Part of each fecal sample was prese

Part of each fecal sample was preserved in
70% ethanol at room temperature for DNA isolation. DNA
was extracted using an in-house (IH) method described by
Repetto and others
18
with the following modifications: prior
to DNA extraction, stool samples were washed twice with
sterile distilled water followed by centrifugation at 2000 × g
for 5 minutes to remove the ethanol. Approximately 1 g stool,
diluted in 10 mL PBS, was subjected to 5 cycles of freez-ing (liquid nitrogen) and thawing (in boiling water). About
500 μL PBS-diluted stool was incubated overnight with
500 μL GTES buffer (100 mM glycine, 0.05% sodium
dodecyl sulfate [SDS], 100 mM Tris/Cl, and 1 mM ethyl-enediaminetetraacetic acid [EDTA]) at 37°C,
18,19
followed
by three cycles of freeze thawing. Samples were mixed with
200 mg of glass beads (0.5 mm in diameter) and shaken vigor-ously for 5 minutes. The suspension was incubated for 12 hours
in nematode lysis buffer (100 mM EDTA, 100 mM NaCl,
100 mM Tris pH 7.5, 0.05% SDS, proteinase K 100μg/mL)
at 37°C.
18
Next, the samples were extracted twice with one
volume of phenol–chloroform–isoamyl alcohol (25:24:1), and
DNA was precipitated with an equal volume of isopropanol
and 1 mL of 100% ethanol, respectively. The pellet was
washed with 300μL of 70% ethanol, dried, and eluted in
100μL of TE buffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA pH 8) and
stored at−20°C until use

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

เป็นส่วนหนึ่งของแต่ละตัวอย่างอุจจาระถูกเก็บรักษาไว้ในเอทานอล 70% ที่อุณหภูมิห้องเพื่อแยกดีเอ็นเอ ดีเอ็นเอถูกแยกโดยใช้วิธีการ (IH) ภายในองค์กรโดยRepetto และอื่น ๆ18ด้วยการปรับเปลี่ยนต่อไปนี้: ล่วงหน้าการสกัดดีเอ็นเอ ตัวอย่างอุจจาระถูกล้างสองครั้งด้วยน้ำกลั่นปลอดเชื้อตาม ด้วยการหมุนเหวี่ยงที่ 2000 × g5 นาทีเพื่อเอานอล ประมาณ 1 กรัมสตูลเจือจาง 10 ml PBS ได้ภายใต้การ 5 รอบของอิสระ-ing (ไนโตรเจนเหลว) และละลาย (ในน้ำ) เกี่ยวกับΜL 500 เจือจาง PBS สตูล incubated ค้างคืนด้วย500 μL GTES บัฟเฟอร์ (glycine 100 mM, 0.05% โซเดียมdodecyl ซัลเฟตกรดเอทิล-enediaminetetraacetic [SDS], ทริ สเรทติ้ง/Cl 100 mM และ 1 มม. [EDTA]) ที่ 37 ° C18,19ตามด้วยโดยสามรอบของแข็งละลาย รวมตัวอย่างด้วย200 มิลลิกรัมของลูกปัดแก้ว (0.5 mm เส้นผ่านศูนย์กลาง) และความแข็งแรง ously เขย่า 5 นาที ระบบกันสะเทือนมี incubated 12 ชั่วโมงในการนีมาโทดา lysis บัฟเฟอร์ (100 mM EDTA, NaCl, 100 มม.100 มม.ทริสเรทติ้ง pH 7.5, 0.05% SDS, proteinase K 100μg/mL)ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส18ถัดไป ตัวอย่างที่สกัด ด้วยหนึ่งในสองปริมาณของแอลกอฮอล์ฟีนอลคลอโรฟอร์ม-isoamyl (25:24:1), และดีเอ็นเอถูกตกตะกอน ด้วยปริมาณเท่ากับ isopropanolและเอทานอล 100%, 1 mL ตามลำดับ เป็นเม็ดล้าง ด้วย 300μL ของเอทานอล 70% แห้ง และ eluted ใน100μL ของบัฟเฟอร์ TE (10 mM ทริสเรทติ้ง pH EDTA 1 มม. 8) และเก็บ at−20 ° C จนกว่าจะใช้

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ส่วนหนึ่งของแต่ละตัวอย่างอุจจาระได้รับการเก็บรักษาไว้ใน
70% เอทานอลที่อุณหภูมิห้องแยกดีเอ็นเอ ดีเอ็นเอ
ถูกสกัดโดยใช้ในบ้าน (IH) วิธีการอธิบายโดย
Repetto และอื่น ๆ
18
ด้วยการปรับเปลี่ยนต่อไปนี้: ก่อน
ที่จะสกัดดีเอ็นเอตัวอย่างอุจจาระถูกล้างสองครั้งด้วย
น้ำกลั่นผ่านการฆ่าเชื้อตามมาด้วยการหมุนเหวี่ยงที่ 2,000 ×กรัม
เป็นเวลา 5 นาทีในการลบ เอทานอล ประมาณ 1 กรัมอุจจาระ
เจือจางใน 10 มลพีบีเอสได้ภายใต้การ 5 รอบ Freez ไอเอ็นจี (ไนโตรเจนเหลว) และละลาย (ในน้ำเดือด) เกี่ยวกับ
500 ไมโครลิตรพีบีเอสปรับลดอุจจาระถูกบ่มค้างคืนกับ
500 ไมโครลิตร GTES บัฟเฟอร์ (100 มิลลิเมตร glycine, 0.05% โซเดียม
โดเดซิลซัลเฟต [SDS] 100 มิลลิเมตร Tris / Cl และ 1 มิลลิเอทิล enediaminetetraacetic กรด [EDTA]) ที่ 37 ° C ,
18,19
ตาม
ด้วยสามรอบของการละลายน้ำแข็งแช่แข็ง ตัวอย่างที่ถูกผสมกับ
200 mg ของลูกปัดแก้ว (0.5 มม) และเขย่าความแข็งแรง-ously เป็นเวลา 5 นาที การระงับการถูกบ่มเป็นเวลา 12 ชั่วโมง
ในบัฟเฟอร์ไส้เดือนฝอยสลาย (100 มิลลิเมตร EDTA, 100 มิลลิเมตรโซเดียมคลอไรด์,
100 มิลลิเมตรทริสพีเอช 7.5, 0.05% SDS, โปร K 100μg / มิลลิลิตร)
ที่ 37 ° C.
18
ถัดไปตัวอย่างถูกสกัดสองครั้ง หนึ่ง
ปริมาณของฟีนอลคลอโรฟอร์ม isoamyl เครื่องดื่มแอลกอฮอล์ (25: 24: 1) และ
ดีเอ็นเอตกตะกอนด้วยปริมาตรที่เท่ากันของ isopropanol
และ 1 มิลลิลิตรของเอทานอล 100% ตามลำดับ เม็ดได้รับการ
ล้างด้วย300μLเอทานอล 70%, แห้งและชะใน
100μLของ TE บัฟเฟอร์ (10 mM Tris 1 มิ EDTA ค่า pH 8) และ
เก็บไว้ที่อุณหภูมิ 20 องศาเซลเซียสจนการใช้งาน

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ส่วนหนึ่งของแต่ละตัวอย่างถูกเก็บรักษาไว้ในอุจจาระ70% เอทานอลที่อุณหภูมิห้องในการแยกดีเอ็นเอ ดีเอ็นเอสกัดใช้ในบ้าน ( IH ) อธิบายโดยรีเพตโต้ และอื่น ๆ18กับการปรับเปลี่ยนดังต่อไปนี้ก่อนการสกัดดีเอ็นเอตัวอย่างอุจจาระถูกล้างสองครั้งด้วยฆ่าเชื้อน้ำ ตามด้วยปั่นที่× 2000 กรัม5 นาทีเพื่อเอาเอทานอล อุจจาระประมาณ 1 กรัมเจือจางใน 10 ช่อง มล. ภายใต้ 5 รอบของฟรีซไอเอ็นจี ( ไนโตรเจนเหลว ) และละลายในน้ำเดือด ) เกี่ยวกับ500 μ L PBS เจือจางอุจจาระถูกบ่มค้างคืนกับ500 μผม gtes บัฟเฟอร์ ( 100 มม. Glycine , 0.05 % โซเดียมโดเดซิลซัลเฟต [ t ] , 100 มิลลิเมตรต่อ / CL และ 1 มม. - enediaminetetraacetic กรด EDTA ] ) [ 37 ° C18,19ตามสามรอบของแช่แข็งละลาย ตัวอย่างที่ผสมกับ200 มิลลิกรัมของลูกปัดแก้ว ( 0.5 มม. ) และสะเทือนความแข็งแรง ously เป็นเวลา 5 นาที ถูกระงับบ่มเป็นเวลา 12 ชั่วโมงพยาธิตัวกลมในการสลายบัฟเฟอร์ ( 100 mM EDTA NaCl 100 มม.100 มิลลิเมตร โดย pH 7.5 , 0.05 % SDS , โปรμ K 100 g / ml )ที่ 37 องศา18ถัดไป จำนวน 2 ครั้ง ด้วยสารสกัดปริมาณของฟีนอลและคลอโรฟอร์ม - แอลกอฮอล์ในปริมาณ ( 25:24:1 )ดีเอ็นเอตกตะกอนด้วยปริมาณเท่ากันของไอโซโพรพานอล1 มิลลิลิตรเอทานอล 100 % ตามลำดับ เม็ด คือล้างด้วยμ 300 ลิตรเอทานอล 70% แห้งและตัวอย่างใน100 μ l TE บัฟเฟอร์ ( หรือ 10 มม. 1 mM EDTA pH 8 ) และเก็บไว้ที่อุณหภูมิ 20 ° C −จนใช้