It was shown that curcumin influenc

It was shown that curcumin influences a wide range of membrane proteins, by modulating the properties of the hostlipid bilayer [22,23]. As the HA protein is expressed on the envelope of the influenza virus, it is worthwhile to explore whether curcumin’s inhibitory effect is only on the HA activity of the influenza virus or it is deleterious to membrane proteins of other viruses. In this work, the effects of curcumin on the infectivity of several viruses were investigated and their potential underlying mechanisms were also discussed.
Materials and Methods
Cell Culture and Virus Infection
Madin-Darby canine kidney (MDCK; CCL-34) cells and African green monkey kidney cells BSC-1 (CCL-26), bought from American Type Culture Collection (ATCC), and Vero cells (ATCC CCL-81), a gift from Dr. S.S. Chiou, Graduate Institute of Microbiology and Public Health, Natinoal Chung-Hsing Univer- sity (NCHU), were cultured in minimal-essential medium (MEM) with 10% heat-inactivated fetal bovine serum (FBS), penicillin 100 U/ml, and streptomycin 10 mg/ml. Porcine kidney (PK-15; BCRC 60057) cells, originally obtained from Bioresource Collec- tion and Research Center (BCRC) of the Food Industry Research and Development Institute of Taiwan, were maintained in Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM, Hyclone) supple- mented with penicillin 100 U/ml, streptomycin 10 mg/ml, and 5% of heat-inactivated FBS. Before infection, cells were washed with PBS and cultured in medium supplemented with antibiotics but without FBS (addition of 1 mg/ml of Worthington trypsin for influenza virus).
Human influenza virus PR8, A/Puerto Rico/8/34 (H1N1), was amplified in MDCK cells. Viruses for haemagglutination in- hibition (HI) test were amplified in 10-day-old embryonated chicken eggs at 37uC for 2 days. The allantoic fluid was harvested and the titer of viruses was determined by standard plaque formation assay or hemagglutination (HA) test. Vaccinia virus, kindly provided by Dr. L Tiley in Department of Veterinary Medicine, Cambridge, UK, was grown in BSC-1 cells. Enterovirus 71 viruses (EV71), a gift from Dr. C. W. Lin, Department of Medical Laboratory Science and Biotechnology, China Medical University, were amplified in Vero cells. Pseudorabies viruses (PRV), obtained from Dr. T.J. Chang, were cultured in PK-15 cells. Japanese encephalitis virus (JEV) and Dengue virus type II (DVII), provided by Dr. S. S. Chiou, Graduate Institute of Microbiology and Public Health, NCHU, were cultured in Vero cells. Newcastle Disease viruses (NDV) for HA inhibition test were kindly provided by Dr. J. H. Shien, in Department of Veterinary Medicine, NCHU.
Chemicals
Curcumin, obtained from Sigma-Aldrich, were dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) at a stock concentration of 100 mM and stored in 280uC and were freshly diluted with infection medium prior to experiment.
Cytotoxicity Test
Curcumin, 100 mM dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO), were freshly diluted with medium prior to experiment. 1.56105 of cells grown in 24-well plates for 24 hours were washed with PBS and were treated with serially diluted curcumin or DMSO at 37uC, 5% CO2 for 24 hours. Amplification of cells was measured directly by the total cell counts and the survival rate was estimated by the ratio of living cells/total cell counts by staining of 0.4% trypan blue. The cytotoxicity was estimated by comparison of the cell survival rate of curcumin-treated cells with that of DMSO- treated. The mock- treatment control was arbitrary set as 100%.
Plaque Assay
MDCK cells grown to 80% confluence were washed twice with PBS followed by infection with serial dilutions of supernatants containing virus progenies in infectious medium i.e. MEM supplemented with 1 mg/ml of trypsin (Worthington, Freehold, NJ, USA) and antibiotics. After 2 hours absorption at 37uC, unbound viruses inoculums were removed and cells were then cultured with 1 ml/well MEM supplemented with 0.6% agarose at 37uC, 5% CO2 for 2 days. Viral plaques were visualized by staining with Giemsa (Sigma).
Time-of-drug Addition Test on JEV and Dengue Virus Infection
Ten microliter of Curcumin (or DMSO, the solvent control) or were added to the medium at various times of JEV infection (200 pfu). Briefly, (1) full-time treatment: curcumin was included in the cell culture medium for 8 h and throughout the time of infection; (2) co-treatment: curcumin mixed with JEV in the infection medium was simultaneously added onto the cells and left on the cells throughout; (3) post-infection: curcumin was added to cells at 2 hours post infection and remained throughout the time of infection. After virus adhesion, virus inoculums were removed and vero cells were cultured in MEM (without FBS) containing 1% methylcellulose. The infectivity was measure according to the plaque formation units.
Plaque Reduction Assay
To estimate the infectivity of viruses after curcumin treatment, 2000 pfu of PR8, vaccinia virus, EV71, JEV, DVII, or PRV particles were pre-incubated with 30 mM (unless otherwise stated) of curcumin at room temperature for one hour. Remaining infectivity after curcumin treatment was determined by plaque assay. To be able to measure the plaque formation number, the curcumin-treated viruses mix was further diluted to 1021, 1022, 1023 with medium without FBS and added to appropriate cell lines. After 1 hour absorption at 37uC, the virus inoculums were removed and cells were then cultured with 1 ml/well MEM supplemented with 0.6% agarose for influenza (or medium containing 1% methylcellulose for other viruses) at 37uC, 5% CO2 for 2 days or until the plaque was visible. Viral plaques were fixed by methanol and stained with crystal violet (Sigma).
Hemagglutination Inhibition (HI) Test
The hemagglutination (HA) titer of virus stock were initially determined by standard HA assay and 4 HA units (HAU) of viruses were then used for HI test. Briefly, curcumin stocks were diluted in PBS to a concentration of 1 mM (the highest concentration in the assay), and serial dilutions of curcumin were prepared by addition of 25 ml curcumin (1 mM) into the well of round-bottomed 96-well micro-plates, followed by 2-fold serial dilutions with PBS for 7 times. Twenty-five ml of virus stock were added into each well and incubated at room temperature for 1 hour. Subsequently, 50 ml of 0.75% chicken erythrocyte stocks were added to each well. The hemagglutination reaction was observed after 30 min incubation.
Transfection Test
Cells were seeded into 24-well plates and grown to 90% confluence. The 4 ml of Cellfectin (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) and 0.8 mg of pEGFP-C1 plasmid (Clontech) were each diluted with 100 ml of Opti-MEM (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Both of the diluted components were mixed and incubated at room temperature for 20 min. Subsequently, 30 mM or DMSO

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

มีแสดงเคอร์คูมินที่มีผลต่อช่วงกว้างของเมมเบรนโปรตีน โดยเกี่ยวคุณสมบัติของ bilayer hostlipid [22,23] เป็นโปรตีน HA แสดงในซองจดหมายของไวรัสไข้หวัดใหญ่ ได้แนะนำมาว่าผลของเคอร์ลิปกลอสไขในกิจกรรม HA ของไวรัสไข้หวัดใหญ่ หรือเป็นร้ายกับเมมเบรนโปรตีนของไวรัสอื่น ๆ ในงานนี้ ผลของเคอร์คูมินบน infectivity ไวรัสหลายถูกสอบสวน และกลไกพื้นฐานของพวกเขามีศักยภาพก็ยังกล่าว
วัสดุและวิธีการ
เพาะเลี้ยงเซลล์และการติดเชื้อไวรัส
บี้ Madin สุนัขโรคไต (MDCK CCL-34) เซลล์ และเซลล์ไตแอฟริกาลิงกรีนบีเอสซี-1 (CCL-26), ซื้อจากอเมริกาชนิดวัฒนธรรมชุด (ATCC), และเซลล์ Vero (ATCC CCL-81), ของขวัญจาก Dr สโมสรฟุตบอล Chiou บัณฑิตวิทยาลัยสถาบันจุลชีววิทยา และสาธารณ สุข Natinoal Chung Hsing Univer - sity (NCHU), มีอ่างในสำคัญน้อยที่สุด (MEM) ด้วย 10% ยกเลิกร้อนครรภ์วัวซีรั่ม (FBS), ยาเพนนิซิลลิน 100 U/ml และ streptomycin 10 มก. / มล.ช่วงไต (PK-15 BCRC 60057) เซลล์ เดิม รับจาก Bioresource Collec - สเตรชันและวิจัยศูนย์ (BCRC) อาหารอุตสาหกรรมวิจัยและพัฒนาสถาบันของไต้หวัน ถูกเก็บรักษาไว้ในของดุลเบกโกแก้ไขอีเกิลของกลาง (DMEM, Hyclone) นุ่ม-mented กับยาเพนนิซิลลิน 100 ที่ U/ml, streptomycin 10 mg/ml และ 5% ของ FBS ร้อนยกเลิก ก่อนที่จะติดเชื้อ เซลล์ถูกล้าง ด้วย PBS และอ่างในเสริม ด้วยยาปฏิชีวนะ แต่ ไม่ FBS (เพิ่ม 1 mg/ml ของทริปซินธธิงสำหรับไวรัสไข้หวัดใหญ่) .
มนุษย์ไข้หวัดใหญ่ไวรัส PR8, A/Puerto เปอร์โตริโก/8/34 (H1N1), ถูกขยายในเซลล์ MDCK ไวรัสสำหรับทดสอบ haemagglutination (HI) ใน hibition ถูกขยายในไข่ไก่อายุ 10 วัน embryonated ที่ 37uC 2 วัน น้ำมัน allantoic ถูกเก็บเกี่ยว และ titer ของไวรัสถูกกำหนด โดยมาตรฐานหินปูนก่อตัววิเคราะห์ หรือทดสอบ hemagglutination (ฮา) ไวรัส vaccinia กรุณาให้ โดยดร. Tiley L ในแผนกสัตวแพทยศาสตร์ เคมบริดจ์ สหราชอาณาจักร ถูกปลูกในบีเอสซี-1 เซลล์ ไวรัสเอนเทอโรไวรัส 71 (EV71), ของขวัญจากดร. C. W. Lin กรมแพทย์ห้องปฏิบัติการวิทยาศาสตร์ และเทคโนโลยี ชีวภาพ มหาวิทยาลัยการแพทย์จีน ถูกขยายในเซลล์ Vero ไวรัส pseudorabies (PRV), ได้รับจากดร. T.J. ช้าง มีอ่างใน PK-15 เซลล์ ไวรัสโรคไข้สมองอักเสบญี่ปุ่น (JEV) และไข้เลือดออกไวรัสชนิด II (DVII), โดยดร. S. S. Chiou สถาบันบัณฑิตจุลชีววิทยาและสาธารณสุข NCHU มีอ่างในเซลล์ Vero ไวรัสโรคนิวคาสเซิล (NDV) สำหรับการทดสอบการยับยั้งฮาได้กรุณาให้ โดย Dr. J. H. Shien ในแผนกสัตวแพทยศาสตร์ NCHU
เคมี
เคอร์คูมิน รับจากซิก-Aldrich ถูกละลายใน dimethyl sulfoxide (DMSO) ที่เข้มข้น 100 มม.และ 280uC เก็บไว้ในสต็อก และสดที่ผสมกับเชื้อกลางก่อนทดลอง
Cytotoxicity ทดสอบ
เคอร์คูมิน ละลายใน dimethyl sulfoxide (DMSO), 100 มม.ได้สดผสมกับกลางก่อนการทดลอง 1.56105 ของเซลล์ดี 24 แผ่นปลูก 24 ชั่วโมงถูกล้าง ด้วย PBS และได้รับการรักษา ด้วยเคอร์คูมินแตกออก serially หรือ DMSO ที่ 37uC, 5% CO2 ตลอด 24 ชั่วโมง ขยายของเซลล์ถูกวัดได้โดยตรง โดยการตรวจนับเซลล์ทั้งหมด และมีประเมินอัตรารอด โดยอัตราส่วนของชีวิตเซลล์/รวม เซลล์นับ โดยการย้อมสีของ trypan 0.4% สีน้ำเงิน Cytotoxicity ที่ถูกประเมิน โดยการเปรียบเทียบอัตรารอดเซลล์เซลล์ถือว่าเคอร์คูมินที่ของ DMSO-รักษา ควบคุมรักษา mock เป็นชุดกำหนดเป็น 100%.
Plaque Assay
เติบโตขึ้น 80% ผสานเซลล์ MDCK ถูกล้าง ด้วย PBS ตามติดด้วย dilutions ประจำของ supernatants ประกอบด้วย progenies ไวรัสในโรคติดเชื้อเช่นหน่วยความจำเสริม ด้วย 1 mg/ml ของทริปซิน (ธธิง กรรมสิทธิ์ NJ สหรัฐอเมริกา) และยาปฏิชีวนะสอง หลังจากดูดซึม 2 ชั่วโมงที่ 37uC ออกไวรัสผูก inoculums และเซลล์ได้แล้วอ่าง มี 1 ml/หน่วย ความจำที่ดีเสริม ด้วย agarose 0.6% ที่ 37uC, 5% CO2 2 วัน Plaques ไวรัสมี visualized โดยย้อมสี Giemsa (ซิกมา) กับ.
ทดสอบ JEV และติดเชื้อไวรัสไข้เลือดออกเพิ่มเวลาของยา
10 ไมโครลิตรของเคอร์คูมิน (หรือ DMSO ควบคุมตัวทำละลาย) หรือเพิ่มการสื่อเวลาต่าง ๆ ของการติดเชื้อ JEV (200 pfu) สั้น ๆ, (1) เต็มเวลารักษา: รวมอยู่ในสื่อวัฒนธรรมเซลล์ 8 h และ ตลอดเวลาติดเชื้อ เคอร์คูมิน (2) ร่วมรักษา: เคอร์คูมินผสมกับ JEV ในการติดเชื้อพร้อมเพิ่มไปยังเซลล์ และทิ้งเซลล์ตลอด (3) หลังติดเชื้อ: เคอร์คูมินถูกเพิ่มไปยังเซลล์ที่ติดเชื้อลง 2 ชั่วโมง และยังคงอยู่ตลอดเวลาของการติดเชื้อ หลังจากยึดติดไวรัส ไวรัส inoculums ออก แล้วเซลล์ vero มีอ่างในหน่วยความจำ (โดย FBS) ประกอบด้วย 1% methylcellulose Infectivity ที่ถูกวัดตามหินปูนก่อตัวหน่วยงาน
วิเคราะห์ลดหินปูน
ประเมิน infectivity ไวรัสหลังจากที่รักษาเคอร์คูมิน 2000 pfu ของ PR8, vaccinia ไวรัส EV71, JEV, DVII หรือ PRV อนุภาคได้ก่อน incubated 30 มม. (เว้นแต่ระบุไว้เป็นอย่างอื่น) ของเคอร์คูมินที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลาหนึ่งชั่วโมง รักษาเหลือ infectivity หลังเคอร์ถูกกำหนด โดยวิเคราะห์หินปูน เพื่อให้สามารถวัดหมายกำเนิดหินปูน ผสมเคอร์คูมินถือว่าไวรัสถูกเติมผสมไป 1021, 1022 ทีกับสื่อโดย FBS และบรรทัดเซลล์เพิ่มเพื่อความเหมาะสม หลังจากดูดซึม 1 ชั่วโมงที่ 37uC, inoculums ไวรัสถูกลบออก และเซลล์ได้แล้วอ่าง มี 1 ml/หน่วย ความจำที่ดีเสริม ด้วย 0.6% agarose สำหรับไข้หวัดใหญ่ (หรือ 1% ที่มีขนาดกลาง methylcellulose ไวรัสอื่น ๆ) 37uC, 5% CO2 2 วัน หรือจน กว่าหินปูนถูกมองเห็น Plaques ไวรัสถาวร โดยเมทานอล และสี ด้วยคริสตัลไวโอเลต (ซิกมา) .
Hemagglutination ยับยั้ง (HI) ทดสอบ
titer hemagglutination (ฮา) ของไวรัสหุ้นถูกกำหนด โดยมาตรฐาน HA ทดสอบแรก และ 4 ฮาหน่วย (HAU) ของไวรัสแล้วใช้สำหรับ HI ทดสอบ สั้น ๆ ถูกผสมใน PBS หุ้นเคอร์คูมินเพื่อความเข้มข้นของ 1 มิลลิเมตร (สูงความเข้มข้นในการวิเคราะห์), และ dilutions ประจำของเคอร์คูมินถูกเตรียม โดยเพิ่มเคอร์ 25 ml (1 mM) เป็นอย่างดีของยนที่กลม 96 ดีไมโครแผ่น ตาม 2-fold dilutions ประจำด้วย PBS เวลา 7 มลยี่สิบห้าของหุ้นที่ไวรัสถูกเพิ่มเข้าไปในแต่ละบ่อ และ incubated ที่อุณหภูมิห้อง 1 ชั่วโมง ต่อ เพิ่ม 50 ml ของหุ้น 0.75% ไก่ของเม็ดเลือดแดงให้ดีละกัน ปฏิกิริยา hemagglutination ที่สังเกตหลังจากฟักตัว 30 นาที.
ทดสอบ Transfection
seeded เป็นดี 24 แผ่น และเติบโตขึ้น 90% ผสานเซลล์ 4 ml ของ Cellfectin (Invitrogen คาร์ลส CA, USA) และ 0.8 มิลลิกรัมของ plasmid pEGFP-C1 (Clontech) แต่ละผสมกับ 100 ml ของ Opti-หน่วยความจำ (Invitrogen คาร์ลส CA, USA) ส่วนประกอบแตกออกทั้งสองถูกผสม และ incubated ที่อุณหภูมิห้องใน 20 นาที ในเวลาต่อมา 30 มม.หรือ DMSO

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

พบว่าเคอร์คูมินอิทธิพลหลากหลายของเมมเบรนโปรตีน โดยของคุณสมบัติของ [ สองชั้น hostlipid 22,23 ] เป็นโปรตีนที่แสดงออกบนซองฮาของไวรัสไข้หวัดใหญ่ มันคุ้มค่าที่จะดูว่าผลของเคอร์คูมินออกฤทธิ์เพียงบนฮากิจกรรมของไวรัสไข้หวัดใหญ่ หรือมันคงสร้างโปรตีนของไวรัสอื่น ๆ ในงานนี้ผลของเคอร์คิวมินในการติดเชื้อของไวรัสต่าง ๆทำการศักยภาพกลไกยังกล่าวถึง
วัสดุและวิธีการเพาะเลี้ยงเซลล์และไวรัสติดเชื้อ

madin ดาร์บี้สุนัขไต ( mdck ; ccl-34 ) เซลล์และเซลล์ไตลิงเขียวแอฟริกัน bsc-1 ( ccl-26 ) ซื้อจากประเภทของคอลเลกชันวัฒนธรรมอเมริกัน ( ATCC ) เวโรเซลล์ ( ATCC ccl-81 ) ของขวัญจากดร.SS เฉียว , สถาบันบัณฑิตจุลชีววิทยา และสาธารณสุข natinoal Chung Hsing Univer - sity ( nchu ) ถูกเลี้ยงในน้อยที่สุดที่จำเป็นขนาดกลาง ( แหม่ม ) ร้อยละ 10 ของความร้อนซึ่งวัว เซรั่ม ( FBS ) , penicillin 100 U / ml และสเตร็ปโตมัยซิน 10 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตร ไตหมู ( pk-15 ; บาเซล 60057 ) เซลล์ตอนแรกที่ได้จากการรวบรวม และวิจัยทรัพยากรชีวภาพ ศูนย์ tion ( บาเซล ) ในอุตสาหกรรมอาหาร สถาบันวิจัยและพัฒนา ของไต้หวัน ถูกเก็บรักษาไว้ในดัลเบโค่การนกอินทรีขนาดกลาง ( dmem hyclone นิ่มนวล , - mented ) กับยา streptomycin 100 U / ml 10 mg / ml และ 5% ของความร้อนซึ่ง FBS ก่อนที่จะติดเชื้อเซลล์มีการล้างด้วย pbs และเพาะเลี้ยงในอาหารสูตร MS ที่เสริมด้วยยาปฏิชีวนะ แต่ไม่มี FBS ( เพิ่ม 1 mg / ml ของเอนไซม์ Worthington สำหรับไวรัสไข้หวัดใหญ่ )
pr8 เชื้อไวรัสไข้หวัดใหญ่ของมนุษย์ / เปอร์โตริโก / 8 / 34 ( H1N1 ) ถูกขยายใน mdck เซลล์ ไวรัส haemagglutination - hibition ( สวัสดี ) แบบขยาย ใน 10 วัน ไข่ที่ 37uc วงจรชีวิตอายุ 2 วันของเหลว allantoic เก็บเกี่ยวและชนิดของไวรัสถูกกำหนดโดยการใช้จุลินทรีย์มาตรฐานหรือการทดสอบการเกาะกลุ่ม ของเม็ดเลือดแดง ( ฮา ) ทดสอบ vaccinia ไวรัสกรุณาให้โดย ดร. แอลไทลีย์ในภาควิชาอายุรศาสตร์ , เคมบริดจ์ , UK , ที่ปลูกใน bsc-1 เซลล์ ไวรัสเอนเทอโรไวรัส 71 ( ev71 ) ของขวัญจาก ดร. ซี. ดับบลิว หลิน ภาควิชาวิทยาศาสตร์ห้องปฏิบัติการทางการแพทย์และเทคโนโลยีชีวภาพมหาวิทยาลัยการแพทย์จีนมีการขยายในเวโรเซลล์ pseudorabies ไวรัส ( PRV ) ที่ได้รับจากคุณหมอทีเจ ชาง pk-15 เพาะเลี้ยงในเซลล์ ไวรัสไข้สมองอักเสบ ( jev ) และไวรัสเดงกี่ชนิดที่ 2 ( dvii ) โดย ดร. S . S . เฉียว สถาบันบัณฑิตจุลชีววิทยาสาธารณสุข nchu ถูกเลี้ยงในเวโรเซลล์โรคไวรัสนิวคาสเซิล ( ndv ) สำหรับการทดสอบการยับยั้ง ฮา ได้กรุณาให้โดย ดร. เจ. เอช. ชิเ น ในภาควิชาสัตวแพทย์ nchu .

ที่สำคัญสารเคมีที่ได้รับจากซิกม่า Aldrich ถูกละลายในไดเมทิลซัลฟอกไซด์ ( DMSO ) ในหุ้นปริมาณ 100 มิลลิเมตร และเก็บไว้ใน 280uc และสดเจือจางด้วยการติดเชื้อกลางก่อน ทดลอง ทดสอบความเป็นพิษที่สำคัญ

,100 มิลลิเมตร ละลายไดเมทิลซัลฟอกไซด์ ( DMSO ) ถูกสดเจือจางกับกลางก่อนการทดลอง 1.56105 เซลล์เติบโตขึ้นใน 24 ดีจาน ตลอด 24 ชั่วโมง มีการล้างด้วย pbs และถือว่าเป็นเจือจางขมิ้นชันหรือ DMSO ที่ 37uc คาร์บอนไดออกไซด์ 5 เปอร์เซ็นต์ เป็นเวลา 24 ชั่วโมงเพิ่มปริมาณเซลล์ได้โดยตรง โดยนับรวมเซลล์และอัตรารอดประมาณ โดยอัตราส่วนของเซลล์ที่มีชีวิตโดยการย้อมเซลล์นับรวมของไตรแพน 0.4% สีฟ้า มะเร็งคือประมาณโดยการเปรียบเทียบเซลล์อัตราการอยู่รอดของขมิ้นชันรักษาเซลล์ที่มี DMSO - ปฏิบัติ เยาะเย้ย - ควบคุมการโดยพลการตั้งเป็น 100%

จุลินทรีย์ การทดสอบmdck เซลล์เติบโตขึ้น 80% บรรจบถูกล้างสองครั้งกับ PBS ตามมาด้วยการติดเชื้อกับอนุกรมวิธีการ supernatants ที่มีไวรัสที่มีการติดเชื้อ เช่น แหม่ม ในกลางเสริม 1 mg / ml ของเอนไซม์ ( Worthington , ฟรีโฮลด์ , NJ , USA ) และยาปฏิชีวนะ หลังจาก 2 ชั่วโมง 37uc การดูดซึมที่ ,จับกับไวรัส 18 ชั่วโมงถูกถอดออกและเซลล์เพาะเลี้ยงด้วยจำนวน 1 มิลลิลิตร / งั้นแหม่มเสริม 0.6% ( ที่ 37uc คาร์บอนไดออกไซด์ 5 เปอร์เซ็นต์ เป็นเวลา 2 วัน ไวรัสโล่ถูกมองเห็นโดยการย้อมด้วยยิมซา ( Sigma ) .
เวลานอกจากนี้การทดสอบยาเสพติดใน jev และการติดเชื้อไวรัสไข้เลือดออก
ไมโครลิตร เคอร์คิวมิน ( หรือ DMSO 10 ,การควบคุมสารเคมี ) หรือถูกเพิ่มไปยังสื่อที่เวลาต่าง ๆของการติดเชื้อ jev ( 200 พีเอฟยู ) สั้นๆ ( 1 ) เต็มเวลาการรักษาที่สำคัญรวมอยู่ในเซลล์เพาะเลี้ยง ( 8 H และตลอดเวลาของการติดเชื้อ ; ( 2 ) CO รักษา : ขมิ้นชันผสมกับ jev ในการติดเชื้อกลางพร้อมกันเพิ่มไปยังเซลล์และในเซลล์ซ้ายตลอด ; ( 3 ) การติดเชื้อโพสต์ :ที่สำคัญคือการเพิ่มเซลล์ที่ 2 ชั่วโมงภาวะติดเชื้อและยังคงอยู่ตลอดเวลาของการติดเชื้อ หลังจากติดไวรัส ไวรัสถูกลบออกและ 18 ชั่วโมงเวโรเซลล์เพาะเลี้ยงในเมม ( FBS ) ที่ประกอบด้วย 1% ตัว . และพยาธิวิทยาคือการวัดตามหินปูนก่อตัวหน่วย ลดคราบจุลินทรีย์ (

เพื่อประเมินการติดเชื้อของไวรัสหลังจากขมิ้นชันรักษา2000 ของ pr8 vaccinia พีเอฟยู , ไวรัส , ev71 jev dvii , , , หรือ PRV พบอนุภาคก่อนแยก 30 มม. ( เว้นแต่ระบุเป็นอย่างอื่น ) ของขมิ้นชันที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลาหนึ่งชั่วโมง ที่เหลือหลังจากการพิจารณาที่สำคัญการติดเชื้อจุลินทรีย์ ตามลำดับ จะสามารถที่จะวัดการสะสมคราบจุลินทรีย์เลข ขมิ้นชันรักษาไวรัสผสมเจือจางให้ฉันต่อไปอีก , ,1023 ปานกลางโดยไม่ FBS และเพิ่มเซลล์ที่เหมาะสม หลังจาก 1 ชั่วโมง การดูดซึมที่ 37uc ไวรัสและเซลล์ 18 ชั่วโมงถูกถอดออกแล้ว เลี้ยงด้วยอาหาร 1 มิลลิลิตร / แหม่ม , 0.6% สำหรับไข้หวัดใหญ่ ( หรืออาหารที่มีตัว 1% สำหรับไวรัสอื่น ๆ ) ที่ 37uc CO2 5 % เป็นเวลา 2 วัน หรือจนกว่าแผ่นถูกมองเห็นไวรัสโล่ถูกกำหนดโดยเมทานอลและย้อมด้วยคริสตัลสีม่วง ( Sigma ) .
การทดสอบการเกาะกลุ่ม ของเม็ดเลือดแดงยับยั้ง ( HI ) การทดสอบการเกาะกลุ่ม ของเม็ดเลือดแดง
ทดสอบ ( ฮา ) ระดับหุ้นไวรัสเริ่มต้นกำหนดโดยวิธีมาตรฐานและ 4 หน่วย ฮาฮา ( ว ) ของไวรัสแล้วใช้ทดสอบครับ สั้น ๆ , ขมิ้นชัน หุ้นถูกเจือจางใน PBS เพื่อความเข้มข้นของ 1 มิลลิเมตร ( ความเข้มข้นสูงสุดในการทดสอบ )อนุกรมที่สำคัญและวิธีการเตรียมเพิ่มขมิ้นชัน 25 มิลลิลิตร ( 1 มิลลิเมตร ) เป็นอย่างดีรอบสุด 96 ดีไมโครจาน ตามด้วยซีเรียลเจือจางกับ PBS ถึง 7 ครั้ง ยี่สิบห้ามิลลิลิตรของไวรัสถูกเพิ่มลงในแต่ละหุ้นดีและบ่มที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 1 ชั่วโมง จำนวน 50 ml 0.75 % เม็ดเลือดแดงไก่หุ้นเพิ่มแต่ละครั้งได้อีกด้วยการทดสอบการเกาะกลุ่ม ของเม็ดเลือดแดงที่ปฏิกิริยาสังเกตหลังจาก 30 นาที 4 .

สำหรับเซลล์ทดสอบถูก seeded 24 ดีจานโต 90% บรรจบกัน 4 ml cellfectin ( Invitrogen Carlsbad , CA , USA ) และ 0.8 มิลลิกรัม pegfp-c1 พลาสมิด ( clontech ) แต่ละคน เจือจางด้วย 100 มิลลิลิตรของ OPTI แหม่ม ( Invitrogen Carlsbad , CA , USA )ทั้งของส่วนประกอบผสมเจือจาง บ่มที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 20 นาที และ 30 มม. หรือ DMSO