molar excess (250-fold) of globin R

molar excess (250-fold) of globin RNA reduced binding by 50o
as measured by laser densitometer scanning of autoradiogram
(Fig. 2B, lane 4). On the other hand, in the presence of similar
concentration ofpoly (I)-poly (C), there was an -2-fold increase
in binding (Fig. 2B, lane 5), which may be attributed to lower
level of nonspecific nuclease activity due to the presence of
excess poly (I)-poly (C).
Identification of the Host Protein as Calreticulin. Having
established that the 60-kDa protein from the rHPLC-purified
fraction interacts specifically with the RV RNA, we purified
the 60-kDa protein to homogeneity by HPEC (Fig. 2C). An
aliquot of the pure fraction was then digested to completion
with trypsin; resulting tryptic fragments were separated by
rHPLC, and the amino acid sequence of five peptides was
determined (Fig. 3A). The peptide sequences were then
compared with the sequences in GenBank protein data bank
(Version 85.0). Comparisons revealed a 96% similarity of the
purified 60-kDa protein with human calreticulin (Fig. 3A).
The identity of this protein was further established by its
immunoreactivity (Fig. 3B, lane 2) with human calreticulin
antibodies (17). Thus, these studies conclusively identified
the RV RNA binding protein as simian calreticulin.
Our previous studies suggested that the host binding protein
was a phosphoprotein (5). To ascertain the phosphorylation
status of calreticulin, we labeled both uninfected and
RV-infected Vero 76 cells with [32P]orthophosphoric acid and
immunoprecipitated the labeled cytosolic proteins with calreticulin-
specific antiserum. A labeled -60-kDa protein was
observed in both cell lysates (Fig. 3C, lanes 2 and 3), thereby
establishing calreticulin as a phosphoprotein. However, a
2-fold greater level of radioactivity was associated with
calreticulin in infected cell lysates (Fig. 3C, lane 3) without a
concomitant change in its steady-state level as determined by
Western blot analysis (Fig. 3D, lanes 1 and 2). These data
suggest that RV infection leads to hyperphosphorylation of
calreticulin. It is interesting to note that human calreticulin
antisera recognizes several forms of calreticulin in Vero 76
cells (Fig. 3D, lanes 1 and 2), whereas only one form is
phosphorylated (Fig. 3C, lanes 2 and 3).
RNA Binding Activity of Recombinant Human Calreticulin
Is Dependent on Phosphorylation. RV is a human pathogen. In
light of the 96% similarity between the simian and human
calreticulin, we investigated the activities of human calreticulin.
We expressed human calreticulin as a MBP fusion
protein in E. coli (Fig. 4A). The purified fusion protein
Cal-MBP migrated as one major band of "'97 kDa and two
minor bands in SDS/PAGE (Fig. 4A, lane 1), distinct from
A
SimianCalreticulin EPAVYFK EEFLDGDGWTS FYALSASFEPFLN
HumanCalreticulin EPAVYFK EQFLDGDGWTS FYALSASFEPFSN
1 7 8 18 57 69
SimianCalreticulin GTWIHPEIDNPEYSPDSI DGTIFDNFLITNDEAYAEE
HumanCalreticulin GTWIHPEIDNPEYSPDSI SGTIFDNFLITNDEAYAEE
270 287 305 323
B
-C
._
.0 _ 2
0' s)
< Mr
kDA
X -97
Calreticulin _-. -67
a -43
-18
1 2
C
0 c
C .'
E .. 2o
E
2 E i
L.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ฟันกรามส่วนเกิน (250 เท่า) ของ globin RNA ลดผลผูกพันโดย 50o
ที่วัดด้วยเลเซอร์ densitometer สแกน autoradiogram
(รูปที่ 2b เลน 4) ในอีกทางหนึ่งในการปรากฏตัวของความเข้มข้นที่คล้ายกัน
ofpoly (i) โพลี (ค) มีผลผูกพันใน-2 เท่าเพิ่มขึ้น
(รูปที่ 2b, ช่อง 5) ซึ่งอาจจะนำมาประกอบในการลด
ระดับ กิจกรรม nuclease ของเชิญชมเนื่องจากการมี
โพลีส่วนเกิน (i) โพลี (ค).
บัตรประจำตัวของโปรตีนเป็นเจ้าภาพ calreticulin ได้
ยอมรับว่าโปรตีน 60 kda จาก rhplc บริสุทธิ์
ส่วนปฏิสัมพันธ์เฉพาะกับอาร์เอ็นเอ RV เราบริสุทธิ์
โปรตีน 60 kda จะสม่ำเสมอโดย hpec (รูปที่ 2c)
หารของเศษส่วนบริสุทธิ์ถูกย่อยแล้วจะเสร็จสิ้นด้วย trypsin
; ทำให้เศษเอียงถูกแยกออกโดย
rhplc,และลำดับกรดอะมิโนเปปไทด์ของห้าเป็น
กำหนด (รูปที่ 3a) ลำดับเปปไทด์ถูกแล้ว
เมื่อเทียบกับลำดับใน genbank โปรตีนข้อมูลธนาคาร
(รุ่น 85.0) เปิดเผยการเปรียบเทียบความคล้ายคลึงกัน 96% ของโปรตีนบริสุทธิ์
60 kda ด้วย calreticulin มนุษย์ (รูปที่ 3a).
ตัวตนของโปรตีนนี้ก่อตั้งขึ้นต่อไปโดยที่
immunoreactivity (รูปที่ 3b,ช่องที่ 2) ที่มี calreticulin มนุษย์
แอนติบอดี (17) ดังนั้นการศึกษาเหล่านี้ระบุแน่ชัด
RNA RV ผูกพันโปรตีนเป็น calreticulin ลิง.
ศึกษาก่อนหน้านี้ของเราชี้ให้เห็นว่าโปรตีนเจ้าภาพผูกพัน
เป็น phosphoprotein (5) เพื่อยืนยัน phosphorylation
สถานะของ calreticulin เราระบุว่าทั้งสองไม่ติดเชื้อและ
รถอาร์วีที่ติดเชื้อ vero 76 เซลล์ที่มี [32P] กรด orthophosphoric และ
immunoprecipitated โปรตีน cytosolic กำกับด้วย calreticulin-
antiserum ที่เฉพาะเจาะจง 60 โปรตีนที่ติดฉลาก-kda
ถูกตั้งข้อสังเกตในทั้งสอง lysates เซลล์ (รูปที่ 3c เลนที่ 2 และ 3) จึง
สร้าง calreticulin เป็น phosphoprotein แต่ระดับ
2 เท่าของกัมมันตภาพรังสีมากขึ้นมีความสัมพันธ์กับ
calreticulin ใน lysates เซลล์ที่ติดเชื้อ (รูปที่ 3c, ช่อง 3) โดย
การเปลี่ยนแปลงไปด้วยกันในระดับคงที่ของตนตามที่กำหนดโดยการวิเคราะห์
ดวงตะวัน (รูป 3 มิติ, ถนนหนทางที่ 1 และ 2) ข้อมูลเหล่านี้
แนะนำว่าการติดเชื้อ RV นำไปสู่​​การ hyperphosphorylation ของ
calreticulin เป็นที่น่าสนใจที่จะทราบว่า calreticulin มนุษย์
antisera ตระหนักถึงหลายรูปแบบของการ calreticulin ใน vero 76
เซลล์ (รูปที่ 3 มิติ, เลนที่ 1 และ 2) ในขณะที่มีเพียงหนึ่งรูปแบบที่เป็น phosphorylated
(รูปที่ 3c,เลนที่ 2 และ 3).
RNA กิจกรรมผูกพันของ calreticulin มนุษย์ recombinant
ขึ้นอยู่กับ phosphorylation RV เป็นเชื้อโรคของมนุษย์
ในแง่ของความคล้ายคลึงกัน 96% ระหว่าง calreticulin เหมือนลิงและมนุษย์
เราตรวจสอบกิจกรรมของมนุษย์ calreticulin.
เราแสดง calreticulin มนุษย์เป็น MBP
ฟิวชั่นโปรตีนในอีเมล coli (รูปที่ 4a) ฟิวชั่นโปรตีนบริสุทธิ์
ไขมัน-MBP อพยพมาเป็นกลุ่มหนึ่งที่สำคัญของ "kda 97 และสอง
วงเล็กน้อยใน sds / หน้า (รูปที่ 4a เลน 1) แตกต่างจาก

simiancalreticulin epavyfk eefldgdgwts fyalsasfepfln
humancalreticulin epavyfk eqfldgdgwts fyalsasfepfsn
1 7 8 18 57 69
simiancalreticulin gtwihpeidnpeyspdsi dgtifdnflitndeayaee
humancalreticulin gtwihpeidnpeyspdsi sgtifdnflitndeayaee
270 287 305 323

b-c
. _
_ .0 2
0 's)

kdax -97
_-calreticulin -67

-43 -18
1 2
c
0 c
c. '
อี .. 2o
e
2 อีฉัน l
<0
การติดเชื้อ RV: _-'
1 2 3
พับเพิ่มขึ้น: -. 0 2.2
c
2

2 cd .. :
MBP บริสุทธิ์ (รูปที่ 4a เลน 2) ฟิวชั่นโปรตีน
โดยเฉพาะปฏิกิริยากับแอนติบอดี calreticulin ทางตะวันตกของดวง
วิเคราะห์ (รูปที่ 4b เลน 1) ความแตกแยกของเอนไซม์เสีย-
MBP ด้วยปัจจัย XA ปล่อยโปรตีน 60 kda ทำปฏิกิริยากับ
calreticulin antiserum (รูปที่ 4b เลน 2) เมื่อบ่ม
บริสุทธิ์เสีย-MBP ด้วยรถอาร์วี 3 '() sl RNA ไม่มีวัด
RNA ผูกพันก็สังเกตเห็น.
เพราะมันได้รับการตั้งข้อสังเกต (5) ฟอสโฟ
ที่จำเป็นสำหรับโปรตีนของเซลล์ unpurified ผูก RV
RNA เราวิเคราะห์ความสามารถของไขมัน-MBP ผูกรถอาร์วีอาร์เอ็นเอ
หลังจาก phosphorylation ในหลอดทดลอง ทั้งบริสุทธิ์เสีย-MBP และ
MBP บ่มด้วย [y-32P] เอทีพีในการมีหรือไม่มี
vero 76 cytosolic สารสกัดจากโปรตีนและติดป้าย
ถูก immunoprecipitated โดยแอนติบอดี MBP แอนติบอดี MBP
ไม่ตกตะกอนโปรตีนที่มีข้อความใด ๆ จากสารสกัดจากเซลล์
คนเดียว (รูปที่ 4c, ช่อง 5) ไขมัน-MBP เป็น 32P
ป้าย (รูปที่ 4c เลน 2 และ 4) ในขณะที่บริสุทธิ์ MBP
ล้มเหลวที่จะระบุว่าภายใต้เงื่อนไขที่คล้ายกัน (รูปที่ 4c,ช่องที่ 1 และ 3).
การติดฉลากของฟิวชั่นโปรตีนไขมัน-MBP ในกรณีที่ไม่มีสารสกัดจากเซลล์
(รูปที่ 4c เลน 2) บอกว่ามันอาจจะเป็น
autokinase แต่การศึกษาเพิ่มเติมจะต้องยืนยัน
สมมติฐานนี้ เพื่อทดสอบว่า phosphorylated ไขมัน-MBP
ผูกกับรถอาร์วี 3 '() sl RNA เรา phosphorylated ทั้งสองเสีย-
MBP และ MBP ในหลอดทดลองด้วยเอทีพีที่ไม่มีป้ายกำกับตามด้วย
การบ่มด้วยข้อความ RNA 3 '() sl ในเจลกะทดสอบ
(รูปที่ 4d) เพียง แต่โปรตีนไขมันฟิวชั่น-MBP ที่ phosphorylated
โดยบ่มด้วยเอทีพีที่ไม่มีป้ายกำกับทั้งในกรณีที่ไม่มี
(4d รูปเลน 4) หรือการแสดง (รูปที่ 4d เลน 6) ของสารสกัด
cytosolic ผูกพัน RNA RV การลดลงของ
ผูกพันของเสีย-MBP ในที่ที่มี vero lysate 76 เซลล์
อาจสะท้อนให้เห็นถึงการแข่งขันระหว่าง phosphorylated ไขมัน-
MBP และภายนอก calreticulin ใน lysate ในกรณีที่ไม่มีของ
phosphorylation ก่อนเสีย-MBP ไม่แสดง RV
RNA กิจกรรมที่มีผลผูกพัน (4d รูปเลน 2) การรักษาด้วยอัลคาไลน์ฟอสฟา
ของโปรตีน phosphorylated ก่อนที่จะมีการบ่ม
กับรถอาร์วีอาร์เอ็นเอยกเลิกผูกพันของเสีย-
MBP (4d รูป, ช่อง 7)MBP เมื่อได้รับการปฏิบัติในลักษณะที่คล้ายคลึง
ไม่ได้ผูกไว้กับรถอาร์วีอาร์เอ็นเอ (รูปที่ 4d เลน 3 และ 5).
เพื่อทดสอบความจำเพาะของอาร์เอ็นเอของกิจกรรมที่มีผลผูกพันในหลอดทดลอง
-phosphorylated calreticulin recombinant เราใช้กลายพันธุ์
3 '() sl RNA เป็นคู่แข่งในอาร์เอ็นเอเจลกะ
ทดสอบ ใน 3 'sl (AU) อาร์เอ็นเอกลายพันธุ์ฐานคู่ได้ลา
แทนฐานคู่ GC จึงยังคงคาดการณ์
โครงสร้าง slในการทดลองเจลกะ calreticulin recombinant
ความสัมพันธ์กับรถอาร์วีอาร์เอ็นเอ (รูป 4e เลน 2) และ
กิจกรรมที่มีผลผูกพันได้รับการแข่งขันโดยไม่มีชื่อกำกับป่าชนิด 3 '
() sl อาร์เอ็นเอ (รูป 4e เลน 3 ) แต่ไม่ใช่กลายพันธุ์อาร์เอ็นเอ

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

สบส่วนเกิน (250-fold) ของอาร์เอ็น globin เอลดผูก โดย 50o
วัดจากเลเซอร์ densitometer การสแกน autoradiogram
(Fig. 2B เลน 4) ในต่อหน้าบนมืออื่น ๆ ของคล้าย
ofpoly ความเข้มข้น (I) -โพลี (C), มีเพิ่ม-2-fold
ในผูก (Fig. 2B เลน 5), ซึ่งอาจเป็นบันทึกลง
ระดับของกิจกรรม nuclease เจาะจงเนื่องจากของ
โพลีเกิน (I) -โพลี (C) .
รหัสโปรตีนโฮสต์เป็น Calreticulin มี
ก่อตั้งที่โปรตีน 60 kDa จากที่ rHPLC-บริสุทธิ์
เศษส่วนโต้ตอบโดยเฉพาะกับอาร์เอ็นเอ RV เราบริสุทธิ์
โปรตีน 60 kDa เพื่อ homogeneity โดย HPEC (Fig. 2C) การ
ส่วนลงตัวของเศษส่วนแท้ถูกต้องจนเสร็จสมบูรณ์แล้ว
กับทริปซิน บางส่วนของ tryptic ผลลัพธ์ถูกคั่นด้วย
rHPLC และลำดับกรดอะมิโนของเปปไทด์ 5
กำหนด (Fig. 3A) ลำดับเพปไทด์ถูกแล้ว
เมื่อเทียบกับลำดับใน GenBank โปรตีนธนาคารข้อมูล
(Version 85.0) เปรียบเทียบความคล้ายคลึงกัน 96% ของการเปิดเผย
บริสุทธิ์โปรตีน 60 kDa กับมนุษย์ calreticulin (Fig. 3A) .
ตัวโปรตีนนี้ได้ก่อตั้งขึ้นโดยเพิ่มเติมของ
immunoreactivity (Fig. 3B 2 เลน) กับมนุษย์ calreticulin
แอนตี้ (17) ดัง ศึกษาเหล่านี้เห็นระบุ
โปรตีนรวม RV อาร์เอ็นเอเป็นสิมิลัน calreticulin.
การศึกษาก่อนหน้านี้ของเราแนะนำที่โฮสต์ผูกโปรตีน
ถูก phosphoprotein (5) การตรวจการ phosphorylation
สถานะของ calreticulin เราชื่อทั้ง uninfected และ
เซลล์ที่ติดเชื้อ RV Vero 76 มีกรด orthophosphoric [32P] และ
immunoprecipitated โปรตีน cytosolic ป้ายกับ calreticulin-
antiserum เฉพาะ A ป้าย -60-kDa โปรตีนถูก
สังเกตใน lysates ทั้งเซลล์ (Fig. 3C ถนนหนทางที่ 2 และ 3), ทำ
สร้าง calreticulin เป็น phosphoprotein อย่างไรก็ตาม เป็น
2 พับมากกว่าระดับของ radioactivity เกี่ยวข้องกับ
calreticulin ใน lysates เซลล์ติดเชื้อ (Fig. 3C เลน 3) ไม่เป็น
เปลี่ยนแปลงมั่นใจในระดับท่อนเป็นกำหนดโดย
วิเคราะห์คืนในตาตะวันตก (Fig. 3D ถนนหนทาง 1 และ 2) ข้อมูลเหล่านี้
แนะนำว่า RV ติดเชื้อนำไปสู่ hyperphosphorylation ของ
calreticulin เป็นที่น่าสนใจเพื่อทราบที่ calreticulin มนุษย์
antisera รู้จักหลายรูปแบบ calreticulin ใน Vero 76
เซลล์ (3D Fig. ถนนหนทาง 1 และ 2), ในขณะที่เป็นแบบฟอร์มเดียว
phosphorylated (Fig. 3C ถนนหนทาง 2 และ 3) .
อาร์เอ็นเอผูกกิจกรรมของวททชมนุษย์ Calreticulin
จะขึ้นอยู่กับ Phosphorylation RV คือ ศึกษามนุษย์ ใน
แสงของ 96% คล้ายคลึงระหว่าง simian และมนุษย์
calreticulin เราตรวจสอบกิจกรรมของมนุษย์ calreticulin
เราแสดง calreticulin มนุษย์เป็นฟิวชั่น MBP
โปรตีนใน E. coli (Fig. 4A) โปรตีนบริสุทธิ์ฟิวชั่น
Cal MBP ย้ายเป็นวงหลักหนึ่ง "'97 kDa และสอง
จำนวนวงใน SDS/หน้า (Fig. 4A เลน 1), แตกต่างจาก
A
SimianCalreticulin EPAVYFK EEFLDGDGWTS FYALSASFEPFLN
HumanCalreticulin EPAVYFK EQFLDGDGWTS FYALSASFEPFSN
1 7 8 18 57 69
SimianCalreticulin GTWIHPEIDNPEYSPDSI DGTIFDNFLITNDEAYAEE
HumanCalreticulin GTWIHPEIDNPEYSPDSI SGTIFDNFLITNDEAYAEE
270 287 305 323
B
-C
. _
. 0 _ 2
0' s)
< นาย
kDA
X - 97
Calreticulin _- -67
-43 เป็น
-18
1 2
C
0 c
C .'
E .. 2o
E
2 E ฉัน
L. < 0
เชื้อ RV: _ - '
1 2 3
พับเพิ่ม: - 0 2.2
c
2
c D
2 ...: .
MBP บริสุทธิ์ (Fig. 4A เลน 2) โปรตีนอาหาร
โดยเฉพาะ reacted calreticulin แอนติบอดีในคืนในตาตะวันตก
วิเคราะห์ (Fig. 4B เลน 1) เอนไซม์ในระบบปริ Cal-
MBP ด้วยปัจจัยซาออกโปรตีน 60 kDa ที่ปฏิกิริยากับ
calreticulin antiserum (Fig. 4B เลน 2) เมื่อคณะทันตแพทยศาสตร์ของ
บริสุทธิ์ Cal MBP ที่ มี RV (3)-อาร์เอ็น SL เอ วัดไม่
อาร์เอ็นเอรวมถูกสังเกต
เนื่องจากจะได้สังเกต (5) phosphorylation ที่ถูก
จำโปรตีนเซล unpurified ผูก RV
อาร์เอ็นเอ เราวิเคราะห์ความสามารถของ Cal MBP เพื่อผูก RV อาร์เอ็นเอ
หลัง phosphorylation ใน ทั้งบริสุทธิ์ Cal MBP และ
MBP ได้ incubated ด้วย [y - 32P] ATP ในสถานะ หรือ
ของ Vero 76 cytosolic แยก และป้ายโปรตีน
ถูก immunoprecipitated โดยแอนติบอดี MBP แอนติบอดี MBP
ได้ precipitate โปรตีนใด ๆ ป้ายจากเซลล์
สารสกัดเพียงอย่างเดียว (Fig. 4C เลน 5) Cal-MBP ได้ 32p
ป้าย (Fig. 4C ถนนหนทาง 2 และ 4), โดยบริสุทธิ์ MBP ล้ม
จะมีป้ายชื่อภายใต้เงื่อนไขที่คล้ายกัน (Fig. 4C ถนนหนทาง 1 และ 3) .
Labeling โปรตีนฟิวชั่น Cal MBP ของ
สารสกัดจากเซลลูลาร์ (Fig. 4C เลน 2) แนะนำว่า อาจจะเป็น
autokinase แต่การศึกษาเพิ่มเติมจะต้อง substantiate
สมมติฐานนี้ การทดสอบ phosphorylated Cal MBP
binds กับ RV (3) -อาร์เอ็นเอ SL เรา phosphorylated Cal ทั้ง-
MBP และใน MBP กับ ATP เพียง ตามด้วย
คณะทันตแพทยศาสตร์ ด้วย(ที่ป้าย 3')-อาร์เอ็นเอ SL ในทดสอบกะเจ
(Fig. 4D) เฉพาะ Cal MBP ฟิวชั่นโปรตีนที่ถูก phosphorylated
โดย incubating กับ ATP เพียงอย่างใดอย่างหนึ่งในการ
ขาด (โตโยต้า Fig. เลน 4) หรือสถานะ (โตโยต้า Fig. เลน 6) ของ
cytosolic สกัดอาร์เอ็นเอ RV ผูก ลดลงใน
ผูกของ Cal MBP ในต่อหน้าของเซลล์ Vero 76 lysate
อาจสะท้อนถึงการแข่งขันระหว่าง phosphorylated Cal-
MBP และ calreticulin endogenous ใน lysate ที่ ในกรณี
ของ phosphorylation ก่อน Cal MBP ไม่ไม่แสดง RV
กิจกรรมผูกอาร์เอ็นเอ (โตโยต้า Fig. เลน 2) รักษาด้วย
อัลคาไลน์ฟอสฟาเตสโปรตีน phosphorylated ก่อน
การบ่มกับ RV อาร์เอ็นเอ abrogated ผูก Cal-
MBP (โตโยต้า Fig. เลน 7) MBP เมื่อในลักษณะคล้าย
ไม่ได้ผูกกับ RV อาร์เอ็นเอ (โตโยต้า Fig. ถนนหนทางที่ 3 และ 5) .
ทดสอบ specificity ของอาร์เอ็นเอรวมกิจกรรมของที่ใน
phosphorylated หลอด calreticulin recombinant เราใช้เป็น
กลายพันธุ์ 3' ()-อาร์เอ็นเอ SL เป็นคู่แข่งในอาร์เอ็นเอเจลกะ
วิเคราะห์ ใน 3' SL (AU) mutant อาร์เอ็นเอ ถูกคู่ฐาน A-U
แทน G C ฐานคู่ ผลการรักษาที่คาดการณ์สำหรับ
SL โครงสร้าง ในการทดสอบกะเจล recombinant calreticulin
interacted กับ RV อาร์เอ็นเอ (4e-fe กลไก Fig. เลน 2) และ
ผูกกิจกรรมร่วมแข่งขัน โดยไม่ป่าชนิด 3
()-อาร์เอ็นเอ SL (4e-fe กลไก Fig. เลน 3) แต่ไม่ใช่ โดย mutant อาร์เอ็นเอ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

กรามที่ใช้เคี้ยวมากเกินไป( 250 - พับ)ของ rna globin ลดลงมีผลผูกพันโดย 50 O
ตามที่วัดได้จากการสแกนเลเซอร์ densitometer autoradiogram
(รูปที่ ช่องทางเดินรถ 2 B 4 ) ในอีกด้านหนึ่งที่อยู่ในการมีอยู่ของความเหมือน
ซึ่งจะช่วยการระดม ofpoly ( i ) - Poly ( C )มี - 2 เท่าเพิ่มขึ้น
ในปุ่มลัด(รูปที่ ช่องทางเดินรถ 2 B 5 )ซึ่งอาจเป็นผลสืบเนื่องจากการทำงานของระดับของ nuclease
ซึ่งจะช่วย nonspecific ลดลงเพราะการมีอยู่ของ
ส่วนเกิน Poly ( i ) - Poly ( C )..
การระบุตัวตนของโปรตีนที่เป็น calreticulin . มี
ซึ่งจะช่วยสร้างขึ้นที่ 60 - โปรตีน kda จากปฏิสัมพันธ์
เศษ rhplc - บริสุทธิ์โดยเฉพาะกับ rna RV ที่เราบริสุทธิ์
60 - โปรตีน kda เพื่อซึ่งประกอบขึ้นด้วยส่วนที่เหมือนกันโดย hpec (รูปที่ 2 C )
aliquot ของเศษเย็นที่สะอาดบริสุทธิ์ได้รับบ้างนิดหน่อยต่อให้เสร็จสมบูรณ์พร้อมด้วย trypsin
ซึ่งจะช่วยแล้วเศษ tryptic ส่งผลให้เป็นแยกออกจากกันโดย
rhplcและตามลำดับกรดอะมิโนที่ห้า peptides เป็น
กำหนด(รูปที่ 3 A ) ซีเควนซ์ peptide ให้
เมื่อเทียบกับซีเควนซ์ของข้อมูลที่อยู่ในธนาคารโปรตีนเลี้ยงดู
(เวอร์ชัน 85.0 ) การเปรียบเทียบเผยให้เห็นอย่างเดียวกัน 96% ของโปรตีน
บริสุทธิ์ 60 - kda ที่พร้อมด้วยมนุษย์ calreticulin (รูปที่ รหัสประจำตัว 3 A )..
ของโปรตีนนี้ได้ถูกจัดตั้งขึ้นโดย
immunoreactivity (รูปเพิ่มเติม 3 Bช่อง 2 )พร้อมด้วย calreticulin มนุษย์
เมื่อเส้นเลือด( 17 ). ดังนั้นการศึกษาเหล่านี้ลงความเห็นได้ระบุว่าโปรตีนมีผลผูกพัน rna RV
calreticulin ที่เป็นสัตว์จำพวกลิง.
การศึกษาก่อนหน้าของเราที่แนะนำที่โฮสต์ที่มีผลผูกพันโปรตีน
ซึ่งจะช่วยเป็น phosphoprotein ( 5 ) ในการตรวจสอบให้แน่ใจถึง phosphorylation
สถานะของ calreticulin เรามีข้อความเซลล์ทั้ง uninfected และ
RV - ติดเชื้อไวรัส Vero Beach - Oceanside 76 พร้อมด้วย[ 32 P ]กรด orthophosphoric และ
immunoprecipitated โปรตีน cytosolic มีข้อความที่พร้อมด้วย antiserum calreticulin -
เฉพาะ โปรตีนมีข้อความ - 60 - kda เป็น
สังเกตเห็นใน lysates เซลล์ทั้งสองด้าน(รูปที่ 3 C ช่องทาง 2 และ 3 )ซึ่งจะ
calreticulin การจัดตั้งเป็น phosphoprotein ที่. อย่างไรก็ตามระดับ
2 เท่ามากกว่าของกัมมันต ภาพ รังสีมีความเกี่ยวข้องกับ
calreticulin ใน lysates เซลล์ที่ติดเวิร์มดังกล่าว(รูปที่ 3 C ซอย 3 )โดยไม่ได้ตอบแทน
เปลี่ยนคู่กันในระดับอย่างต่อเนื่อง - รัฐตามที่กำหนดขึ้นโดยการวิเคราะห์ทำให้เสียไป
ตะวันตก(รูปที่ 3 D ช่อง 1 และ 2 ) ข้อมูลเหล่านี้
ซึ่งจะช่วยแนะนำว่าการติดเชื้อ RV นำไปสู่ hyperphosphorylation ของ
calreticulin มันเป็นเรื่องที่น่าสนใจที่จะบันทึกไว้ด้วยว่ามนุษย์ calreticulin
antisera รู้จักหลายรูปแบบของ calreticulin ในเซลล์ Vero Beach - Oceanside 76
(รูปที่ 3 D ช่อง 1 และ 2 )ในขณะที่เพียงหนึ่งเป็น
phosphorylated (รูปที่ 3 Cช่อง 2 และ 3 )..
กิจกรรมมีผลผูกพัน rna ของ poxvaccine มนุษย์ calreticulin
ขึ้นอยู่กับ phosphorylation . รถ RV มีเชื้อของมนุษย์ ไฟแสดง
ซึ่งจะช่วยในการออก 96% ระหว่าง calreticulin สัตว์จำพวกลิงและมนุษย์
ซึ่งจะช่วยให้เราตรวจสอบกิจกรรมของมนุษย์ calreticulin .
เราแสดง calreticulin ของมนุษย์เป็นกล่องขาเข้า MBP
ซึ่งจะช่วยการผสมผสานอาหารโปรตีนในผล(รูปที่ 4 ) การผสมผสานอาหารโปรตีนบริสุทธิ์
ตามมาตรฐานCAL แบบกล่องขาเข้า MBP ถูกย้ายเป็นหนึ่งคลื่นความถี่ที่สำคัญของ"คลื่นความถี่ 97 kda และสอง
เล็กน้อยในหน้าเซิร์ฟเวอร์ SDS /(รูปที่ 4 ,ซอย 1 ),แตกต่างจาก

simiancalreticulin epavyfk eefldgdgwts fyalsasfepfln
humancalreticulin epavyfk eqfldgdgwts fyalsasfepfsn
178185769
simiancalreticulin gtwihpeidnpeyspdsi dgtifdnflitndeayaee

humancalreticulin gtwihpeidnpeyspdsi sgtifdnflitndeayaee 270287305 .323

b - C
_

.0 _ 20 ' s )นาย

< kda
x -97
calreticulin _ - . -67
ที่ -43

- 1812

c 0 C
C .'
E ... 2 O

E 2 E ผม
แอล. < 0
RV การติดเชื้อ:___ - '
123
พับเก็บเพิ่มขึ้น: 0 - 2.2

C 2 C , D

2 ..:.
บริสุทธิ์กล่องขาเข้า MBP (รูปที่ 4 ซอย 2 ) การผสมผสานที่โปรตีน
โดยเฉพาะปฏิกิริยากับแอนทิบอด - อิ calreticulin ในตะวันตกทำให้เสียไป
การวิเคราะห์(รูปที่ ช่องทางเดินรถ 4 B 1 ) ความบาดหมางกัน enzymatic ของ CAL แบบ XA -
กล่องขาเข้า MBP ด้วยปัจจัยที่ออกมาโปรตีน 60 - kda รับมือพร้อมด้วย
calreticulin antiserum (รูปที่ ช่องทางเดินรถ 4 B 2 ) เมื่อแสดงระยะฟักตัวของ
บริสุทธิ์ CAL - กล่องขาเข้า MBP พร้อมด้วยรถ RV 3 '() - C rna ,ไม่มีความได้เปรียบซึ่ง
rna มีผลผูกพันพบว่า.
เนื่องจากได้รับการปฏิบัติตาม( 5 )ที่ phosphorylation
ซึ่งจะช่วยเป็นความจำเป็นสำหรับ unpurified เซลลูลาร์โปรตีนเพื่อมัดที่จอดรถ RV
rna ,เราวิเคราะห์ความสามารถของ CAL แบบกล่องขาเข้า MBP เพื่อมัด RV rna
หลังจาก phosphorylation ใน Vitro . บริสุทธิ์ทั้ง CAL แบบกล่องขาเข้า MBP และ
ตามมาตรฐานกล่องขาเข้า MBP incubated อยู่ด้วย[ y 32 P ] ATP
ซึ่งจะช่วยในการประชุมหรือการมีอยู่ของสารสกัดจากสาหร่าย Vero Beach - Oceanside 76 cytosolic และระบุว่าโปรตีน
อยู่ immunoprecipitated โดยแอนทิบอด - อิกล่องขาเข้า MBP แอนทิบอด - อิกล่องขาเข้า MBP ที่
ไม่ได้ผลักโปรตีนมีข้อความใดๆจากห้องขัง
สารสกัดจากสาหร่ายตามลำพัง(รูปที่ 4 c ซอย 5 ) CAL แบบกล่องขาเข้า MBP ที่เป็น 32 P
มีข้อความ(รูปที่ 4 c 2 ช่องและ 4 )ในขณะที่กล่องขาเข้า MBP บริสุทธิ์ล้มเหลว
ซึ่งจะช่วยให้มีข้อความ ภายใต้ เงื่อนไขความเหมือน(รูปที่ 4 Cช่อง 1 และ 3 )..
การติดฉลากของโปรตีน CAL แบบผสมผสานแบบกล่องขาเข้า MBP โดยไม่มี
สารสกัดจากสาหร่ายของเซลลูลาร์(รูปที่ 4 c ซอย 2 )ที่แนะนำว่าอาจเป็น
autokinase แต่การศึกษาเพิ่มเติมจะต้องแสดงหลักฐาน
สมมุติฐานนี้ เพื่อทดสอบว่า phosphorylated CAL - กล่องขาเข้า MBP
ผูกพันในการจอดรถ RV 3 '() - C rna เรา phosphorylated CAL -
กล่องขาเข้า MBP และกล่องขาเข้า MBP เองด้วยทั้งใน ATP ไม่ตามด้วย
อบพร้อมด้วยที่มีข้อความ 3 '() - C rna ในเจล - Shift ที่พยายาม
(รูปที่ 4 D ) เฉพาะที่โปรตีนการผสมผสาน CAL แบบกล่องขาเข้า MBP ที่ phosphorylated
โดยศูนย์บ่มเพาะด้วย ATP ไม่ทั้งใน
ไม่มี(รูปที่ 4 D ช่อง 4 )หรือ(รูปที่ 4 D ช่อง 6 )ของ
cytosolic ดึงผูกพัน rna RV ได้. ลดลงใน lysate เซลล์
มีผลผูกพันของ CAL แบบกล่องขาเข้า MBP ในการมีอยู่ของ Vero Beach - Oceanside 76
อาจจะสะท้อนถึงการแข่งขันระหว่าง phosphorylated CAL -
กล่องขาเข้า MBP และ calreticulin เองในระยะยาวใน lysate ได้ ในกรณีที่
ของ phosphorylation ก่อน CAL - กล่องขาเข้า MBP ไม่ได้จัดแสดงนิทรรศการ RV
rna มีผลผูกพันกิจกรรม(รูปที่ 4 D ช่อง 2 ) การบำบัดด้วย phosphatase
อัลคาไลน์ของโปรตีน phosphorylated ก่อนที่จะ
ซึ่งจะช่วยแสดงระยะฟักตัวของโรงแรมพร้อมด้วยรถ RV rna ถูกคณะรัฐประหารยกเลิกมีผลผูกพันของ CAL แบบ
กล่องขาเข้า MBP (รูปที่ 4 D ช่อง 7 )กล่องขาเข้า MBP เมื่อได้รับการปฏิบัติในลักษณะเดียวกันที่
ไม่ได้เชื่อมโยงกับรถ RV rna (รูปที่ 4 D ช่อง 3 และ 5 )..
การทดสอบลักษณะเฉพาะเจาะจงของกิจกรรมมีผลผูกพัน rna ของ calreticulin ใน
Vitro - phosphorylated poxvaccine ที่เราใช้
mutant 3 "() - C rna เป็นผู้เข้าแข่งขันใน rna เจล - Shift
ซึ่งจะช่วยสอบให้. ใน rna mutant 3 ' C ( au )ที่เป็นคู่ฐานที่ - u มี
แทนได้สำหรับคู่ฐาน G - C ซึ่งจะช่วยรักษาโครงสร้าง
C คาดการณ์ไว้ในพยายามเจล - การเปลี่ยนแปลง poxvaccine calreticulin
ได้สำหรับ RV rna (รูปที่ 4 E ช่อง 2 )และการทำกิจกรรม
มีผลผูกพันที่เข้าแข่งขันโดยไม่มีป่า - ประเภท 3 '
() - C rna (รูปที่ 4 E ช่อง 3 )แต่ไม่ใช่โดย rna mutant ได้