2.3. Primer design and codon degene

2.3. Primer design and codon degeneracy
The core of a SSM experiment lies in the codon degeneracy or
randomness. A completely randomized codon (NNN,whereN¼A,
C, GorT) results in a library size of 64 different sequences
(also knownas64-folddegeneracy) encoding all 20 amino acids
and 3 stop codons.When an experiment targets multiple codons,
the library size can be considerably higher,making it difficult to
perform a complete screening.For example,a library targeting
three NNN codons has 262,144 unique codon configurations.
Because the genetic code is redundant,it is possible to decrease
the library size by minimizing the degeneracy in the third
position of each codon.The NNK configuration,where K¼T orG,
reduces the library size by half (32-folddegeneracy),still
encoding 20 amino acids,with the advantage of having only one stop
codon. In this configuration,the amino acids M,W,F,I,Y,H,QN,
K, D E,and C are encoded by a single codon while L,V,S,P,T,A,
R andG are encoded by two or three codons.The configuration
NDT, whereD¼A, GorT,further reduces the library to 12-fold
degeneracy but with a well-represented variety of amino acids
(F, L,I,V,Y,H,N,D,C,R,SandG)and no stop codons (Reetz etal.,
2008). Other simplified libraries could be achieved with the
codons NNTorNNG(16-folddegeneracyeach),with the penalty
of excluding the amino acid residues W,Q,M,K,EandF,Y,C,H,I,
N, D,respectively.
When targeting many codons simultaneously,it is often
desirable tooptimize the level of degeneracy through a rational
design. One useful strategy is to evaluate the amino acids present
in positions of interest through structural alignment of large
populations of proteins with related activity.Residues that are
commonly present in these positions are considered ‘‘allowed’’ as
they presumably resultinanactiveprotein.Onthecontrary,
residues never or rarely found in these positions are considered
‘‘not allowed’’ because they are suggested to produce inactive
proteins. Therefore,natural variation in certain cases can be used
to guide library synthesis,covering allowed amino acids while
avoiding the non-allowed.Using this approach,four codons from
a Pseudomonas fluorescens esterase were mutated simultaneously
with the degenerated codons KBS,RBC,KKKandDYA(where
B¼C,G orT;S¼C orG;R¼A orG;D¼A, GorTandY¼C orT)
having 12-,6-,8-,and6-folddegeneracy,respectively(Jochens
and Bornscheuer,2010). The library of mutagenized esterases was
composed of 3456 sequences with different codons which
correspond to approximately 0.003% the size of a similar library using
NNK configuration that would be1,048,576sequences.This
approach facilitated more manageable screening,which resulted
in the identification of variants with up to240-fold increase in
enzyme activity.Another successful example was demonstrated
for the phenylacetone monooxygenase in which four codons were
mutated simultaneously with the degenerated versions KCA,KBG,
BGC andNSC(Reetz andWu,2008).
After producing a SSM library,it is desirable to validate the
sequence diversity at the targeted bases.Rather than verifying
individual mutants,the pool of mutagenized DNA can be sequenced,
and,the occurrence frequencies of each nucleotide at the targeted
codon can be calculated by detecting the signal amplitude of each
overlapping peak in the electropherogram(Zheng etal.,2004;
SteffensandWilliams,2007).It is often valuable to include a silent
mutation in the mutagenic primer that can be used as a marker for
selected mutants having the same sequence as the parental DNA.
This is particularly important when targeting amino acid residues
encoded by a single codon (methionine or tryptophan).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.3 การออกแบบและรหัสพันธุกรรมภาวะลดรูปรองพื้น
หลักทดลอง SSM อยู่ในภาวะลดรูปรหัสพันธุกรรม หรือ
randomness รหัสพันธุกรรมทั้งหมด randomized (NNN, whereN¼A,
C, GorT) ผลลัพธ์ในไลบรารีขนาด 64 ลำดับที่แตกต่างกัน
(ยัง knownas64-folddegeneracy) เข้ารหัสกรดอะมิโนทั้งหมด 20
และหยุด 3 codonsเมื่อการทดลองเป้าหมายหลาย codons,
ขนาดไลบรารีได้อย่างสูงมากทำยาก
ดำเนินการคัดกรองที่สมบูรณ์ตัวอย่าง ห้องสมุดกำหนดเป้าหมาย
NNN 3 codons ได้ 262,144 รหัสพันธุกรรมเฉพาะค่า
เนื่องจากรหัสพันธุกรรมซ้ำซ้อน จึงสามารถลด
ขนาดไลบรารี โดยลดภาวะลดรูปใน
ตำแหน่งของแต่ละรหัสพันธุกรรมตั้งค่าคอนฟิก NNK ที่ K¼T องค์กร,
ลดไลบรารีขนาดครึ่ง (32-folddegeneracy), ยัง
รหัสกรดอะมิโน 20 กับข้อดีของการมีเพียงหนึ่งหยุด
รหัสพันธุกรรม ในการกำหนดค่านี้ อะมิโนกรด M, W, F,, Y, H ห้อง พัก,
K, D E และ C จะถูกเข้ารหัส โดยรหัสพันธุกรรมเดียวในขณะที่ L, V, S, P, T, A,
R andG จะถูกเข้ารหัส โดย codons สอง หรือสามการกำหนดค่า
ผู้ whereD¼A, GorT ลดไลบรารีเพิ่มเติมให้ลึก 12
ภาวะลดรูปแต่ มีกรดอะมิโนต่าง ๆ เชิญ represented
(F, L,, V, Y, H, N, D, C, RSandG) และ codons ไม่หยุด (Reetz etal.,
2008) ไลบรารีอื่น ๆ ง่ายขึ้นสามารถทำได้ด้วย
codons NNTorNNG(16-folddegeneracyeach) กับเมลล์
ของรวมกรดอะมิโนตก W, Q, M, K, EandF, Y, C, H,,
N, D ตามลำดับ.
เมื่อกำหนดเป้าหมายหลาย codons พร้อม
ต้อง tooptimize ระดับของภาวะลดรูปผ่านการเชือด
ออกแบบได้ ประโยชน์กลยุทธ์หนึ่งคือการ ประเมินกรดอะมิโนอยู่
ในตำแหน่งที่น่าสนใจโดยจัดโครงสร้างของใหญ่
ประชากรของโปรตีนด้วยกิจกรรมที่เกี่ยวข้องตกที่
โดยทั่วไปปัจจุบันในตำแหน่งเหล่านี้ถือว่า ''ได้ '' เป็น
พวกเขาสันนิษฐานว่า resultinanactiveproteinOnthecontrary,
ถือว่าตกไม่เคย หรือไม่ค่อยพบในตำแหน่งเหล่านี้
''ไม่ '' เนื่องจากมีการแนะนำในการผลิตงาน
โปรตีน ดังนั้น สามารถใช้เปลี่ยนแปลงธรรมชาติในบางกรณี
แนะนำไลบรารีสังเคราะห์ ครอบคลุมได้กรดอะมิโนในขณะที่
หลีกเลี่ยงการไม่ได้รับอนุญาตได้ใช้วิธีนี้ codons สี่จาก
มี Pseudomonas fluorescens esterase ได้กลายกัน
กับที่ degenerated codons KBS, RBC, KKKandDYA (
B¼C, G orTS¼C องค์กรR¼A องค์กรD¼A, GorTandY¼C orT)
มี 12- 6- 8- and6-folddegeneracy ตามลำดับ (Jochens
และ Bornscheuer, 2010) มีไลบรารีของ mutagenized esterases
ประกอบลำดับ 3456 กับ codons ต่าง ๆ ซึ่ง
สอดคล้องกับประมาณ 0.003% ขนาดโดยใช้ไลบรารีคล้าย
NNK โครงที่จะเอง be1, 048, 576sequencesนี้
วิธีการอำนวยความสะดวกตรวจได้ง่ายขึ้น ซึ่งมีผล
ในรหัสของตัวแปรกับค่า to240 พับเพิ่มใน
เอนไซม์อีกตัวอย่างที่ประสบความสำเร็จได้แสดง
สำหรับ monooxygenase phenylacetone สี่ codons ได้
กลายพร้อม ด้วย degenerated รุ่นเกาหลีลืมขี้ผึ้ง KBG,
BGC andNSC(Reetz andWu,2008).
หลังจากผลิตรี SSM เป็นสิ่งที่ต้องการตรวจสอบ
ลำดับความหลากหลายที่ฐานเป้าหมายแทนที่จะตรวจสอบ
แต่ละสายพันธุ์ สระว่ายน้ำของ mutagenized ดีเอ็นเอที่สามารถเรียงลำดับ,
และ ความถี่ในการเกิดขึ้นของแต่ละนิวคลีโอไทด์ที่เป็นเป้าหมายที่
รหัสพันธุกรรมสามารถคำนวณได้ ด้วยการตรวจจับคลื่นสัญญาณของแต่ละ
สูงสุดทับซ้อนกันใน electropherogram การ (เจิ้ง etal., 2004;
SteffensandWilliams, 2007) ได้จึงมักจะมีคุณค่าแก่การเงียบ
การกลายพันธุ์ในพื้น mutagenic ซึ่งสามารถใช้เป็นเครื่องหมายสำหรับ
เลือกสายพันธุ์ที่มีลำดับเดียวกันตามผู้ปกครองดีเอ็นเอ
นี้เป็นสิ่งสำคัญโดยเฉพาะอย่างยิ่งเมื่อกำหนดเป้าหมายตกกรดอะมิโน
เข้ารหัส โดยรหัสพันธุกรรมเดียว (methionine หรือทริปโตเฟน)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.3 . การออกแบบและความเสื่อมทราม codon เชื้อปะทุ
หลักของการทดลอง SSM ทอดตัวอยู่ในความเสื่อมทราม codon หรือ
สุ่มที่ไม่ละเอียดได้ สมบรูณ์แบบสุ่ม codon ( nnn , wheren เพลที่,
C , gort )ส่งผลในไลบรารีขนาด 64 ลำดับแตกต่างกัน
(ยัง knownas 64 - folddegeneracy )การเข้ารหัสทั้งหมด 20 กรดอะมิโนกรด
ซึ่งจะช่วยหยุด codons และ 3 .เมื่อได้เป้าหมายการทดลองหลาย codons ,
ที่ไลบรารีขนาดใหญ่สามารถเป็นอย่างมากขึ้น,ทำให้เป็นการยากที่จะ
ซึ่งจะช่วยให้ดำเนินการสรรหาเสร็จสมบูรณ์สำหรับตัวอย่างเช่นไลบรารีที่ตั้งเป้าหมายไว้
สาม codons nnn 262,144 มีการปรับตั้งค่า codon ที่โดดเด่น.
เนื่องจากรหัสทางพันธุกรรมที่เป็นสำรองมีความเป็นไปได้ที่จะลดขนาดไลบรารี
โดยการลดความเสื่อมทรามลงในการกำหนดค่าที่สาม
ตำแหน่งของ codon . nnk ซึ่ง K เพล T . org .
ช่วยลดขนาดไลบรารีโดยครึ่ง( 32 - folddegeneracy )ยัง
การเข้ารหัส 20 เป็นกรดอะมิโนพร้อมด้วยประโยชน์ของการมีเพียงระยะทางหนึ่งป้าย
codon ในการกำหนดค่า,กรดอะมิโนที่เป็นกรด m , W , F , i , Y , H , qn ของ Adobe ,
K , d e ,และ C จะถูกเข้ารหัสด้วย codon เดียวในขณะที่ L , V , s , P , T ,ที่,
R andg จะถูกเข้ารหัสโดยสองหรือสาม codons .
เนื่องจากอยู่ไม่ไกลจากที่การตั้งค่า,ดูนี่เบนเพล, gort ,ยังช่วยลดที่ไลบรารีถึง 12 เท่า
ความเสื่อมทรามแต่พร้อมด้วยที่นำเสนอความหลากหลายของกรดอะมิโนกรด
( F , L , i , V , Y , H , N , d , C , R ,sandg )และไม่มี codons หยุด( etal reetz .
2008 ) ไลบรารีอื่นๆง่ายขึ้นสามารถทำได้ด้วย
codons nntornng ( 16 - folddegeneracyeach ),พร้อมด้วย
ซึ่งจะช่วยให้การปรับโทษของกรดอะมิโนที่ไม่รวมถึงสารตกค้าง W , Q , m , K , eandf , Y , C , H , i ,
N , d ,ตามลำดับ.
เมื่อเป้าหมาย codons พร้อมกันจำนวนมาก,มักจะเป็นที่ต้องการ tooptimize
ซึ่งจะช่วยให้ระดับของความเสื่อมทรามทางที่มีเหตุผล
การออกแบบ.มีประโยชน์เป็นหนึ่งในการประเมินที่มีกรดอะมิโนเป็นกรด
ซึ่งจะช่วยในการใช้งานผ่านโครงสร้างการจัดวางของขนาดใหญ่
ประชากรของโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับกิจกรรมที่ตกค้างอยู่ให้หมดไปโดยทั่วไปมี
เหล่านี้มีอยู่ในตำแหน่งได้รับการพิจารณาให้เป็น"ได้รับอนุญาต"เป็น
ซึ่งจะช่วยพวกเขาสามารถสันนิษฐานได้ resultinanactiveprotein . onthecontrary ,
สารตกค้างไม่เคยหรือไม่เคยพบในตำแหน่งมีการพิจารณาให้
"ไม่ได้รับอนุญาตให้"เพราะคนเหล่านี้จะได้รับการแนะนำเพื่อผลิตโปรตีน
ไม่ได้ใช้งาน ดังนั้น,ธรรมชาติการเปลี่ยนแปลงในบางกรณีสามารถใช้
ซึ่งจะช่วยในการนำทางไลบรารีการสังเคราะห์,ผ้าคลุมได้รับอนุญาตให้กรดอะมิโนกรดในขณะที่
ซึ่งจะช่วยการหลีกเลี่ยงการที่ไม่ได้รับอนุญาตให้ใช้วิธีการนี้,สี่ codons จาก
ซึ่งจะช่วยให้ pseudomonas fluorescens esterase โดยเฉพาะคอลัมนิสต์ชื่อดังได้พร้อมกันด้วย
ซึ่งจะช่วยเต็มยศละลานตา codons สถานีโทรทัศน์ KBS , RBC Center , kkkanddya (สถานที่ซึ่ง
B เพล C , G เ&รียง; s เพล C . org .; r เพลที่. org .;D วันทองที่ gortandy เพล C เ&รียง)
มี 12-6-8 - 6 - folddegeneracy ตามลำดับ( jochens
และ bornscheuer, 2010 ) ไลบรารีของ mutagenized esterases
ซึ่งจะช่วยเป็นลำดับประกอบด้วยของ 3456 มีความแตกต่างกัน codons ซึ่ง
ซึ่งตรงกับเวลาประมาณ oil 0.003% ที่ขนาดของไลบรารีที่เหมือนการใช้
nnk การกำหนดค่าที่จะ เป็น 1,048,576 ซีเควนซ์นี้
ซึ่งจะช่วยอำนวยความสะดวกการจัดการได้ง่ายกว่าการตรวจคัด,ซึ่งเป็นผลทำให้
ในการระบุตัวตนของความแตกต่างด้วยการที่มีมากถึง 240 เท่า
ซึ่งจะช่วยเพิ่มมากขึ้นในการทำงานของเอนไซม์.อื่นประสบความสำเร็จตัวอย่างเช่น
ซึ่งจะช่วยได้แสดงให้เห็นถึงการที่ phenylacetone monooxygenase ที่สี่ codons
ซึ่งจะช่วยได้โดยเฉพาะคอลัมนิสต์ชื่อดังได้พร้อมกันโดยที่เต็มยศละลานตารุ่น kca , kbg ,
BGC Partners andnsc ( reetz andwu, 2008 )..
หลังจากการผลิตที่ SSM ไลบรารี,เป็นที่พึงปรารถนาที่จะตรวจสอบได้
ตามลำดับความหลากหลายที่เป็นกลุ่มเป้าหมายโดยฐาน.มากกว่าการตรวจสอบ
แต่ละข้าวเจ้า,ที่สระของ mutagenized ดีเอ็นเอสามารถอักษรเรียงลำดับ\,
และ,ที่เกิดความถี่ของแต่ละ nucleotide ที่กลุ่มเป้าหมาย
codon สามารถได้รับการคำนวณโดยการตรวจจับสัญญาณแอมพลิจูดของแต่ละ
ทับซ้อนกันสูงสุดใน electropherogram ( Zheng etal .,รุ่น HR 2004 ;
steffensandwilliams, 2007 )จะเป็นประโยชน์ในการรวมที่เงียบ
คือมันในเชื้อปะทุ mutagenic ที่สามารถใช้เป็นเครื่องหมายสำหรับ
ข้าวเจ้าที่เลือกได้ตามลำดับเหมือนกับดีเอ็นเอของผู้ปกครอง.
นี้เป็นเรื่องที่สำคัญมากเมื่อเป้าหมายสารตกค้างกรดอะมิโน
เข้ารหัสโดย codon ตัวเดียว(เมไทโอนินซึ่งปริมาณหรือ tryptophan )