บอเนต
บัฟเฟอร์ค่า pH 7.8 เพื่อให้ได้ความเข้มข้นของโปรตีน 0.2%
และไฮโดรไลซ์ด้วย trypsin ทั้งในรูปแบบพื้นเมืองหรือเอทิลแอลกอฮอล์.
โปรตีนเอทิลแอลกอฮอล์ที่ได้รับโดยการเพิ่ม ProteasMax และ DTT
เพื่อแก้ปัญหาโปรตีนตามด้วยการบ่มที่ 56 องศาเซลเซียสเป็น
เวลา 20 นาทีและจากนั้น chloroacetamide ถูกเพิ่มเข้ามา (0.55 เมตร) และ
ส่วนผสมบ่มในที่มืดที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 15 นาที
ก่อนที่จะย่อยสลาย สำหรับไฮโดรไลซิปาเปน 20 มิลลิฟอสเฟตบัฟเฟอร์
ค่า pH 7.0 ได้ถูกใช้ในการย่อยสลายและได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้
สำหรับ trypsin การย่อยอาหาร ย่อยสลายได้ดำเนินการที่ 37? C เป็นเวลา 3 ชม.
เอนไซม์ถูกยกเลิกอย่างรวดเร็วโดยการเพิ่ม TFA ความเข้มข้นสุดท้าย
0.5% ส่วนผสมที่ถูกหมุนเหวี่ยงที่ 12,000? G สำหรับ
20 นาทีที่ 20 องศาเซลเซียส ใสถูกแช่แข็งแห้งและเก็บไว้ที่
20 องศาเซลเซียสสำหรับการศึกษาต่อไป.
2.4 ความมุ่งมั่นของสารต้านอนุมูลอิสระ
ต้านอนุมูลอิสระของกลุ่มตัวอย่างถูกตรวจสอบโดยใช้
การทดสอบ ORAC ORAC วัดตามวิธีการของ Ou ที่
Hampsch-Woodill และก่อน (2001) ที่มีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย
วิธีการวัดกิจกรรมการขับสารต้านอนุมูลอิสระกับ peroxyl
รุนแรงที่เกิดจากการสลายตัวของ AAPH ที่ 37 องศาเซลเซียส ทั้งหมด
น้ำยาและตัวอย่างที่ถูกจัดทำขึ้น 75 มิลลิเมตรของโพแทสเซียมฟอสเฟต
บัฟเฟอร์ค่า pH 7.4 สั้น ๆ , 25 LL ของสารละลายบัฟเฟอร์ (ว่าง)
ตัวอย่างการแก้ปัญหาปรับลดหรือมาตรฐานถูกย้ายด้วยตนเอง
ในเพิ่มขึ้นสามเท่ากับไมโครสไตรีนแบน 96 หลุมด้านล่างตาม
ด้วยการเพิ่ม 150 LL ของการแก้ปัญหา 8.16 fluorescein นาโนเมตร fluorescein
วิธีการแก้ปัญหาและตัวอย่างที่ถูกบ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสนาน 15 นาที
โดยตรงในการอ่าน microplate (TECAN รุ่น M200 อินฟินิท) และ
25 LL 153 มิลลิ AAPH ถูกเพิ่มเข้ามา ส่วนผสมที่ถูกบ่ม
เป็นเวลา 30 วินาทีก่อนที่จะเริ่มต้นการเรืองแสงได้รับการวัดที่มีการกระตุ้น
485 นาโนเมตร; ปล่อยก๊าซเรือนกระจก 535 นาโนเมตรและมีการเรืองแสงที่ถูก
บันทึกไว้ที่ 37 องศาเซลเซียสทุกนาทีจนอ่านคง.
โซลูชั่น Trolox (6.25, 12.5, 25 และ 50 LM) ถูกนำมาใช้สำหรับการกำหนด
เส้นโค้งมาตรฐาน ผสมปฏิกิริยาทั้งหมดของมาตรฐานหรือตัวอย่าง
ได้จัดทำขึ้นเพิ่มขึ้นสามเท่า พื้นที่ใต้เส้นโค้งสุทธิ (AUC) เดอะ
ถูกคำนวณเป็น;
AUC ¼ 0: 5 F 1 F = 0 Þ ?? ? Fi f = 0 Th? ? ? THF 34 F = 0
การแปล กรุณารอสักครู่..
2 . ทดลอง2.1 . วัสดุและสารเคมีข้าวขาวดอกมะลิ 105 รำข้าวจากโรงสีและปทุมธานีได้บริษัท นารี จำกัด ( กรุงเทพฯ ) กลุ่มตัวอย่างบรรจุในถุงอะลูมิเนียมฟอยล์และเก็บไว้ที่ 18 องศา จนกว่าจะใช้ี่ , DL บัตรแข็ง ( DTT ) 2,20-azobis ( 2-methylpropionamidine ): ( aaph ) และ 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic แอซิด ( สาร ) ซื้อจากบริษัท ซิกม่า ( St . Louis , MO , USA ) อัลบูมิน ( BSA ) และโดยซื้อจาก fluka ( buchs biochemika ,สวิตเซอร์แลนด์ ) ทริป proteasemax จาก promegaCorporation ( Madison , WI , USA ) สารเคมีที่ใช้ในกระบวนการอื่น ๆจากการทดลองพบว่า การวิเคราะห์ในระดับ หัวอัลตร้าฟิลเตรชั่นหน่วย ( vivaspin 20 mwco : 5000 ) จาก GE Healthcareวิทยาศาสตร์ชีวภาพ AB ( สวีเดนอัปซาลา )2.2 . การเตรียมโปรตีนรำข้าว ( ได้รับ )ข้าวขาวดอกมะลิ 105 รำข้าวไขมันเต็มถูกสกัดโดยการสกัดสองครั้งกับสามเล่มของเฮกเซน . ส่วนรำข้าวคืออากาศแห้งข้ามคืนในตู้ดูดควันขนาดผ่านพื้นดินหน้าจอขนาด 0.5 มม.ฟรีสารประกอบฟีนอลในรำข้าวสกัดโดยการเขย่าด้วย 80% เอทานอลแช่เย็น ( รำข้าว : 80%แช่เย็นเอทานอล , 1 : 5 ) เป็นเวลา 30 นาที หลังการปั่นเหวี่ยงที่ 3600g15 นาที , น่านถูกทิ้ง และการสกัดทำซ้ำ 2 ครั้ง ( adom & หลิว , 2002 ) ที่เหลือคืออากาศแห้งข้ามคืนในตู้ดูดควันและเก็บไว้ที่ 20 C จนถึงพื้นดินใช้ได้รับเป็นลำดับตามวิธีการของ chanput et al .( 2009 ) ที่มีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย ในรำข้าว ( 10 กรัม )ลำดับแรกโดยสกัดด้วยน้ำกลั่นเป็นเวลา 60 นาที ( ข้าวรำข้าว : น้ำ 1 : 6 W / V ) กรองผ่านผ้าไนล่อน ( 100 mesh ) และระดับที่ 10000g สำหรับ 30 นาทีที่ 20 องศาเซลเซียส เพื่อให้ได้โปรตีนอัลบูมินเศษส่วน ( AF ) การ supernatants ถูก pooled และแอมโมเนียมซัลเฟตที่ความเข้มข้นสุดท้ายเพิ่ม 70% ที่เกิดขึ้นการรวบรวม , ล้างด้วยน้ำกลั่นเพื่อลบเกลือ และเข้มข้น ใช้กรองพิเศษหัวหน่วยในน้ำมันรำข้าวสกัดมีกากเกลือ 2 % 60 มล.กู้คืนส่วนที่ gbf ) กากหลังการสกัดของที่ ลดลง 0.1 N NaOH ที่ให้ผลผลิตกลูเทลินเศษส่วน ( GLF ) แล้วที่เหลือถูกสกัดด้วยเอทานอล 70%ที่จะได้รับโพรลามินเศษส่วน ( PF ) เพื่อเพิ่มเติมปรับปรุงผลผลิตของโปรตีนสกัดเศษส่วนแต่ละขั้นตอนซ้ำขนาด 40 ml สารละลายAF คือผ่านน้ำในขณะที่ gbf ) ในกลุ่มที่ผ่านและ50 mm แอมโมเนียมไบคาร์บอเนตบัฟเฟอร์ pH 7.8 สำหรับ desalting . จากนั้นพวกเขามีความเข้มข้นที่ใช้ตลับกรองพิเศษกับmwco 5000 ดา . คือ โปรตีนเข้มข้น เศษส่วนเก็บไว้ที่อุณหภูมิ 20 องศาเซลเซียส จนแห้งใช้ โปรตีนหยาบถูกกำหนดโดยวิธีการของแบรดฟอร์ด ( แบรดฟอร์ด , 1976 )2.3 การเตรียมโปรตีน ( rbphs ) ของน้ำมันรำข้าวเฉยๆของ rbpfs การกระจายตัวในแอมโมเนียมไบคาร์บอเนต 50 มม.บัฟเฟอร์ pH 7.8 เพื่อให้ได้โปรตีนความเข้มข้น 0.2%และย่อยด้วยเอนไซม์ในพื้นเมืองหรือใช้แบบฟอร์มใช้โปรตีนได้ โดยการเพิ่มส่วน proteasmaxกับโปรตีน โซลูชั่น ตามด้วยการบ่มที่ 56 C สำหรับ20 นาที แล้ว chloroacetamide เพิ่ม ( 0.55 เมตร ) และผสมบ่มในที่มืดอุณหภูมิห้องเป็นเวลา 15 นาทีก่อนการย่อยสลาย . สำหรับเอนไซม์ปาเปนไฮโดรฟอสเฟตบัฟเฟอร์ 20 มม.พีเอช 7.0 และย่อยสลายได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้การย่อยอาหารเอนไซม์ . การกระทำที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 3 ชั่วโมงเอนไซม์ถูกยับยั้งโดยการเพิ่มระดับอย่างรวดเร็วเพื่อความเข้มข้นสุดท้าย0.5 % ส่วนผสมที่ 12000g ไฟฟ้าสำหรับ20 นาทีที่ 20 C สูงถูกแช่แข็งและเก็บไว้ที่20 C เพื่อการศึกษาต่อไป2.4 . การกำหนดกิจกรรมของสารต้านอนุมูลอิสระสารต้านอนุมูลอิสระของตัวอย่างที่ถูกตรวจสอบโดยใช้ORAC ( . . . ORAC ทำการตามวิธีการของโอhampsch woodill & ก่อน ( 2001 ) ที่มีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย ที่มาตรการการ peroxyl วิธีกิจกรรมต่อต้านสารต้านอนุมูลอิสระอนุมูลอิสระที่เกิดจากการสลายตัวของ aaph 37 C ทั้งหมดเพื่อจำนวนที่เตรียมไว้ใน 75 มม. ของโพแทสเซียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ พีเอช 7.4 . สั้น , 25 จะของสารละลายบัฟเฟอร์ ( ว่าง )เจือจางตัวอย่างโซลูชั่นมาตรฐานได้ด้วยตนเอง หรือโอนทั้งสามใบเป็น 96 ดีด้านล่างแบนสไตรีนพื้นที่ภาคเหนือของประเทศไทย ตามโดยการเพิ่ม 150 จะ 8.16 nm ี่โซลูชั่น ที่ี่โซลูชั่นและตัวอย่างที่บ่มที่ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 15 นาทีโดยตรงในพื้นที่ภาคเหนือของประเทศไทย ( อ่าน m200 อนันต์ TECAN แบบ ) และ25 aaph 153 มม. จะถูกเพิ่มเข้ามา ส่วนผสมจะถูกบ่ม30 วินาทีก่อนการเริ่มต้นด้วยแบบวัด ,485 nm ; มลพิษ , 535 นาโนเมตรและการ คือบันทึกที่ 37 องศาเซลเซียสทุกๆนาทีจนกว่าจะอ่านอัตราที่คงที่สาร โซลูชั่น ( 6.25 , 12.5 , 25 และ 50 กล. ) ถูกใช้เพื่อกำหนดเส้นโค้งมาตรฐาน ดปฏิกิริยาของมาตรฐาน หรือตัวอย่างเตรียมทั้งสามใบ สุทธิพื้นที่ใต้เส้นโค้ง ( ยา )คำนวณได้ เช่นยา¼ 0:5 þ F 1 = F 0 þ F = F F F = 0 þþ 34
การแปล กรุณารอสักครู่..
ภาษาอื่น ๆ
การสนับสนุนเครื่องมือแปลภาษา: กรีก, กันนาดา, กาลิเชียน, คลิงออน, คอร์สิกา, คาซัค, คาตาลัน, คินยารวันดา, คีร์กิซ, คุชราต, จอร์เจีย, จีน, จีนดั้งเดิม, ชวา, ชิเชวา, ซามัว, ซีบัวโน, ซุนดา, ซูลู, ญี่ปุ่น, ดัตช์, ตรวจหาภาษา, ตุรกี, ทมิฬ, ทาจิก, ทาทาร์, นอร์เวย์, บอสเนีย, บัลแกเรีย, บาสก์, ปัญจาป, ฝรั่งเศส, พาชตู, ฟริเชียน, ฟินแลนด์, ฟิลิปปินส์, ภาษาอินโดนีเซี, มองโกเลีย, มัลทีส, มาซีโดเนีย, มาราฐี, มาลากาซี, มาลายาลัม, มาเลย์, ม้ง, ยิดดิช, ยูเครน, รัสเซีย, ละติน, ลักเซมเบิร์ก, ลัตเวีย, ลาว, ลิทัวเนีย, สวาฮิลี, สวีเดน, สิงหล, สินธี, สเปน, สโลวัก, สโลวีเนีย, อังกฤษ, อัมฮาริก, อาร์เซอร์ไบจัน, อาร์เมเนีย, อาหรับ, อิกโบ, อิตาลี, อุยกูร์, อุสเบกิสถาน, อูรดู, ฮังการี, ฮัวซา, ฮาวาย, ฮินดี, ฮีบรู, เกลิกสกอต, เกาหลี, เขมร, เคิร์ด, เช็ก, เซอร์เบียน, เซโซโท, เดนมาร์ก, เตลูกู, เติร์กเมน, เนปาล, เบงกอล, เบลารุส, เปอร์เซีย, เมารี, เมียนมา (พม่า), เยอรมัน, เวลส์, เวียดนาม, เอสเปอแรนโต, เอสโทเนีย, เฮติครีโอล, แอฟริกา, แอลเบเนีย, โคซา, โครเอเชีย, โชนา, โซมาลี, โปรตุเกส, โปแลนด์, โยรูบา, โรมาเนีย, โอเดีย (โอริยา), ไทย, ไอซ์แลนด์, ไอร์แลนด์, การแปลภาษา.
- คุณก็บังคับเขาให้ถ่าย
- I know I'm pretty much less than you.I k
- I haven't much of an opinion of him.
- คุณมากรุงเทพฯ ช่วงวันไหน?
- Current project
- there is a global limit of 1024 open fil
- champion
- Karl Marx and the employment contract: f
- ไม่เข้าใจ
- คุณมากรุงเทพฯ ช่วงวันไหน?
- their subordinates completed the validat
- คุณจึงบังคับเขาให้ถ่าย
- และนั้น,เป็นเหตุผลที่ทำให้ฉันเลือกสมัครง
- เลดี้ แอนด์ เจนเทิลเมนภาษาไทยสลับภาษาต้น
- Beach Resort
- เพื่อให้ความรู้สึกถึงธรรมชาติอันอุดมสมบู
- อย่าผลิตทหารเกินที่จำกัด
- ทำไมฉันถึงรู้สึกเหนื่อยใจ แบบนี้นะ
- Populations that are not highly female s
- ฉันพอจะสวยสู้ผู้หญิงอินเดียได้ไหม
- Krabi
- หลังเลิกเรียนเขาก็จะไปเตะฟุตบอลกับเพื่อน
- Hope we can get along
- เบ่งบานใต้ดวงอาทิตย์
