promoter was set to the 1.9 kb regi

promoter was set to the 1.9 kb region upstream of the
SPL10 coding sequence [up to the closest gene ( At1g27380 )],
and the length of the SPL11 promoter was determined with
reference to the SPL10 promoter. Consistent with the results
of the RT–PCR analysis, GUS activity was detected in various
tissues including roots, rosette leaves, cauline leaves, fl owers
and fruits in both transgenic plants ( Fig. 1B–E ). High
promoter activities were detected in roots and juvenile
rosette leaves, while mRNA accumulation in these organs
was low. This suggests that SPL10 and SPL11 are regulated
post-transcriptionally, although this may due to the
shortage of the regulatory sequence for SPL10 and SPL11
expression.
Function of SPL10 is controlled by microRNA
We examined the transcriptional activation activity of
SPL10 by a transient expression assay. SPL10 has a target
site for miR156/157 ; therefore, we produced an miR156/157 -
resistant version of SPL10 (referred to as mSPL10 ) to abolish
regulation by miR156/157 (Fig. 2A ). The coding regions of
SPL10 and mSPL10 were fused to that of the yeast GAL4
DNA-binding domain (GAL4DB), in-frame. They were then
co-bombarded into rosette leaves with a reporter plasmid
that contained GAL4 binding sites in the upstream region of
the luciferase ( LUC ) reporter gene ( Fig. 2B ). We assayed
luciferase expression in both juvenile and adult leaves
because miR156 levels are high in the juvenile phase and
decrease during shoot maturation ( Wu and Poethig 2006 ).
In juvenile rosette leaves in which miR156 is expressed at
a high level ( Wu and Poethig 2006 ), the LUC activity induced
by GAL4DB-SPL10 was similar to that of the GAL4DB
control, while GAL4DB-mSPL10 showed 3.8-fold higher
activity ( Fig. 2C ). This suggests that SPL10 is down-regulated
by miR156 . Supporting this, GAL4DB-SPL10 showed activation
activity in adult rosette leaves where the level of miR156
is much lower, although the activity was lower than that of
GAL4DB-mSPL10 ( Fig. 2D ). These data indicate that SPL10
acts as a transcriptional activator and that its function is
controlled by miR156. Deletion analysis indicated that the
activation activity of SPL10 is in the N-terminal 51 amino
acids containing the AHA-like motif ( Fig. 2E ). This motif
is conserved in all SPL10-like proteins (Supplementary
Fig. S2), suggesting that they also function as transcriptional
activators. The much higher activity of GAL4DB-SPL10 1–51
than that of GAL4DB-mSPL10 might be due to structural
accessibility to the transcriptional activation machinery.
Expression of an SPL10 chimeric repressor affected
shoot development in the reproductive phase
A phenotypic abnormality of spl10 , spl11 and spl2 has not
been identifi ed so far ( Wang et al. 2008 ). This is probably
because of their functional redundancy. Double or triple
mutants may show morphological defects. However, the
R JL AL CL S F1 F2 Fr
SPL10
SPL11
SPL2
PP2AA3
A
Fig. 1 Spatial expression of SPL10 , SPL11 and SPL2 . (A) RT–PCR analysis
of the expression of SPL10 , SPL11 and SPL2 in various tissues.
Full-length coding sequences were amplifi ed. PP2AA3 was used as
a loading control. R, roots; JL, juvenile leaves (third and fourth leaves);
AL, adult leaves (seventh to ninth leaves); CL, cauline leaves;
S, infl orescence stems; F1, fl owers at stage 1–12; F2, fl owers at stage
13–15; Fr, fruits. Flower stage is according to Smyth et al. (1990) . (B–E)
GUS staining of ProSPL10:GUS plants (B, C) and ProSPL11:GUS (D, E)
plants. Two-week-old (B, D) and 1-month-old (C, E) plants were GUS
stained. Scale bars represent 5 mm.
2

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

โปรโมเตอร์ถูกตั้งค่าให้ภูมิภาค 1.9 kb ต้นน้ำของการลำดับรหัส SPL10 [ถึงสุดยีน (At1g27380)],และกำหนดความยาวของโปรโมเตอร์ SPL11 ด้วยอ้างอิงกับโปรโมเตอร์ SPL10 สอดคล้องกับผลการการวิเคราะห์การ RT – PCR, GUS กิจกรรมพบในที่ต่าง ๆเนื้อเยื่อรวมทั้งราก rosette ใบ ใบ cauline, fl owersและผลไม้ในพืชทั้งถั่วเหลือง (Fig. 1B – E) สูงกิจกรรมโปรโมเตอร์พบ ในราก และเยาวชนrosette ใบ ในขณะที่ mRNA สะสมในอวัยวะเหล่านี้อยู่ในระดับต่ำ นี้แนะนำว่า SPL10 และ SPL11 ถูกควบคุมpost-transcriptionally แม้ว่านี้อาจเนื่องการขาดแคลนลำดับระเบียบ SPL10 และ SPL11นิพจน์ ฟังก์ชันของ SPL10 ถูกควบคุม โดย microRNA เราตรวจสอบกิจกรรมเปิด transcriptional ของSPL10 โดยวิเคราะห์นิพจน์แบบฉับพลัน SPL10 มีเป้าหมายเว็บไซต์สำหรับ miR156/157 ดังนั้น เราผลิตเป็น miR156/157-รุ่นทน SPL10 (เรียกว่า mSPL10) ยุบระเบียบ โดย miR156 (Fig. 2A) 157 รหัสภูมิภาคSPL10 และ mSPL10 ถูก fused ที่ยีสต์ GAL4ดีเอ็นเอรวมโด (GAL4DB), ในกรอบ พวกเขาแล้วร่วมระดมยิงเป็น rosette ใบมี plasmid โปรแกรมรายงานที่อยู่ GAL4 รวมไซต์ในภูมิภาคขั้นต้นน้ำการ luciferase (ลุค) โปรแกรมรายงานยีน (Fig. 2B) เรา assayedluciferase นิพจน์ในใบไม้ทั้งเด็ก และผู้ใหญ่เนื่องจาก miR156 ระดับสูงในระยะเด็ก และลดระหว่างพ่อแม่ยิง (วูและ Poethig 2006)ในใบไม้ rosette เยาวชนที่แสดงที่ miR156ระดับสูง (วูและ Poethig 2006), ทำให้เกิดกิจกรรมลุคโดย GAL4DB-SPL10 ถูก GAL4DBควบคุม ในขณะที่ GAL4DB mSPL10 พบ 3.8-fold สูงกว่ากิจกรรม (Fig. 2C) นี้แนะนำว่า SPL10 เป็นระเบียบลงโดย miR156 สนับสนุนนี้ GAL4DB SPL10 แสดงให้เห็นว่าการเปิดใช้งานกิจกรรมในผู้ใหญ่ rosette ใบระดับของ miR156มีต่ำมาก แม้ว่ากิจกรรมต่ำกว่าที่GAL4DB-mSPL10 (Fig. 2D) ข้อมูลเหล่านี้บ่งชี้ว่า SPL10ทำหน้าที่เป็น transcriptional activator และทำหน้าที่เป็นควบคุม โดย miR156 การลบวิเคราะห์ระบุที่เปิดใช้งานกิจกรรมของ SPL10 เป็น N-เทอร์มินัลอะมิโน 51กรดที่ประกอบด้วยสาระสำคัญเหมือนลเอ (Fig. 2E) สาระสำคัญนี้อยู่ในทั้งหมด SPL10 เช่นโปรตีน (Supplementaryฟิก S2), แนะนำที่ พวกเขายังทำงานเป็น transcriptionalคริปต์ มากขึ้นกิจกรรมของ GAL4DB-SPL10 1 – 51กว่าที่ GAL4DB-mSPL10 อาจจะเนื่องจากโครงสร้างถึงเครื่องจักรเปิด transcriptional นิพจน์ของ repressor การ chimeric SPL10 ได้รับผลกระทบพัฒนาการยิงในระยะสืบพันธุ์ สารไทป์ spl10, spl11 และ spl2 ไม่ได้การ identifi ed มาก (Wang et al. 2008) คงจะเนื่องจากความซ้ำซ้อนการทำงาน เตียงดับเบิ้ลหรือทริปเปิ้ลสายพันธุ์อาจแสดงข้อบกพร่องของ อย่างไรก็ตาม การอาร์เจแอลอัล CL S F1 F2 FrSPL10SPL11SPL2PP2AA3A Fig. 1 นิพจน์ปริภูมิ SPL10, SPL11 และ SPL2 (A) การวิเคราะห์ RT – PCRของนิพจน์ SPL10, SPL11 และ SPL2 ในเนื้อเยื่อต่าง ๆจัดลำดับรหัสถูกใช้เป็นอุตสาหกรรมมหาบัณฑิต amplifi PP2AA3ตัวควบคุมที่โหลด R ราก เจแอล เยาวชนใบ (ใบที่สาม และสี่);AL ผู้ใหญ่ทิ้ง (เจ็ด-ไนน์ใบไม้); CL, cauline ใบS, infl orescence ลำ F1, fl owers ในระยะ 1-12 F2, fl owers ในขั้นตอน13-15 Fr ผลไม้ ดอกไม้เวทีตามกับ Smyth et al. (1990) (B – E)GUS ย้อมสี ProSPL10:GUS พืช (B, C) และ ProSPL11:GUS (D, E)รดน้ำต้นไม้ อายุสองสัปดาห์ (B, D) อายุ 1 เดือนและ (C, E) พืชได้ GUSสี แถบมาตราส่วนแสดงถึง 5 มม.2

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

โปรโมเตอร์ถูกกำหนดให้พื้นที่ 1.9 กิโลต้นน้ำของ
SPL10 ลำดับการเข้ารหัส [ขึ้นอยู่กับยีนที่ใกล้เคียงที่สุด (At1g27380)]
และความยาวของโปรโมเตอร์ SPL11
ที่ถูกกำหนดด้วยการอ้างอิงถึงการก่อการSPL10 สอดคล้องกับผลการวิเคราะห์ RT-PCR กิจกรรม GUS ถูกตรวจพบในที่ต่างๆเนื้อเยื่อรวมทั้งรากใบดอกกุหลาบใบcauline, Owers ชั้นและผลไม้ในพืชทั้งดัดแปรพันธุกรรม(รูป. 1B-E) สูงกิจกรรมก่อการถูกตรวจพบในรากและเยาวชนใบดอกกุหลาบในขณะที่การสะสมmRNA ในอวัยวะเหล่านี้อยู่ในระดับต่ำ นี้แสดงให้เห็นว่า SPL10 SPL11 และมีการควบคุมการโพสต์ transcriptionally แม้ว่าเรื่องนี้อาจเกิดจากกับปัญหาการขาดแคลนลำดับกฎระเบียบสำหรับSPL10 SPL11 และการแสดงออก. ฟังก์ชั่นของ SPL10 ถูกควบคุมโดย microRNA เราตรวจสอบกิจกรรมการเปิดใช้งานการถอดรหัสของSPL10 โดยการวิเคราะห์การแสดงออกชั่วคราว SPL10 มีเป้าหมายเว็บไซต์miR156 / 157; ดังนั้นเราจึงผลิต miR156 / 157 - รุ่นทนของ SPL10 (เรียกว่า mSPL10) ที่จะยกเลิกกฎระเบียบโดยmiR156 / 157 (Fig. 2A) ภูมิภาคเข้ารหัสของSPL10 mSPL10 และหลอมรวมกับที่ของ GAL4 ยีสต์โดเมนดีเอ็นเอผูกพัน(GAL4DB) ในกรอบ จากนั้นพวกเขาได้ร่วมถล่มลงไปในใบดอกกุหลาบที่มีพลาสมิดนักข่าวที่มีGAL4 เว็บไซต์ที่มีผลผูกพันในภูมิภาคเหนือluciferase นี้ (LUC) ยีนนักข่าว (รูป. 2B) เรา assayed แสดงออก luciferase ในเด็กและเยาวชนและผู้ใหญ่ออกเพราะระดับmiR156 มีความสูงในระยะที่เด็กและเยาวชนและลดลงในช่วงการเจริญเติบโตยิง(Wu และ Poethig 2006). ในดอกกุหลาบเด็กและเยาวชนออกจากที่ miR156 จะแสดงที่อยู่ในระดับสูง(Wu และ Poethig 2006) กิจกรรม LUC เหนี่ยวนำโดยGAL4DB-SPL10 ก็คล้ายคลึงกับที่ของ GAL4DB การควบคุมในขณะที่ GAL4DB-mSPL10 แสดงให้เห็นว่า 3.8 เท่าสูงกิจกรรม(รูป. 2C) นี้แสดงให้เห็นว่า SPL10 ถูกควบคุมลงโดยmiR156 การสนับสนุนนี้ GAL4DB-SPL10 แสดงให้เห็นว่าการเปิดใช้งานกิจกรรมในผู้ใหญ่ดอกกุหลาบใบที่ระดับของmiR156 ที่ต่ำกว่ามากแม้ว่าจะเป็นกิจกรรมที่ต่ำกว่าของGAL4DB-mSPL10 (รูป. 2D) ข้อมูลเหล่านี้แสดงให้เห็นว่า SPL10 ทำหน้าที่เป็นกระตุ้นการถอดรหัสและฟังก์ชั่นของมันจะถูกควบคุมโดย miR156 การวิเคราะห์การลบแสดงให้เห็นว่ากิจกรรมการเปิดใช้งาน SPL10 อยู่ใน N-มินัล 51 อะมิโนกรดที่มีมาตรฐานเหมือนAHA (รูป. 2E) บรรทัดฐานนี้เป็นป่าสงวนในทุกโปรตีน SPL10 เหมือน (เสริมรูป. S2) ชี้ให้เห็นว่าพวกเขายังทำงานเป็นถอดรหัสactivators กิจกรรมที่สูงมากของ GAL4DB-SPL10 1-51 กว่า GAL4DB-mSPL10 อาจจะเป็นเพราะโครงสร้างการเข้าถึงเครื่องจักรยืนยันการใช้งานการถอดรหัส. การแสดงออกของ SPL10 อดกลั้นลูกผสมได้รับผลกระทบการพัฒนายิงในระยะสืบพันธุ์ผิดปกติฟีโนไทป์ของspl10, spl11 และ spl2 ยังไม่ได้รับการidentifi เอ็ดเพื่อให้ห่างไกล (Wang et al. 2008) นี่อาจจะเป็นเพราะความผิดพลาดของการทำงานของพวกเขา สองหรือสามกลายพันธุ์อาจแสดงข้อบกพร่องทางสัณฐานวิทยา อย่างไรก็ตามR JL AL CL S ​​F1 F2 Fr SPL10 SPL11 SPL2 PP2AA3 รูป 1 การแสดงออกเชิงพื้นที่ของ SPL10, SPL11 และ SPL2 (ก) การวิเคราะห์ RT-PCR ในการแสดงออกของ SPL10 ที่ SPL11 และ SPL2 ในเนื้อเยื่อต่างๆ. ยาวเต็มรูปแบบลำดับการเข้ารหัสเป็นเอ็ด amplifi PP2AA3 ถูกใช้เป็นระบบควบคุมการโหลด อาราก; JL ใบเด็กและเยาวชน (ใบที่สามและสี่); AL ใบผู้ใหญ่ (เจ็ดใบที่เก้า); CL, cauline ใบ; S ลำต้น orescence infl; F1, Owers ชั้นในขั้นตอน 1-12; F2, Owers ชั้นในขั้นตอนที่13-15; Fr ผลไม้ เวทีดอกไม้เป็นไปตามการเบิร์นสและอัล (1990) (B-E) การย้อมสีของ GUS ProSPL10: พืชกัส (B, C) ​​และ ProSPL11: กัส (D, E) พืช สองสัปดาห์อายุ (B, D) และ 1 เดือนเก่า (C, E) พืช GUS สี บาร์ขนาด 5 มมเป็นตัวแทน. 2

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ผู้ถูกตั้งไว้ 1.9 KB เขตเหนือ
spl10 รหัสลำดับ [ ถึงยีนใกล้ ( at1g27380 ) ] ,
และความยาวของ spl11 การตั้งใจกับ
การอ้างอิงถึง spl10 โปรโมเตอร์ สอดคล้องกับผลลัพธ์ของ RT PCR
–การวิเคราะห์กิจกรรมกัสที่ตรวจพบในเนื้อเยื่อต่างๆ
ได้แก่ ราก ใบ cauline Rosette , ใบ , FL
ทาวเวอร์และผลไม้ทั้งในต้นพืช ( รูปที่ 1A ( E ) กิจกรรมส่งเสริมการขายสูง
ถูกตรวจพบในรากและเยาวชน
Rosette ใบ ขณะที่ mRNA ที่สะสมในอวัยวะ
เหล่านี้ต่ำ นี้แสดงให้เห็นว่า spl10 spl11 และมีระเบียบ
โพสต์ transcriptionally ถึงแม้ว่านี้อาจเนื่องจาก
การขาดแคลนลำดับกฎระเบียบเพื่อ spl10 และการแสดงออก spl11
.
หน้าที่ของ spl10 MIC
ถูกควบคุมโดยเราตรวจสอบลองกระตุ้นกิจกรรมของ
spl10 โดย assay การแสดงออกชั่วคราว spl10 มีเป้าหมาย
เว็บไซต์สำหรับ mir156 / 157 ; ดังนั้น , เราผลิต mir156 / 157 -
ทนรุ่น spl10 ( เรียกว่า mspl10 ) ยกเลิก
ระเบียบโดย mir156 / 157 ( รูปที่ 2A ) รหัสภูมิภาคของ
spl10 mspl10 ) และผสมกับที่ของยีสต์ gal4
ดีเอ็นเอมัดโดเมน ( gal4db ) ในกรอบจากนั้นระดมยิงเข้าไปใน Rosette ใบ
Co กับนักข่าวที่มีพลาสมิด
gal4 เต็มเปี่ยมในพื้นที่ต้นน้ำของ
ลูซิเฟอเรส ( ลุค ) ยีนนักข่าว ( รูปที่ 2B ) การแสดงออกของเอนไซม์ลูซิเฟอเรสในซีรั่ม
เราทั้งเยาวชนและผู้ใหญ่ใบ
เพราะ mir156 ระดับสูงในเฟสและเยาวชน
ลดลงในช่วงยิงวุฒิภาวะ ( วูและ poethig
2006 )ในเยาวชน Rosette ใบที่ mir156 แสดงที่
ระดับสูง ( Wu และ poethig 2006 ) , ลุค กิจกรรมกระตุ้น
โดย gal4db-spl10 เป็นคล้ายกับที่ของการควบคุม gal4db
, ในขณะที่ gal4db-mspl10 พบ 3.8-fold กิจกรรมสูง
( รูปที่ 2 ) นี้แสดงให้เห็นว่า spl10 ลงระเบียบ
โดย mir156 . การสนับสนุนนี้ gal4db-spl10 พบกระตุ้น
กิจกรรมใน Rosette ผู้ใหญ่ใบที่ระดับของ mir156
ลดลงมาก แม้ว่ากิจกรรมที่น้อยกว่า
gal4db-mspl10 ( รูปที่ 2 ) ข้อมูลเหล่านี้บ่งชี้ว่า spl10
ทำหน้าที่เป็น activator particle และหน้าที่คือ ควบคุมโดย mir156
. การวิเคราะห์การเปิดใช้งาน พบว่า กิจกรรมของ spl10
ในกรดอะมิโนกรดอะมิโน
51 ที่มี AHA เป็นแม่ลาย ( ฟิค2 ) นี้เป็นบรรทัดฐานใน spl10
อนุรักษ์เช่นโปรตีน ( อาหารเสริม
รูป S2 ) แนะนำว่า พวกเขายังทำหน้าที่เป็น particle
มีชีวิตชีวา . สูงมาก กิจกรรมของ gal4db-spl10 1 – 51
กว่าของ gal4db-mspl10 อาจเนื่องมาจากการเข้าถึงโครงสร้าง
กับเครื่องจักร การกระตุ้นการแสดงออกของ spl10 particle .

ผู้ควบคุมที่ได้รับผลกระทบยิงในการพัฒนาระยะเจริญพันธุ์
ความผิดปกติของ spl10 ฟีโนไทป์ , และ spl11 spl2 ไม่ได้
ถูก identifi เอ็ดเพื่อให้ห่างไกล ( Wang et al . 2008 ) นี้อาจเป็นเพราะความซ้ำซ้อนของการทำงานของพวกเขา
. สองหรือสาม
กลายพันธุ์อาจแสดงลักษณะข้อบกพร่อง อย่างไรก็ตาม
r s F1 F2 JL อัล CL fr



spl10 spl11 spl2 pp2aa3

รูปที่ 1 มีพื้นที่การแสดงออกของ spl10 spl11 spl2 , และ .( ก ) RT PCR และการวิเคราะห์
ของการแสดงออกของ spl10 spl11 spl2 , และในเนื้อเยื่อต่างๆ มี amplifi ลำดับความยาวเต็มนะครับ

. pp2aa3 ใช้การควบคุม R ราก ; jl , ใบเยาวชน ( ใบที่ 3 และ 4 ) ;
อัล ผู้ใหญ่ใบ ( 7 ใบที่เก้า ) ; C1 , cauline ใบ ;
s infl orescence ลำต้น ; F1 , FL ทาวเวอร์ที่ขั้นที่ 1 – 12 ; F2 , FL ทาวเวอร์ในขั้นตอน
13 – 15 ; FR , ผลไม้เวทีดอกไม้ตามสมิท et al . ( 1990 ) ( B ) e )
กัส staining prospl10 : พืชกัส ( B , C ) และ prospl11 : กัส ( d , e )
พืช สองสัปดาห์เก่า ( B , D ) และ 1-month-old ( C , E ) พืชกัส
เปรอะเปื้อน แสดงแถบมาตราส่วน 5 mm .
2