Western Blot In a first step, milk

Western Blot
In a first step, milk and cheese proteins were
separated according to their relative mass
(Mr) by 12% SDS-PAGE after reduction. Milk
and homogenized cheese suspension (200
mg/mL) were diluted 1:10 in SDS-PAGE
loading buffer (60 mM Tris-HCl pH 6.8, 2%
(w/v) SDS, 10% (v/v) glycérol, 0.025% (w/v)
bromophenol blue and 5% (v/v) -mercaptoethanol and approximately 7.5 µg of
proteins were loaded on the gel. Molecular
weight makers were LMW marker (GE
Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala,
Sweden) and Precision Plus Protein
Standards (Biorad, Hercules, CA, USA).
After separation proteins were electrotransferred on nitrocellulose membrane
(Biorad) for 1 h at 250 mA in a buffer
containing 25mM Tris, 192 mM glycine, 20%
(v/v) ethanol. Membrane were incubated
with either monoclonal antibodies specific of
each casein or with the serum of the patient.
Anti-bovine casein monoclonal antibodies
mAb567 anti-S1-casein (zone 149-166),
mAb521 anti-S2-casein (zone 96-114),
mAb657 anti--casein (zone 133-150) and
mAb257 anti--casein (zone 98-115) were a
kind gift of Dr D. Dupont (INRA and
Agrocampus, Rennes, France) (Johansson et
al., 2009).
For staining with monoclonal antibodies,
membranes were incubated for 1 h with a
blocking solution of PBS (0.136 M NaCl, 2.68
mM KCl, 1.46 mM KH2PO4, 8.1 mM Na2HPO4,
pH 7.4) containing 0.05% (v/v) Tween-20
(PBS/T) and 4% polyvinylpyrolidone (PVP)
(w/v). After 2 washings for 10 min with
PBS/T, membranes were incubated for 1 h
with hybridoma supernatant containing the

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

คืนในตาตะวันตก ในขั้นตอนแรก มีโปรตีนนมและชีส แบ่งตามการมวลชนสัมพันธ์ (Mr) 12% SDS-หน้าหลังลด นม และระงับ homogenized เป็นกลุ่มชี (200 mg/mL) ได้แตกออก 1:10 ใน SDS-หน้า โหลดบัฟเฟอร์ (60 มม.ทริสเรทติ้ง HCl pH 6.8, 2% (w/v) SDS, 10% (v/v) glycérol, 0.025% (w/v) bromophenol บลู และ 5% (v/v) -mercaptoethanol และประมาณ 7.5 ไมโครกรัมเป็นเครื่องของ โปรตีนถูกโหลดในเจ โมเลกุล น้ำหนักผู้ที่มีเครื่องหมาย LMW (GE สุขภาพชีวภาพศาสตร์ AB, Uppsala สวีเดน) และความแม่นยำบวกกับโปรตีน มาตรฐาน (Biorad เฮอร์คิวลิส CA, USA) หลังจากแยก โปรตีนได้ electrotransferred ในเมมเบรน nitrocellulose (Biorad) สำหรับ h 1 ที่ 250 mA ในบัฟเฟอร์ ประกอบด้วย 25 มม.ตรี glycine 192 มม. 20% เอทานอล (v/v) เมมเบรนถูก incubated โดยเฉพาะแอนตี้ monoclonal ใดของ แต่ละเคซีน หรือซีรั่มของผู้ป่วย แอนตี้ monoclonal เคซีนป้องกัน bovine mAb567 ต่อต้าน-S1-เคซีน (โซน 149-166), mAb521 ต่อต้าน-S2-เคซีน (โซน 96 114), mAb657 ป้อง--เคซีน (โซน 133-150) และ mAb257 ป้อง--เคซีน (โซน 98-115) ได้ ของขวัญประเภทของ Dr D. ดูปองท์ (INRA และ Agrocampus แรนส์ ฝรั่งเศส) (Johansson ร้อยเอ็ด al., 2009) การย้อมสีด้วย monoclonal แอนตี้ เยื่อหุ้มถูก incubated สำหรับ h 1 กับการ บล็อกของ PBS (0.136 M NaCl, 2.68 mM KCl, KH2PO4 มม 1.46, Na2HPO4 8.1 มม. pH ที่ 7.4) มี 0.05% (v/v) Tween-20 (PBS T) และ 4% polyvinylpyrolidone (PVP) (w/v) หลังจาก washings 2 ใน 10 นาทีด้วย PBS/T เยื่อหุ้มถูก incubated สำหรับ 1 h ด้วยประกอบด้วย supernatant hybridoma

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ดวงตะวัน
ในขั้นตอนแรก, นมและโปรตีนชีสถูก
แยกออกไปตามมวลญาติของพวกเขา
(นาย) โดย 12% SDS-PAGE หลังจากที่ลดลง นม
และระงับชีสหดหาย (200
มิลลิกรัม / มิลลิลิตร) ถูกเจือจาง 1:10 ใน SDS-PAGE
โหลดบัฟเฟอร์ (60 mM Tris-HCl พีเอช 6.8, 2%
(w / v) SDS, 10% (v / v) กลีเซอรอล, 0.025 % (w / v)
Bromophenol สีฟ้าและ 5% (v / v) -mercaptoethanol และประมาณ 7.5 ไมโครกรัมของ
โปรตีนที่ถูกโหลดในเจล. โมเลกุลที่
ผลิตน้ำหนักเป็นเครื่องหมายแอพ (GE
Healthcare Bio-วิทยาศาสตร์ AB, Uppsala,
สวีเดน) และ Precision พลัสโปรตีน
มาตรฐาน (Biorad, Hercules, CA, USA).
หลังจากการแยกโปรตีนถูก electrotransferred ในเมมเบรน nitrocellulose
(Biorad) เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่ 250 mA ในบัฟเฟอร์
ที่มี 25mm Tris, ไกลซีน 192 มิลลิ, 20%
(v / v) เอทานอล . เมมเบรนถูกบ่ม
กับทั้งโคลนอลแอนติบอดีที่เฉพาะเจาะจงของ
แต่ละเคซีนหรือซีรั่มของผู้ป่วย.
เคซีนป้องกันวัวโคลนอลแอนติบอดี
mAb567 ต่อต้านS1-เคซีน (โซน 149-166)
mAb521 ต่อต้านS2-เคซีน (โซน 96 -114)
mAb657 ต่อต้าน-เคซีน (โซน 133-150) และ
mAb257 ต่อต้าน-เคซีน (โซน 98-115) เป็น
ของที่ระลึกชนิดของดร D. Dupont (INRA และ
Agrocampus, Rennes, ฝรั่งเศส) (Johansson และ
al., 2009).
สำหรับการย้อมสีด้วยโคลนอลแอนติบอดี,
เยื่อถูกบ่มเป็นเวลา 1 ชั่วโมงกับ
การแก้ปัญหาการปิดกั้นของพีบีเอส (0.136 M NaCl, 2.68
มิลลิ KCl, 1.46 มิลลิ KH2PO4 8.1 มิลลิ Na2HPO4,
ค่า pH 7.4) ที่มี 0.05% (v / v) การ Tween-20
(พีบีเอส / T) และ 4% polyvinylpyrolidone (PVP)
(w / v) หลังจากที่ 2 ซัก 10 นาทีกับ
พีบีเอส / T, เยื่อถูกบ่มเป็นเวลา 1 ชั่วโมง
กับสารละลายที่มีไฮบริ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

Western blot
ในขั้นตอนแรก นมและเนยแข็ง ( ถูก

แยกตามมวลของญาติ ( MR ) โดยร้อยละ 12 การศึกษาหลังจากที่ลดลง นมและเนยแข็งบดระงับ ( 200

มก. / มล. เจือจาง 1 : 10 ) ในการศึกษา
โหลดบัฟเฟอร์ ( 60 มม. โดยกรดไฮโดรคลอริก pH 6.8 , 2 %
( w / v ) t , 10% ( v / v ) และ glyc ROL , 0.025 % ( w / v )
5 % ( โบรโมฟีนอลบลู v / v )  - mercaptoethanol ประมาณ 7.5 กรัม และµ
โปรตีนและโหลดบนเจล ผลิตโมเลกุลเครื่องหมาย (

) lmw GE Healthcare วิทยาศาสตร์ชีวภาพ AB , นิวยอร์ก ,
สวีเดน ) และความแม่นยำบวกโปรตีนมาตรฐาน
( biorad , Hercules , CA , USA )
หลังจากแยกเป็นโปรตีนบนเยื่อ electrotransferred ไนโตร
( biorad ) เป็นเวลา 1 ชั่วโมง ที่ 250 มา ในบัฟเฟอร์ที่มีบริษัท
25mm , Glycine 192 มม. 20 %
( v / v ) เอทานอล โดย
เมมเบรนกับโมโนโคลนอลแอนติบอดีที่เฉพาะเจาะจงของแต่ละเซลล์หรือ
พร้อมเซรั่มของผู้ป่วย

mab567 ป้องกันวัว , โมโนโคลนอลแอนติบอดีต่อต้าน S1 เคซีน ( โซน 149-166 )
mab521 anti -  S2 เคซีน ( โซน 96-114 )
mab657 anti -  - เคซีน ( โซน 133-150 )
mab257 anti -  - เคซีน ( โซน 98-115 ) เป็นประเภทของขวัญของดร. D .
( ทีมนักวิจัยของดูปองท์ และ
agrocampus แรนส์ , ฝรั่งเศส ) , ( Johansson และ
al . , 2009 )
สำหรับย้อมด้วยโมโนโคลนอลแอนติบอดี
, เยื่อแผ่นแบบบ่มเป็นเวลา 1 ชั่วโมง กับสารละลาย PBS
บัง ( 0.136 M NaCl KCl 1.46 มิลลิเมตร mm 2.68
,
na2hpo4 kh2po4 8.1 mm , pH 7.4 ) ที่ 0.05 % ( v / v ) tween-20
( PBS / T ) และ 4 % polyvinylpyrolidone ( PVP )
( w / v ) หลังจาก 2 washings สำหรับ 10 นาทีกับ
PBS / T , เยื่อแผ่นแบบบ่มเป็นเวลา 1 ชั่วโมง
กับเซลล์สูงประกอบ