ResultsTransient Expression of PCR-

Results
Transient Expression of PCR-fragments in Epidermal Cells
The components designed in the cassette of a PCR-fragment include a promoter, such as CaMV 35S promoter [16] or UBQ10 promoter [17], coding sequences of the gene of interest (CDS), and the terminator (NOS) (Figure 1A). Initially, PCR-fragments were generated through PCR amplification from the template plasmid DNA which contains the backbone of vector pUC18. The pair of universal primers PVU-F (located at 180 bp upstream of the promoter) and PVU-R (located at 100 bp downstream of NOS terminator) was used (Figure 1A). Amplified PCR-fragments were briefly purified with the extraction of phenol/chloroform and precipitated in ethanol [18]. In the first task, we prepared PCR- fragments of 35S-GFP-NOS from plasmid p35S-GFP. To remove residues of template plasmid DNA from the PCR-fragments, we purified PCR-fragments 35S-GFP-NOS through agarose gel extraction. Then, purified PCR-fragments 35S-GFP-NOS were transformed into epidermal cells of Onion peels with the biolistic bombardment delivery system. To compare transformation efficiency, plasmid DNA p35S-GFP was transformed in parallel. For a negative control, we transformed PCR-fragments generated from the same template plasmid but not containing GFP sequences. GFP signal was compared in transformations with PCR-fragments and with plasmid DNA. Results showed that GFP fluorescent signal was detected in the transformation with 35S- GFP-NOS or p35S-GFP, no GFP signal was detectable in the negative control (Figure S1). These results indicated that PCR- fragment based transient expression system (PCR-TES) could be used as an alternative way to assess gene expression in plant cells. Next, we compared the efficiency between PCR-fragments transformation and plasmids transformation. PCR-fragment 35S- GFP-NOS and plasmid p35S-Cherry were cotransformed into epidermal cells of Onion peels. Results showed that cells expressing Cherry fluorescent signal (red) were also displaying GFP fluores- cent signal (green) (Figure 1B), suggesting that transformation with PCR-fragments, instead of plasmid DNA, could be a substantial approach for transiently assessing a gene expression in plant cells.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ผลลัพธ์นิพจน์แบบฉับพลันของการแยกส่วน PCR ในเซลล์ Epidermalส่วนประกอบที่ออกแบบมาในเทปของ PCR ส่วนรวมเป็นโปรโมเตอร์ เช่นโปรโมเตอร์ 35S CaMV [16] หรือ UBQ10 โปรโมเตอร์ [17], การกำหนดลำดับของยีนที่น่าสนใจ (ซีดี), และเทอร์มิเนเตอร์ (NOS) (รูปที่ 1A) ตอนแรก บางส่วนของ PCR ถูกสร้างผ่านขยาย PCR จาก plasmid แม่แบบดีเอ็นเอซึ่งประกอบด้วยแกนหลักของเวกเตอร์ pUC18 คู่ไพรเมอร์สากล PVU F (ห้อง 180 bp ต้นน้ำของโปรโมเตอร์ที่) และ PVU R (อยู่ 100 bp น้ำของชุดหมายเลขเทอร์มิเนเตอร์) ที่ใช้ (รูปที่ 1A) เอาต์ PCR-ได้สั้น ๆ บริสุทธิ์ที่ มีการสกัดวาง/คลอโรฟอร์ม และตกตะกอนในเอทานอล [18] ในงานแรก เราเตรียมชิ้นส่วน PCR ของ 35S-GFP-ชุดหมายเลขจาก plasmid p35S GFP เอาตกของ plasmid แม่แบบดีเอ็นเอจากชิ้นส่วน PCR เราบริสุทธิ์บางส่วนของ PCR 35S-GFP-หมายเลขผ่าน agarose เจลสกัด แล้ว บริสุทธิ์บางส่วนของ PCR 35S-GFP-หมายเลขถูกเปลี่ยนเป็นหอม peels biolistic ระดมยิงจัดระบบเซลล์ epidermal การเปรียบเทียบประสิทธิภาพการแปลง plasmid DNA p35S-GFP ถูกแปลงขนาน ควบคุมค่าลบ เราเปลี่ยน PCR-ชิ้นส่วนสร้างจาก plasmid แม่เดียวกัน แต่ไม่ประกอบด้วยลำดับ GFP สัญญาณ GFP ถูกเปรียบเทียบในแปลงบางส่วน ของ PCR และ plasmid DNA ผลลัพธ์แสดงให้เห็นว่า สัญญาณฟลูออเรส GFP พบในการแปลงหมายเลข GFP 35S หรือ p35S-ถูกไม่มีสัญญาณ GFP GFP สามารถควบคุมค่าลบ (รูป S1) ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่า สามารถใช้ระบบนิพจน์แบบฉับพลันตามส่วน PCR (ทดสอบ PCR) เป็นทางเลือกที่หายีนในเซลล์พืช ถัดไป เราเปรียบเทียบประสิทธิภาพระหว่างการแปลงบางส่วนของ PCR และ plasmids แปลง ส่วน PCR 35S-GFP-ชุดหมายเลขและ plasmid เชอร์รี่ p35S ได้ cotransformed เป็นเซลล์ epidermal peels หอม ผลพบว่า เซลล์ที่แสดงสัญญาณฟลูออเรสเชอร์รี่ (สีแดง) ถูกแสดง GFP fluores ร้อยละสัญญาณ (สีเขียว) (รูปที่ 1B), แนะนำการแปลงกับ PCR-ชิ้นส่วน แทน plasmid DNA อาจเป็นวิธีที่พบสำหรับการประเมิน transiently ยีนในเซลล์พืช

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ผลการ
แสดงออกชั่วคราวของ PCR เศษในเซลล์ผิวหนัง
ส่วนประกอบการออกแบบในเทป PCR-ส่วนรวมถึงก่อการเช่นโปรโมเตอร์ CaMV 35S [16] หรือก่อการ UBQ10 [17], การเข้ารหัสลำดับของยีนที่สนใจ (CDS) และเทอร์มิ (NOS) (รูปที่ 1A) ในขั้นต้นเศษ-PCR ถูกสร้างขึ้นผ่านการขยาย PCR จากพลาสมิดดีเอ็นเอแม่แบบที่มีกระดูกสันหลังของ pUC18 เวกเตอร์ คู่ของไพรเมอร์สากล PVU-F (อยู่ที่ 180 bp ต้นน้ำของผู้ก่อการ) และ PVU-R (อยู่ที่ 100 bp ปลายน้ำของเทอร์มิ NOS) ถูกนำมาใช้ (รูปที่ 1A) ขยายเศษ-PCR บริสุทธิ์ในเวลาสั้น ๆ ที่มีการสกัดคลอโรฟอร์มฟีนอล / และตกตะกอนในเอทานอล [18] ในงานแรกที่เราเตรียม PCR- ชิ้นส่วนของ 35S-GFP-NOS จากพลาสมิด p35S-GFP ในการลบตกค้างของพลาสมิดดีเอ็นเอแม่แบบจากเศษ-PCR เราบริสุทธิ์เศษ-PCR-35S GFP-NOS ผ่านการสกัดเจล agarose จากนั้นบริสุทธิ์เศษ-PCR-35S GFP-NOS ถูกเปลี่ยนเป็นเซลล์ผิวหนังของเปลือกหัวหอมที่มีระบบการจัดส่งการโจมตี biolistic เพื่อเปรียบเทียบประสิทธิภาพการเปลี่ยนแปลงดีเอ็นเอพลาสมิด p35S-GFP ถูกเปลี่ยนในแบบคู่ขนาน สำหรับการควบคุมเชิงลบเราเปลี่ยนชิ้นส่วน-PCR ที่เกิดจากพลาสมิดแม่แบบเดียวกัน แต่ไม่ได้มีลำดับ GFP สัญญาณ GFP ถูกเมื่อเทียบกับในแปลงเศษ-PCR และมีพลาสมิดดีเอ็นเอ ผลการศึกษาพบว่า GFP สัญญาณเรืองแสงถูกตรวจพบในการเปลี่ยนแปลงที่มี 35S- GFP-NOS หรือ p35S-GFP สัญญาณ GFP ไม่ได้ตรวจพบในการควบคุมเชิงลบ (รูปที่ S1) ผลการศึกษานี้ชี้ให้เห็นว่าส่วน PCR- ตามระบบการแสดงออกชั่วคราว (PCR-TES) สามารถใช้เป็นทางเลือกในการประเมินการแสดงออกของยีนในเซลล์พืช ต่อไปเราเปรียบเทียบประสิทธิภาพระหว่างการเปลี่ยนแปลงวิธี PCR-ชิ้นส่วนและการเปลี่ยนแปลงพลาสมิด PCR-ส่วน 35S- GFP-NOS และพลาสมิด p35S-เชอร์รี่ถูก cotransformed เข้าสู่เซลล์ผิวหนังของเปลือกหัวหอม ผลการศึกษาพบว่าเซลล์แสดงสัญญาณเรืองแสงเชอร์รี่ (สีแดง) ก็ยังแสดงสัญญาณร้อย GFP fluores- (สีเขียว) (รูปที่ 1B) ชี้ให้เห็นการเปลี่ยนแปลงที่มีเศษ-PCR ที่แทนของพลาสมิดดีเอ็นเออาจจะเป็นวิธีการที่สำคัญสำหรับการประเมิน transiently ยีน การแสดงออกในเซลล์พืช

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ผลการแสดงออกของยีนแบบเศษในเนื้อเยื่อชั้นผิว
ส่วนประกอบการออกแบบในเทปของ PCR ส่วน รวมถึงผู้สนับสนุน เช่น 35S CaMV promoter [ 16 ] หรือ [ 17 ] ubq10 โปรโมเตอร์นะครับ ลำดับของยีนที่น่าสนใจ ( ซีดี ) และ เดอะ เทอร์มิเนเตอร์ ( NOS ) ( รูปที่ 1A ) ในตอนแรกชิ้นส่วนทั้งหมดจะถูกสร้างขึ้นผ่านทาง PCR ( จากแม่แบบพลาสมิดดีเอ็นเอซึ่งประกอบด้วยกระดูกสันหลังของเบสเวกเตอร์ คู่ของไพรเมอร์ pvu-f สากล ( ตั้งอยู่ที่ 180 BP ต้นน้ำของโปรโมเตอร์ ) และ pvu-r ( ตั้งอยู่ที่ 100 BP ท้ายน้ำไม่มี Terminator ) ที่ใช้ ( รูปที่ 1A )ชิ้นส่วนของดีเอ็นเอ คือ สั้น ๆให้บริสุทธิ์ด้วยการสกัดฟีนอล / คลอโรฟอร์มและตกตะกอนในเอทานอล [ 18 ] ในงานแรก เราเตรียมเทคนิค - ชิ้นส่วนของ 35s-gfp-nos จากพลาสมิด p35s GFP . เพื่อลบตกค้างของพลาสมิดดีเอ็นเอแม่แบบจาก PCR PCR เศษชิ้นส่วน เราให้ 35s-gfp-nos ผ่านเจลสกัด จากนั้นบริสุทธิ์และเศษ 35s-gfp-nos ถูกเปลี่ยนเป็นเซลล์เนื้อเยื่อชั้นผิวของเปลือกหัวหอมกับ biolistic โจมตีส่งระบบ การเปรียบเทียบประสิทธิภาพการเปลี่ยนแปลงพลาสมิดดีเอ็นเอ p35s GFP ถูกเปลี่ยนในแบบคู่ขนาน สำหรับการควบคุมที่เป็นลบ เราเปลี่ยนชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่สร้างขึ้นจากแม่แบบเดียวกัน แต่ไม่ใช่พลาสมิดที่มี GFP ลำดับในการแปลงสัญญาณ GFP เปรียบเทียบกับชิ้นส่วนดีเอ็นเอและพลาสมิดดีเอ็นเอ ผลการศึกษาพบว่า GFP ฟลูออเรสเซนต์สัญญาณที่ตรวจพบในการ 35s - gfp-nos หรือ p35s GFP GFP ได้ไม่มีสัญญาณในการควบคุมลบตัวเลข ( S1 )และพบว่า PCR - เบสตามแบบระบบ ( การแสดงออก pcr-tes ) อาจจะใช้เป็นทางเลือกเพื่อศึกษาการแสดงออกของยีนในเซลล์พืช ต่อไปเราเปรียบเทียบประสิทธิภาพระหว่าง PCR และการแปลงเศษเพื่อการเปลี่ยนแปลง PCR ส่วน 35s - gfp-nos พลาสมิด p35s และเชอร์รี่เป็น cotransformed เข้าสู่เซลล์ตรงเปลือกหัวหอมผลการทดลองพบว่าเซลล์หลอดสัญญาณแสดงเชอร์รี่ ( สีแดง ) ยังแสดง GFP ร้อยละ fluores - สัญญาณ ( สีเขียว ) ( รูปที่ 1A ) แนะนำว่า การเปลี่ยนแปลงกับชิ้นส่วนดีเอ็นเอแทนพลาสมิดดีเอ็นเอ อาจเป็นแนวทางสำคัญสำหรับบุคคลหรือสิ่งที่อยู่ชั่วคราวประเมินการแสดงออกของยีนในเซลล์พืช