the antiserum used [35,36]. A pure

the antiserum used [35,36]. A pure bovine PAG-1 preparation (boPAG-167 kDa), purified
according to the protocol of Zoli et al. [3], was used as the standard and tracer in each
assay. Iodination (Na-I125, Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) was carried
out according to the chloramine T method [37]. Rabbit polyclonal antisera AS#497 and
AS#706 were raised, respectively, against bovine PAG67 kDa (accession number Q29432)
and caprine PAG55 kDa + 62 kDa (accession numbers P80935 and P80933) preparations according
to the Vaitukaitis method [33]. The first antibody titer was determined to obtain a tracer
binding ratio for the zero standard of approximately 20–30% (initial dilutions of 1:200,000
for AS#497 and 1:80,000 for AS#706). The second antibody precipitation system was very
similar to that used for the progesterone assay except that Tris–HCl buffer (25 mM Tris,
10 mM MgCl2, and 0.02% w/v NaN3, pH 7.5) was used instead of phosphate buffer.
Plasma PAG concentrations were determined according to the method described by
Perenyi et al. ´ [35] with some modifications. The standard curve ranged from 0.2 to 25 ng/ml.
Standard and plasma samples (0.1 ml) were diluted in 0.2 and 0.3 ml of Tris–BSA buffer
(1 mg/ml of BSA; pH 7.5), respectively. To minimize non-specific interference of plasma
proteins, 0.1 ml of PAG-free plasma was added to all standard tubes. Samples and standard
tubes were incubated with 0.1 ml of the diluted first antibody (AS#497 at 1:200,000 or
AS#706 at 1:80,000). On the next day, 0.1 ml of I125-PAG-1 (25,000 cpm) was added and
the tubes incubated for a further 4 h. All incubations were performed at room temperature
(20–22 ◦C). The assay volume was 0.6 ml.
After the tubes had been incubated for 30 min with 1.0 ml of the second antibody PEG
solution, 2.0 ml of Tris–BSA buffer was added and the tubes were centrifuged (20 min at
1500 × g). The supernatant was aspirated and a second wash was undertaken using 3.0 ml
of Tris–BSA buffer. After centrifugation (20 min at 1500 × g), the tubes were aspirated and
the pellet containing the 125I-PAG bound to the antibodies was counted using a LKB Wallac
126 Multigamma counter (Turku, Finland).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

antiserum ที่ใช้ [35,36] ที่บริสุทธิ์วัว 1 ปลายแห่งชาติเตรียมการ (boPAG 167 kDa), บริสุทธิ์ตามโพรโทคอลของ Zoli et al. [3], ใช้เป็นมาตรฐานและติดตามในแต่ละทดสอบ ดำเนินการ Iodination (นา-I125, Amersham เทคโนโลยีชีวภาพ Pharmacia อุปซาลา สวีเดน)ออกตามวิธี chloramine T [37] กระต่าย polyclonal antisera AS #497 และตาม #706 ถูกยกขึ้น ตามลำดับ กับวัว PAG67 kDa (เลขทะเบียน Q29432)และน้ำเชื้อ PAG55 kDa + 62 kDa (เลขทะเบียน P80935 และ P80933) การเตรียมการตามVaitukaitis วิธี [33] Titer แอนติบอดีแรกกำหนดจะได้รับการติดตามรวมอัตรามาตรฐานศูนย์ประมาณ 20 – 30% (dilutions เริ่มต้นของ 1:200,000สำหรับ AS #497 และ 1:80,000 สำหรับ AS #706) ระบบฝนแอนติบอดีสองไม่มากคล้ายกับที่ใช้สำหรับทดสอบโปรเจสเตอโรยกเว้นทริ – HCl บัฟเฟอร์ (25 มม.ทริ10 มม. MgCl2 และ 0.02% w/v NaN3 ค่า pH 7.5) ถูกใช้แทนฟอสเฟตบัฟเฟอร์เข้มข้นปลายแห่งชาติกำหนดตามวิธีการอธิบายโดยPerenyi ร้อยเอ็ด´ [35] ด้วยการปรับเปลี่ยนบางอย่าง กราฟมาตรฐานที่อยู่ในช่วงจาก 0.2 ถึง 25 ng/mlตัวอย่างมาตรฐานและพลาสม่า (0.1 มล.) ที่ผสมใน 0.2 และ 0.3 ml ของบัฟเฟอร์ทริ – บีเอสเอ(1 mg/ml ของบีเอสเอ ค่า pH 7.5), ตามลำดับ การลดสัญญาณรบกวนเจาะจงของพลาสม่าโปรตีน 0.1 ml ของพลาสม่าฟรีปลายแห่งชาติถูกเพิ่มไปหลอดมาตรฐานทั้งหมด ตัวอย่างและมาตรฐานได้รับการกกหลอดกับแอนติบอดีแรกเจือจาง 0.1 ml (AS #497 ที่ 1:200,000 หรือAS #706 ที่ 80, 000) เพิ่ม 0.1 มล. I125 ปลายแห่งชาติ 1 (25,000 cpm) ในวันถัดไป และหลอดได้รับการกกแบบ 4 ชั่วโมงต่อไป ดำเนินการทั้งหมด incubations ที่อุณหภูมิห้อง(20 – 22 ◦C) ทดสอบเสียงได้ 0.6 มล.หลังจากหลอดได้รับได้รับการกกแอนติบอดีสองหมุด 30 นาทีกับ 1.0 mlเข้ามาแก้ปัญหา 2.0 ml ของบัฟเฟอร์ทริ – บีเอสเอ และหลอดถูกเหวี่ยง (20 นาทีที่1500 ×กรัม) Supernatant ถูกสำลัก และล้างสองถูกดำเนินการโดยใช้ 3.0 mlทริสเรทติ้ง – บีเอสเอบัฟเฟอร์ หลังจากการหมุนเหวี่ยง (20 นาทีที่ 1500 × g), หลอดได้สำลัก และเม็ดประกอบด้วย 125I-ปลายแห่งชาติที่ต้องการแอนตี้ไม่นับการใช้ LKB Wallacเคาน์เตอร์ multigamma 126 (กู ฟินแลนด์)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

antiserum สินค้า [35,36] วัวบริสุทธิ์ PAG-1 การเตรียมความพร้อม (boPAG-167 กิโลดาลตัน)
บริสุทธิ์ตามโปรโตคอลของZoli et al, [3]
ถูกนำมาใช้เป็นมาตรฐานและติดตามในแต่ละการทดสอบ iodination (ณ I125, Amersham Pharmacia ไบโอเทคอัปซาลา, สวีเดน)
ได้ดำเนินการตามวิธีการทีคลอรามีส่วน[37] antisera โพลีกระต่าย AS # 497 และ
AS # 706 ถูกยกขึ้นตามลำดับกับวัว PAG67 กิโลดาลตัน (เข้าจำนวน Q29432)
และ caprine PAG55 kDa + 62 กิโลดาลตัน (หมายเลขภาคยานุวัติ P80935 และ P80933)
การเตรียมการตามกับวิธีVaitukaitis [33] titer
แอนติบอดีเป็นครั้งแรกที่มุ่งมั่นที่จะได้รับการติดตามอัตราการผูกพันศูนย์มาตรฐานประมาณ20-30% (เริ่มต้นของการเจือจาง 1: 200,000
สำหรับ AS # 497 และ 1: 80,000 AS # 706) ระบบการเร่งรัดแอนติบอดีที่สองเป็นอย่างเดียวกับที่ใช้สำหรับการทดสอบฮอร์โมนยกเว้นว่าบัฟเฟอร์ Tris-HCl (25 มิลลิ Tris, 10 มิลลิ MgCl2 และ 0.02% w / v NaN3 ค่า pH 7.5) ได้ถูกนำมาใช้แทนฟอสเฟตบัฟเฟอร์. พลาสม่า PAG ความเข้มข้นได้รับการพิจารณาเป็นไปตามวิธีการที่อธิบายโดยPerenyi et al, '[35] มีการปรับเปลี่ยนบางอย่าง โค้งมาตรฐานอยู่ระหว่าง 0.2-25 นาโนกรัม / มล. มาตรฐานและตัวอย่างพลาสมา (0.1 มล.) ได้รับการเจือจางใน 0.2 และ 0.3 มล. ของบัฟเฟอร์ Tris-BSA (1 mg / ml ของบีเอสเอ; pH 7.5) ตามลำดับ เพื่อลดการรบกวนที่ไม่เฉพาะเจาะจงของพลาสม่าโปรตีน 0.1 มล. ของพลาสม่า PAG ฟรีถูกบันทึกอยู่ในหลอดมาตรฐานทั้งหมด ตัวอย่างและมาตรฐานหลอดถูกบ่ม 0.1 มิลลิลิตรแอนติบอดีแรกปรับลด (AS 497 # 1: 200,000 หรือ AS 706 # 1: 80,000) ในวันรุ่งขึ้น 0.1 มิลลิลิตร I125-PAG-1 (25,000 CPM) ถูกบันทึกและหลอดบ่มเป็นเวลาอีก4 ชั่วโมง ฟักตัวของเชื้อทั้งหมดได้รับการดำเนินการที่อุณหภูมิห้อง(20-22 ◦C) ปริมาณการทดสอบคือ 0.6 มล. หลังจากหลอดที่ได้รับการบ่มเป็นเวลา 30 นาทีกับ 1.0 มล. ของ PEG แอนติบอดีที่สองวิธีการแก้ปัญหา2.0 มล. ของบัฟเฟอร์ Tris-BSA ถูกบันทึกและท่อถูกหมุนเหวี่ยง (20 นาทีที่1500 × g) สารละลายถูกสำลักและล้างสองได้ดำเนินการโดยใช้ 3.0 มล. ของบัฟเฟอร์ Tris-บีเอสเอ หลังจากการหมุนเหวี่ยง (20 นาทีที่ 1500 ×กรัม) หลอดถูกสำลักและเม็ดที่มีผูกพัน125i-PAG เพื่อแอนติบอดีนับใช้ LKB Wallac 126 Multigamma เคาน์เตอร์ (ฟินแลนด์)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การใช้เชื้อ [ 35,36 ] เตรียม pag-1 วัวบริสุทธิ์ ( bopag-167 kDa ) บริสุทธิ์ตามกฏของ zoli et al . [ 3 ] ใช้เป็นมาตรฐานและติดตามในแต่ละการทดสอบ ไอโอดีน ( na-i125 ที่มุ่งมั่น , ไบโอเทค อุปซอลา , สวีเดน ) ทำการออกตามคลอรามีน t ) [ 37 ] กระต่ายใช้แอนติ # และเป็นเป็น # 706 ขึ้นตามลำดับ กับวัว pag67 ดาลตัน ( เข้าเบอร์ q29432 )caprine kDa และ pag55 + 62 กิโลดาลตัน ( หนังสือและตัวเลข p80935 p80933 ) เตรียมตามวิธีการ vaitukaitis [ 33 ] แอนติบอดีไตเตอร์แรก ตั้งใจที่จะได้รับการติดตามอัตราส่วนผูกพันสำหรับศูนย์มาตรฐานประมาณ 20 - 30 % ( วิธีการเริ่มต้นของ 1:200000เป็น # และ 1:80000 เป็น # 706 ) 2 ) ระบบการตกตะกอนมากคล้ายกับที่ใช้สำหรับการทดสอบ โปรเจสเตอโรน ยกเว้นว่าบริษัท– HCl บัฟเฟอร์ ( จาก 25 มม.ชุด 10 มม. และ 0.02 % W / V nan3 pH 7.5 ) ถูกนำมาใช้แทนฟอสเฟตบัฟเฟอร์พลาสมา Pag ความเข้มข้นคำนวณตามวิธีการที่อธิบายโดยperenyi et al . ใหม่ [ 3 ] มีการปรับเปลี่ยน เส้นโค้งมาตรฐานอยู่ระหว่าง 0.2 ถึง 25 นาโนกรัม / มิลลิลิตรมาตรฐาน และตัวอย่างพลาสมา ( 0.1 มิลลิลิตรเจือจางใน 0.2 และ 0.3 มล. ต่อ– BSA บัฟเฟอร์( 1 mg / ml ของ BSA คือ pH 7.5 ) , ตามลำดับ เพื่อลดเสียงรบกวนที่ไม่เฉพาะเจาะจงของพลาสมาโปรตีน 0.1 มิลลิลิตรพลาสมาเพิ่มหลอดเป็นปั๊กฟรีมาตรฐานทั้งหมด ตัวอย่างและมาตรฐานท่อ คือ บ่มด้วย 0.1 มิลลิลิตรเจือจางก่อน ) ( # 497 ที่ 1:200000 หรือเป็น # 706 ที่ 1:80000 ) ในวันถัดไป , 0.1 มิลลิลิตร i125-pag-1 ( 25 , 000 CPM ) คือการเพิ่มและท่อแยกสำหรับอีก 4 ชั่วโมง ทั้งหมด incubations มีการปฏิบัติที่อุณหภูมิห้อง( 20 – 22 ◦ C ) วิเคราะห์ปริมาณ 0.6 mlหลังจากหลอดถูกบ่ม 30 นาที 1.0 มิลลิลิตรของ PEG ) วินาทีโซลูชั่น 2.0 มิลลิลิตรต่อ– BSA บัฟเฟอร์เพิ่มและท่อ คือระดับ ( 20 นาทีที่× 1 , 500 กรัม ) และน่าน ถูกลมและล้างสองมีวัตถุประสงค์ใช้ 3.0 มิลลิลิตรของบริษัทฯ ขนาดบัฟเฟอร์ หลังการปั่นเหวี่ยง ( 20 นาทีที่× 1 , 500 กรัม หลอดถูกลมและเม็ดประกอบด้วย 125i-pag ผูกพันกับแอนติบอดีก็นับว่าใช้ lkb wallacเคาน์เตอร์ multigamma ( Turku , ฟินแลนด์