2. Experimental2.1. Chemicals and r

2. Experimental
2.1. Chemicals and reagents

Abacavir Sulfate (USP, LOT F1L487, 99.4% w/w), Efavirenz (USP, LOT F0G376, 99.8% w/w), Lamivudine (USP, LOT H0I378, 99.7% w/w), Nelfinavir Mesylate (USP, LOT F0K050, 98.3% w/w) and Nelfinavir-d3 (Toronto Research Chemicals, LOT 4-SDJ-86-3, 98% w/w) were supplied by the pharmaceutical industry. Stock solutions (400 μg mL−1 of each ARV) were prepared by dissolving an appropriate amount of each compound in acetonitrile (ACN). Working solutions were prepared daily by dilution of the stock solutions with ACN. Instrument tuning parameters were optimized using 1000 ng mL−1 solutions of each compound prepared in mobile phase (10 mM ammonium acetate:ACN, 70:30 v/v). The Triton X-114 (AppliChem, Germany) was prepared in deionized water (DW-conductivity < 3 μS cm−1) within the range of 2.5–10% (w/v) in DW. ACN and methanol (MeOH) were purchased from Carlo Erba, France and Ammonium acetate (NH4Ac) was purchased from Sigma–Aldrich, Germany. All reagents were analytic grade or above.

2.2. Instrumentation

The assay was carried out by using an ultra-performance chromatography coupled to a triple quadrupole (UFLC–MS/MS) instrument, described as follows: UFLC Shimadzu (LC 20AD), automatic injector Shimadzu (SIL-20A XR), coupled to an electrospray ionization (ESI) source (Applied Biosystems, Ontario, Canada). Liquid chromatographic analysis was carried out on a Hypersil Gold C18 column (100 mm × 2.1 mm i.d., 3 μm particle, Thermo Fisher Scientific, USA). Data were acquired and processed using Analyst software (version 1.5.1; ABSciex, Toronto, Canada).

2.3. Sampling and sample conditioning

Samples were obtained from volunteers of DominguezLab, which is developing a program for determining drugs bioequivalence (Protocol number: PRO-BEQ-EFV-001-V.01). Sampling was carried out using a catheter system (BD Saf-T-Intima™, BD Vacutainer®) and syringes of 5 mL. The blood sample was collected into heparinized polypropylene 4 mL tubes (NAHEP PLH 13X75 4.0 PLBL GN, BD Vacutainer®, Broken Bow NE 68822 US) and centrifuged at 3000 rpm (1400 × g) for plasma separation. Aliquots of 1 mL were preserved in polypropylene 2 mL cryovials and frozen at −20 °C ± 5 °C until analysis.

2.4. Cloud point extraction

A 500 μL aliquot of human plasma was diluted with 2 mL DW in a 10 mL centrifuge tube. An aliquot of 500 μL Triton X-114 5% w/v was added and homogenized using a vortex stirrer. The resulting cloudy solution was kept at 65 °C for 20 min for promoting the condensation of surfactant micelles. Then it was centrifuged at 3000 × g for 5 min for separation of the surfactant-rich phase. After discarding the aqueous supernatant, 400 μL ACN were added to the remaining surfactant rich phase and centrifuged in order to precipitate proteins and separate them. A 150 μL aliquot of the supernatant was transferred to 2 mL vial and further diluted with 400 μL DW. A30 μL aliquot of the so prepared solution was injected and analyzed into the UFLC-MS/MS.

3. Results and discussion
As it is well known, CPE efficiency is conditioned by physicochemical variables as well as the matrix nature of the sample and analytes [14] and [18]. Therefore, it is of interest to study the effect of the experimental physicochemical variables on the analytical response of the ARV and optimize it towards achieving high sensitivity and selectivity of the methodology.

Developing analytical method using synthetic solution and further application on real samples generally requires severe adjustments. This could lead to a new method different from the former one. The use of real matrix all along the process is a convenient choice for characterizing, studying and optimizing the analytical methodology that is been developed. In this sense, not only the signal enhancing due to the improvement of the extraction efficiency resulted significant, but also the matrix load minimization, which led to a satisfactory chromatographic analysis. These aspects were what finally determined the sensitivity and selectivity of the resulting analytical methodology. Thus, those particular factors of a real matrix, as well as all experimental variables that condition the analytical responses of the ARV were evaluated, including extraction pH, surfactant concentration, extraction time and temperature, salting out effect and the use of modifiers, including ACN, MeOH and acid, respectively. These studies were carried out by modifying one variable at the time keeping constant the remaining ones. A 500 μL aliquot of plasma, originally free of ARV, was spiked with antiretroviral standard-mix (750 ng mL−1 3 TC and ABC, 300 ng mL−1 NFV and 150 ng mL−1 EFV in H2O:MeOH 75:25 v/v) and 50 μL of Nelfinavir-d3 (Internal Standard, 2200 ng mL−1) for carrying out the assays, which were done by triplicate. The chromatographic peak area was used to evaluate the impact of modified experimental conditions on the analytical response.

From Section 3.2, 3.3, 3.4 and 3.5 are presented the results and discussion of the relevant variables of this work. The remaining variables mentioned above, did not show significant effect on the analytical response of the studied ARV.

3.1. UFLC-MS/MS conditions

In the present work, the MS optimization was carried out using direct infusion of standard solutions of each ARV into de ESI source of the mass spectrometer at 20 μL min−1 using a built-in syringe pump. Base ion of each ARV was selected from full scan mode recorded within the range 50–600 m/z. In all cases [M+H]+ mode were selected. Declustering Potential (DP), Entrance Potential (EP) and Collision Cell Entrance Potential (CEP) voltages were selected according to the sensitivity of precursor base ions, whereas Collision energy (CE) and Collision Cell Exit Potential (CXP) were chosen to give the maximum intensity of the obtained fragment base ion. The remaining operative conditions were as follows: 250 ms dwell time, 5500 V ion spray voltage, 20 psi nebulizer gas (GS1:N2), 20 psi curtain gas, 7 psi collision gas (N2), 20 psi drying gas (GS2:N2), 500 °C drying gas temperature and 100 °C source temperature. The mass spectrometer was used in the multiple reaction monitoring (MRM) mode and the m/z transition for quantification collected in positive mode were 287.1 → 191.2, 316.0 → 168.2, 230.0 → 112.1, 568.4 → 330.1 and 571.4 → 333.1 for ABC, EFV, 3 TC, NFV and NFV-d3, respectively.

The chromatographic separation was carried out using a mobile phase of two components: A and B. A: 10 mM NH4Ac:ACN (70:30 v/v) and B: 100% ACN. The flow rate was set at 0.25 mL min−1 and the column temperature was kept at 40 °C along the run. The injection volume was 30 μL and the run time was 4 min. The retention time for the target analytes were 1.30, 1.34, 1.61 and 2.06 min for ABC, 3 TC, NFV and EFV, respectively. Representative chromatograms of a standard mixture of the analytes are illustrated in Fig. 1.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2. ทดลอง2.1. เคมีและ reagentsอะบาคาเวียร์ซัลเฟต (USP, F1L487 ล็อต 99.4% w/w), อีฟาวิเรนซ์ (USP, F0G376 ล็อต 99.8% w/w), Lamivudine (USP, H0I378 ล็อต 99.7% w/w), Mesylate เนลฟินาเวียร์ (USP, F0K050 ล็อต 98.3% w/w) และดี 3 เนลฟินาเวียร์ (โตรอนโตวิจัยเคมี ล็อต 4-SDJ-86-3, 98% w/w) ถูกจัดทำ โดยอุตสาหกรรมเภสัชกรรม หุ้นโซลูชั่น (400 μg mL−1 ของแต่ละ ARV) ถูกเตรียม โดยยุบจำนวนที่เหมาะสมของแต่ละสารประกอบใน acetonitrile (ACN) โซลูชั่นการทำงานได้เตรียมไว้ทุกวัน โดยเจือจางในโซลูชั่นหุ้นกับ ACN เครื่องมือปรับแต่งพารามิเตอร์ถูกปรับใช้โซลูชั่น mL−1 ng 1000 ของสารประกอบแต่ละเตรียมในเฟสเคลื่อนที่ (10 มม.แอมโมเนีย acetate: ACN, 70:30 v/v) การไตรตั้น X-114 (AppliChem เยอรมนี) ถูกเตรียมในน้ำ deionized (นำ DW < 3 μS cm−1) อยู่ในช่วง 2.5-10% (w/v) ใน DW ACN และเมทานอ) ซื้อจาก Carlo Erba ฝรั่งเศส และแอมโมเนีย acetate (NH4Ac) ถูกซื้อจากซิก-Aldrich เยอรมนี Reagents ทั้งหมดมีเกรดโกดังขึ้น2.2 การใช้เครื่องมือการวิเคราะห์ถูกดำเนินโดย chromatography ประสิทธิภาพพิเศษควบคู่กับเครื่องมือสาม quadrupole (UFLC – MS/MS) อธิบายได้ดังนี้: UFLC Shimadzu (LC 20AD) หัวฉีดอัตโนมัติ Shimadzu (XR ภาษาศาสตร์-20A), ควบคู่ไปกับแหล่ง ionization (ESI) วิธีพ่นละอองไฟฟ้า (ใช้ Biosystems, Ontario ประเทศแคนาดา) วิเคราะห์ของเหลว chromatographic ถูกดำเนินบนคอลัมน์ C18 ทอง Hypersil (ประชาชน 100 มม. × 2.1 มม. 3 μm อนุภาค เทอร์โม Fisher วิทยาศาสตร์ สหรัฐอเมริกา) ข้อมูลที่ได้รับมา และดำเนินการโดยใช้ซอฟต์แวร์วิเคราะห์ (เวอร์ชัน 1.5.1 ABSciex โตรอนโต แคนาดา)2.3. การสุ่มตัวอย่าง และตัวอย่างการปรับตัวอย่างได้รับจากอาสาสมัครของ DominguezLab ซึ่งมีการพัฒนาโปรแกรมสำหรับการกำหนดยา bioequivalence (โพรโทคอลหมายเลข: PRO-BEQ-EFV-001-V.01) สุ่มตัวอย่างได้ดำเนินการใช้ระบบพัฒนาโปรแกรมฐานข้อมูล (BD Saf-T-Intima ™ BD Vacutainer ®) และเข็มฉีดยาของ 5 mL ตัวอย่างเลือดถูกเก็บไว้ในท่อ heparinized polypropylene 4 mL (NAHEP PLH 13 X 75 4.0 PLBL GN, BD Vacutainer ® เสียโบว์ NE 68822 เรา) และ centrifuged ที่ 3000 rpm (1400 × g) สำหรับแยกพลาสมา Aliquots 1 mL ได้ใน cryovials polypropylene 2 mL และแช่แข็งที่ −20 ° C ± 5 ° C จนถึงการวิเคราะห์2.4. เมฆจุดสกัดส่วนลงตัว 500 μL ของพลาสม่ามนุษย์ถูกผสมกับ 2 mL DW ในเครื่องหมุนเหวี่ยงหลอด 10 mL เป็นส่วนลงตัวของ 500 μL ไตรตั้น X 114 5% w/v เข้ามา และใช้ช้อนคนแบบ vortex homogenized เป็นกลุ่ม โซลูชันมีเมฆมากได้ถูกเก็บไว้ที่ 65 ° C สำหรับ 20 นาทีในการส่งเสริมการรวมตัวกันแน่นของ surfactant micelles แล้ว มันถูก centrifuged ที่ 3000 × g สำหรับ 5 นาทีสำหรับแยกเฟส surfactant ริช หลังจากละทิ้ง supernatant อควี 400 μL ACN ได้เพิ่มระยะเหลือ surfactant รวย แล้ว centrifuged precipitate โปรตีน และไป ส่วนลงตัว 150 μL ของ supernatant จะถูกโอนย้ายไปคอนแทค 2 mL และเติม ผสมกับ 400 μL DW ส่วนลงตัว μL A30 โซลูชันเพื่อเตรียมฉีด และวิเคราะห์เป็น UFLC-MS/MS3. ผลลัพธ์ และสนทนาเนื่องจากเป็นที่รู้จักกันดี ประสิทธิภาพ CPE เป็นปรับอากาศโดยตัวแปร physicochemical ธรรมชาติเมตริกซ์ตัวอย่าง และ analytes [14] [18] ดังนั้น จึงเป็นที่สนใจศึกษาผลของตัวแปร physicochemical ทดลองการตอบสนองของ ARV วิเคราะห์ และเพิ่มประสิทธิภาพบรรลุใวของระเบียบวิธีและความไวสูงพัฒนาวิธีวิเคราะห์ที่ใช้สังเคราะห์แก้ปัญหาและการประยุกต์ใช้เพิ่มเติมในตัวอย่างแท้จริงโดยทั่วไปต้องปรับปรุงอย่างรุนแรง ซึ่งอาจทำให้วิธีการใหม่ที่แตกต่างจากอดีต การใช้เมตริกซ์จริงรับกระบวนการเป็นทางเลือกสะดวกสำหรับกำหนดลักษณะ การศึกษา และการปรับระเบียบวิธีวิเคราะห์ที่ได้รับการพัฒนา ในความรู้สึกนี้ ไม่เพียงแต่เพิ่มสัญญาณเนื่องจากการปรับปรุงประสิทธิภาพการสกัดผลสำคัญ แต่ยัง เมทริกซ์โหลดลดภาระ ซึ่งนำไปสู่การวิเคราะห์ chromatographic พอ ลักษณะเหล่านี้มีความใวของวิธีวิเคราะห์ผลลัพธ์และสิ่งกำหนดสุดท้าย ดังนั้น ปัจจัยที่เฉพาะของเมทริกซ์จริง เป็นตัวแปรที่ดีเป็นทั้งหมดทดลองที่เงื่อนไขตอบวิเคราะห์ของ ARV ถูกประเมิน รวมถึงสกัด pH ความเข้มข้นของ surfactant แยกเวลา และ อุณหภูมิ มารีซอลทิงออกผลและการใช้คำวิเศษณ์ รวม ACN ทานอ และ กรด ตามลำดับ การศึกษานี้ได้ดำเนินการออก โดยการปรับเปลี่ยนตัวแปรหนึ่งเวลาให้คงเหลือ ส่วนลงตัว 500 μL ของพลาสมา เดิมฟรี ARV มี spiked กับแนวมาตรฐานผสม (750 ng mL−1 3 TC และ ABC, 300 ng mL−1 NFV และ 150 ng mL−1 EFV ใน H2O:MeOH 75:25 v/v) และ μL (ภายในมาตรฐาน 2200 ng mL−1) เนลฟินาเวียร์ดี 3 50 สำหรับดำเนิน assays ซึ่งทำ โดย triplicate พื้นที่สูงสุด chromatographic ถูกใช้เพื่อประเมินผลกระทบของสภาพทดลองแก้ไขในคำตอบวิเคราะห์จากหัวข้อ 3.2, 3.3, 3.4 และ 3.5 มีแสดงผลลัพธ์และการสนทนาของตัวแปรเกี่ยวข้องของงานนี้ ตัวแปรที่เหลือดังกล่าวข้างต้น ไม่แสดงผลคำตอบวิเคราะห์ของ studied ARV อย่างมีนัยสำคัญ3.1. UFLC-MS/MS เงื่อนไขในงานนำเสนอ เพิ่มประสิทธิภาพ MS ทำออกใช้คอนกรีตโดยตรงของโซลูชั่นมาตรฐานของแต่ละ ARV ใน ESI เดแหล่งที่มาของการรวมสเปกโตรมิเตอร์ที่ 20 μL min−1 ปั๊มเข็มภายในใช้ ไอออนพื้นฐานของแต่ละ ARV เลือกจากโหมดการสแกนแบบเต็มที่บันทึกภายในช่วง 50-600 m/z ในทุกกรณี [M + H] + โหมดเลือก Declustering เป็นไปได้ (DP), แรงดันเข้าไป (EP) และชนเซลล์เข้าไป (CEP) ถูกเลือกตามความไวของสารตั้งต้นพื้นฐานกัน ในขณะที่พลังงานชน (CE) และชนเซลล์ออกไป (CXP) ถูกเลือกให้ความเข้มสูงสุดของไอออนพื้นฐานส่วนที่ได้รับ เงื่อนไขวิธีปฏิบัติตนภายในที่เหลือมีดังนี้: 250 ms อาศัยอยู่เวลา แรงดันไฟฟ้าสเปรย์ไอออน 5500 V, 20 psi ฝอยละอองก๊าซ (GS1:N2) 20 psi ม่าน แก๊ส แก๊สชน 7 psi (N2), 20 psi อบแก๊ส (GS2:N2) แห้ง 500 ° C แก๊สอุณหภูมิและอุณหภูมิ 100 ° C มา สเปกโตรมิเตอร์มวลใช้ในปฏิกิริยาหลายตรวจสอบโหมด (MRM) และเปลี่ยนแปลง m/z นับรวบรวมในโหมดบวกได้ 191.2, 287.1 →→ 316.0 168.2, 230.0 → 112.1, 568.4 → 330.1 และ 571.4 → 333.1 ABC, EFV, 3 TC, NFV และ NFV-ดี 3 ตามลำดับแยก chromatographic ถูกดำเนินการโดยใช้เฟสเคลื่อนที่คอมโพเนนต์สอง: A และ b A: NH4Ac:ACN 10 มม. (70:30 v/v) และ b: 100% ACN มีการตั้งค่าอัตราการไหลที่ 0.25 mL min−1 และอุณหภูมิคอลัมน์ถูกเก็บไว้ที่ 40 ° C ตามการรัน ปริมาณฉีดได้ 30 μL และรันไทม์ได้ 4 นาที เวลาเก็บข้อมูลสำหรับเป้าหมาย analytes ได้ 1.30, 1.34, 1.61 และ 2.06 นาที ABC, 3 TC, NFV และ EFV ตามลำดับ Chromatograms ตัวแทนของส่วนผสมมาตรฐานของ analytes จะแสดงใน Fig. 1

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2. การทดลอง
2.1 สารเคมีและสารเคมีabacavir ซัลเฟต (USP, มาก F1L487, 99.4% w / w), Efavirenz (USP, มาก F0G376, 99.8% w / w), Lamivudine (USP, มาก H0I378, 99.7% w / w), nelfinavir Mesylate (USP มาก F0K050, 98.3% w / w) และ nelfinavir-d3 (โตรอนโตเคมีวิจัยมาก 4 SDJ-86-3, 98% w / w) ถูกจัดทำโดยอุตสาหกรรมยา การแก้ปัญหาสต็อก (400 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร-1 ของแต่ละยาต้านไวรัส) ได้จัดทำขึ้นโดยการละลายในปริมาณที่เหมาะสมของแต่ละสารประกอบใน acetonitrile (ACN) การแก้ปัญหาการทำงานได้จัดทำทุกวันโดยการลดสัดส่วนของหุ้นที่มีการแก้ปัญหา ACN ตราสารค่าปรับถูกเพิ่มประสิทธิภาพการใช้นาโนกรัม 1,000 มิลลิลิตร-1 การแก้ปัญหาของแต่ละสารประกอบในขั้นตอนการเตรียมมือถือ (อะซิเตต 10 มิลลิแอมโมเนียม: ACN, 70:30 v / v) ไทรทัน X-114 (AppliChem, เยอรมนี) ถูกจัดทำขึ้นในน้ำปราศจากไอออน (DW-การนำ <3 ไมโครวินาทีซม-1) ที่อยู่ในช่วงของ 2.5-10% (w / v) ในใบสำคัญแสดงสิทธิอนุพันธ์ ACN และเมทานอล (เมธานอล) ที่ซื้อมาจากคาร์โลเออร์บาฝรั่งเศสและแอมโมเนียมอะซิเตท (NH4Ac) ซื้อมาจาก Sigma-Aldrich เยอรมนี น้ำยาทุกคนวิเคราะห์ชั้นประถมศึกษาปีหรือสูงกว่า. 2.2 การวัดการวิเคราะห์ได้ดำเนินการโดยใช้สารที่มีประสิทธิภาพเป็นพิเศษคู่กับ quadrupole สาม (UFLC-MS / MS) ที่ใช้ในการอธิบายดังนี้ UFLC Shimadzu (LC 20AD) หัวฉีดอัตโนมัติ Shimadzu (SIL-20A XR) คู่กับ electrospray ไอออนไนซ์ (ESI) แหล่งที่มา (Applied Biosystems, Ontario, แคนาดา) การวิเคราะห์สารเหลวได้ดำเนินการในคอลัมน์ Hypersil ทอง C18 (100 มิลลิเมตร× 2.1 มมรหัส 3 ไมโครเมตรอนุภาคเทอร์โมฟิชเชอร์ทางวิทยาศาสตร์, สหรัฐอเมริกา) ข้อมูลที่ได้มาประมวลผลและใช้ซอฟต์แวร์วิเคราะห์ (เวอร์ชั่น 1.5.1; ABSciex, โตรอนโต, แคนาดา). 2.3 การเก็บตัวอย่างและเครื่องตัวอย่างตัวอย่างที่ได้รับจากอาสาสมัครของ DominguezLab ซึ่งมีการพัฒนาโปรแกรมสำหรับการกำหนดชีวสมมูลยาเสพติด (หมายเลขพิธีสาร: PRO-BEQ-EFV-001-v.01) การเก็บตัวอย่างได้ดำเนินการโดยใช้ระบบสายสวน (BD SAF-T-Intima ™, BD Vacutainer®) และเข็มฉีดยา 5 มิลลิลิตร ตัวอย่างเลือดเก็บเข้า heparinized โพรพิลีน 4 หลอดมิลลิลิตร (NAHEP PLH 13X75 4.0 PLBL GN, BD Vacutainer®, โบรก NE 68822 สหรัฐ) และหมุนเหวี่ยงที่ 3000 รอบต่อนาที (1400 × g) สำหรับการแยกพลาสม่า aliquots 1 มิลลิลิตรถูกเก็บรักษาไว้ในโพรพิลีน 2 มิลลิลิตร cryovials และแช่แข็งที่อุณหภูมิ -20 องศาเซลเซียส± 5 องศาเซลเซียสจนการวิเคราะห์. 2.4 จุดสกัดเมฆหาร 500 ไมโครลิตรของพลาสม่าของมนุษย์ถูกเจือจางด้วย 2 มิลลิลิตรใบสำคัญแสดงสิทธิอนุพันธ์ในหลอด centrifuge 10 มิลลิลิตร หาร 500 ไมโครลิตร Triton X-114 5% w / v ถูกบันทึกและหดหายใช้กวนน้ำวน วิธีการแก้ปัญหาที่เกิดมีเมฆถูกเก็บไว้ที่ 65 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 20 นาทีในการส่งเสริมการรวมตัวของไมเซลล์ลดแรงตึงผิว จากนั้นก็จะถูกหมุนเหวี่ยงที่ 3000 ×กรัมเป็นเวลา 5 นาทีสำหรับการแยกเฟสลดแรงตึงผิวที่อุดมไปด้วย หลังจากที่ทิ้งน้ำใส 400 ไมโครลิตร ACN ถูกเพิ่มเข้าไปในขั้นตอนที่เหลือลดแรงตึงผิวที่อุดมไปด้วยและหมุนเหวี่ยงเพื่อตกตะกอนโปรตีนและแยกพวกเขา หาร 150 ไมโครลิตรของสารละลายถูกย้ายไป 2 ขวดมิลลิลิตรและปรับลดต่อไปด้วย 400 ไมโครลิตรใบสำคัญแสดงสิทธิอนุพันธ์ A30 aliquot ไมโครลิตรของการแก้ปัญหาที่เตรียมไว้เพื่อให้ได้รับการฉีดและวิเคราะห์ลงไปใน UFLC-MS / MS. 3 ผลการอภิปรายและเป็นที่รู้จักกันดีมีประสิทธิภาพ CPE เป็นเงื่อนไขโดยตัวแปรทางเคมีกายภาพเช่นเดียวกับธรรมชาติเมทริกซ์ของตัวอย่างและวิเคราะห์ [14] และ [18] ดังนั้นจึงเป็นที่น่าสนใจในการศึกษาผลกระทบของตัวแปรทางเคมีฟิสิกส์ทดลองในการตอบสนองต่อการวิเคราะห์ของยาต้านไวรัสและเพิ่มประสิทธิภาพของมันที่จะให้บรรลุความไวสูงและการเลือกของวิธีการ. การพัฒนาวิธีการวิเคราะห์โดยใช้วิธีการแก้ปัญหาการสังเคราะห์และการประยุกต์ใช้ต่อไปตัวอย่างจริงมักจะต้องรุนแรง การปรับเปลี่ยน ซึ่งอาจนำไปสู่วิธีการใหม่ที่แตกต่างจากอดีตอย่างใดอย่างหนึ่ง การใช้งานของเมทริกซ์ที่แท้จริงตลอดกระบวนการเป็นทางเลือกที่สะดวกสำหรับการพัฒนาการศึกษาและการเพิ่มประสิทธิภาพของวิธีการวิเคราะห์ที่ได้รับการพัฒนา ในความรู้สึกนี้ไม่ได้เป็นเพียงการเสริมสร้างสัญญาณเนื่องจากการเพิ่มขึ้นของประสิทธิภาพการสกัดส่งผลอย่างมีนัยสำคัญ แต่ยังลดภาระเมทริกซ์ซึ่งนำไปสู่การวิเคราะห์สารที่น่าพอใจ ด้านเหล่านี้เป็นสิ่งที่ในที่สุดก็กำหนดความไวและการเลือกของวิธีการวิเคราะห์ผล ดังนั้นปัจจัยเหล่านั้นโดยเฉพาะอย่างยิ่งของเมทริกซ์ที่แท้จริงเช่นเดียวกับตัวแปรการทดลองทั้งหมดที่มีเงื่อนไขการตอบสนองวิเคราะห์ของยาต้านไวรัสได้รับการประเมินรวมทั้งค่า pH สกัดเข้มข้นลดแรงตึงผิวเวลาสกัดและอุณหภูมิเกลือออกผลและการใช้งานของการปรับเปลี่ยนรวมทั้ง ACN , เมธานอลและกรดตามลำดับ การศึกษาเหล่านี้ได้ดำเนินการโดยการปรับเปลี่ยนตัวแปรหนึ่งในเวลาการรักษาอย่างต่อเนื่องที่เหลือ aliquot ไมโครลิตร 500 ของพลาสม่าเดิมฟรียาต้านไวรัสได้รับการถูกแทงด้วยยาต้านไวรัสมาตรฐานผสม (750 นาโนกรัม mL-1 3 TC และเอบีซี 300 นาโนกรัม mL-1 NFV และ 150 นาโนกรัม mL-1 EFV ใน H2O: 75:25 เมธานอล v / v) และ 50 ไมโครลิตรของ nelfinavir-d3 (ภายในมาตรฐาน 2,200 นาโนกรัม mL-1) สำหรับการดำเนินการตรวจซึ่งถูกทำโดยเพิ่มขึ้นสามเท่า บริเวณยอดเขาโครมาถูกนำมาใช้ในการประเมินผลกระทบของการปรับเปลี่ยนเงื่อนไขการทดลองในการตอบสนองต่อการวิเคราะห์. จากส่วน 3.2, 3.3, 3.4 และ 3.5 จะแสดงผลและการอภิปรายของตัวแปรที่เกี่ยวข้องของงานนี้ ตัวแปรที่เหลือดังกล่าวข้างต้นไม่ได้แสดงผลอย่างมีนัยสำคัญในการตอบสนองการวิเคราะห์ของการศึกษายาต้านไวรัส. 3.1 UFLC-MS / MS เงื่อนไขในการทำงานปัจจุบันที่การเพิ่มประสิทธิภาพMS ได้รับการดำเนินการโดยใช้ยาโดยตรงของการแก้ปัญหามาตรฐานของแต่ละยาต้านไวรัสเข้าไปในแหล่งที่มาของ ESI สเปกโตรมิเตอร์มวลที่ 20 ไมโครลิตรนาที 1 ใช้ในตัวปั๊มหลอดฉีดยา ไอออนฐานของแต่ละยาต้านไวรัสได้รับเลือกจากโหมดการสแกนเต็มรูปแบบที่บันทึกอยู่ในช่วง 50-600 เมตร / z ในทุกกรณี [M + H] + โหมดได้รับการคัดเลือก Declustering ศักยภาพ (DP) ที่มีศักยภาพทางเข้า (EP) และการปะทะกันของเซลล์เข้าที่อาจเกิดขึ้น (CEP) แรงดันไฟฟ้าที่ได้รับการคัดเลือกตามความไวของไอออนฐานผู้นำในขณะที่พลังงานชน (CE) และการปะทะกันของเซลล์ออกจากที่มีศักยภาพ (CXP) ได้รับการแต่งตั้งให้ ความเข้มสูงสุดของไอออนฐานส่วนที่ได้รับ เงื่อนไขการผ่าตัดที่เหลือมีดังนี้ 250 มิลลิวินาทีอาศัยเวลา 5500 V แรงดันสเปรย์ไอออน 20 ปอนด์ต่อตารางนิ้วก๊าซ nebulizer (GS1: N2) ก๊าซม่าน 20 ปอนด์ต่อตารางนิ้ว 7 ปอนด์ต่อตารางนิ้วก๊าซชน (N2) ก๊าซอบแห้ง 20 ปอนด์ต่อตารางนิ้ว (GS2: N2 ) 500 ° C อุณหภูมิการอบแห้งและก๊าซ 100 ° C อุณหภูมิแหล่งที่มา สเปกโตรมิเตอร์มวลที่ใช้ในปฏิกิริยาหลายการตรวจสอบ (MRM) และโหมดการเปลี่ยนเมตร / z สำหรับปริมาณที่เก็บรวบรวมได้ในโหมดบวก 287.1 → 191.2, 316.0 → 168.2, 230.0 → 112.1, 568.4 → 330.1 และ 571.4 → 333.1 เอบีซี, EFV . 3 TC, NFV และ NFV-d3 ตามลำดับการแยกสารได้ดำเนินการโดยใช้เฟสเคลื่อนที่สององค์ประกอบ: A และ B A: 10 มิลลิ NH4Ac: ACN (70:30 v / v) และ B: 100% ACN อัตราการไหลอยู่ที่ 0.25 มิลลิลิตร 1 นาทีและอุณหภูมิคอลัมน์ถูกเก็บไว้ที่อุณหภูมิ 40 องศาเซลเซียสพร้อมทำงาน ปริมาณการฉีด 30 ไมโครลิตรและเวลาทำงาน 4 นาที เวลาการเก็บรักษาสำหรับการวิเคราะห์เป้าหมายอยู่ที่ 1.30, 1.34, 1.61 และ 2.06 นาทีสำหรับเอบีซี 3 TC, NFV และ EFV ตามลำดับ ตัวแทน chromatograms ส่วนผสมมาตรฐานของการวิเคราะห์จะแสดงในรูปที่ 1

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2 . ทดลอง
2.1 . เคมีและสารเคมี

กีตาร์ ซัลเฟต ( USP , มาก f1l487 99.4 % , w / w ) , ยา ( ยาก f0g376 99.8% , w / w ) , ลามิวูดีน ( USP , มาก h0i378 99.7% , w / w ) เนลฟินาเวียร์มีไซเลต ( USP , มาก f0k050 ดีเอ็นเอ , % w / w ) และ nelfinavir-d3 ( เคมี , วิจัย 4-sdj-86-3 โตรอนโตมาก 98 % w / w ) จัดโดย อุตสาหกรรมยาหุ้นโซลูชั่น ( 400 ml μ G − 1 ของแต่ละ ARV ) เตรียมได้โดยละลายมีปริมาณที่เหมาะสมของแต่ละสารประกอบใน Acetonitrile ( ACN ) ทำงานทุกวันโดยโซลูชั่นเตรียมกระจายหุ้นโซลูชั่น กับ ต. การปรับแต่งพารามิเตอร์ที่เหมาะสมของเครื่องมือที่ใช้ 1 , 000 มล. − 1 โซลูชั่นของแต่ละสารประกอบที่เตรียมไว้ในเฟสเคลื่อนที่ ( 10 มม. แอมโมเนียมอะซิเตท : ACN 70 : 30 V / V )ไทรทัน x-114 ( applichem , เยอรมนี ) ถูกเตรียมไว้ในน้ำ ( DW คล้ายเนื้อเยื่อประสานค่า < 3 μ s cm − 1 ) อยู่ในช่วง 2.5 - 10 % ( w / v ) ในระบบ . ACN และเมทานอล ( เมทิลแอลกอฮอล์ ) ซื้อจาก คาร์โล มาฝรั่งเศสและแอมโมเนียมอะซิเตท ( nh4ac ) ซื้อมาจาก Sigma –ดิช , เยอรมนี ทั้งหมดเป็นเกรดวิเคราะห์สารเคมีขึ้นไป

2.2 . เครื่องมือวัด

วิเคราะห์โดยใช้ Ultra ประสิทธิภาพเทคนิคคู่กับคำสาม ( uflc – MS / MS ) ใช้อธิบายดังนี้ : uflc Shimadzu ( LC 20ad ) , Shimadzu หัวฉีดอัตโนมัติ ( sil-20a 9000 ) คู่กับไอวิธีพ่นละอองไฟฟ้า ( ESI ) แหล่ง ( Applied Biosystems , Ontario , แคนาดา ) การวิเคราะห์ทางโครมาโทกราฟีของเหลวถูกดำเนินการใน c18 ขนสีทองคอลัมน์ ( 100 มม. × 21 mm บัตร 3 μ M อนุภาค เทอร์โมฟิชเชอร์ทางวิทยาศาสตร์ , USA ) ข้อมูลที่ได้มาประมวลผลโดยใช้ซอฟต์แวร์วิเคราะห์ ( รุ่น 1.5.1 ; absciex , โตรอนโต , แคนาดา )

2.3 ตัวอย่างและตัวอย่างปรับอากาศ

กลุ่มตัวอย่างอาสาสมัครของ dominguezlab ซึ่งมีการพัฒนาโปรแกรมสำหรับการชีวสมมูลยา ( โปรโตคอลหมายเลข : pro-beq-efv-001-v.01 )ทดลองใช้ระบบสายสวน ( BD saf-t-intima ™ BD vacutainer ® ) และเข็มฉีดยา 5 มิลลิลิตร การเก็บตัวอย่างเลือดในกลุ่มมล โพรพิลีน 4 หลอด ( nahep plh 13x75 4.0 plbl GN BD vacutainer ®หักธนูนี่ 68822 เรา ) และระดับที่ 3 , 000 รอบต่อนาที ( × 1400 กรัม ) สำหรับการแยกพลาสมา .เฉยๆ 1 มิลลิลิตร ถูกเก็บรักษาไว้ในโพ 2 มิลลิลิตร และ cryovials แช่แข็งที่อุณหภูมิ 20 ° C ±− 5 ° C จนถึงการวิเคราะห์

2.4 . เมฆจุดสกัด

500 μ L ส่วนลงตัวของพลาสมาถูกเจือจางด้วย 2 ml DW ใน 10 ml centrifuge หลอด เป็นส่วนลงตัวของ 500 μลิตรไทรทัน x-114 5% w / v และใช้เป็นโฮโมน้ำวนหมุน .เมฆโซลูชั่นซึ่งถูกเก็บไว้ที่ 65 องศา C เป็นเวลา 20 นาทีเพื่อส่งเสริมการควบแน่นของผิวมั . มันเป็นระดับที่ 3000 ×กรัมเป็นเวลา 5 นาทีสำหรับการแยกเฟสรวยสารลดแรงตึงผิว หลังจากทิ้งนำน้ำ 400 ลิตรμ ACN เป็นเพิ่มสารลดแรงตึงผิวที่เหลือรวยเฟสไฟฟ้าในการตกตะกอนโปรตีนและแยกพวกเขา150 μ L ส่วนลงตัวของน่าน ถูกย้ายไป 2 ml ขวดเล็กและเพิ่มเติมเจือจางด้วย 400 μผมแห้ง . ได้μ L ส่วนลงตัวของเพื่อเตรียมสารละลายที่ฉีดและวิเคราะห์ใน uflc-ms / คุณ

3 ผลและการอภิปราย
เป็นที่รู้จักกันดีประสิทธิภาพ CPE อันเนื่องมาจากตัวแปรทางกายภาพและทางเคมี ตลอดจนเมทริกซ์ธรรมชาติของตัวอย่างและสาร [ 14 ] และ [ 18 ] ดังนั้นมันเป็นเรื่องที่น่าสนใจที่จะศึกษาผลของตัวแปรในการทดลองและวิเคราะห์การตอบสนองของยาและเพิ่มประสิทธิภาพต่อการบรรลุความไวสูงและการเลือกวิธีการ

พัฒนาวิธีวิเคราะห์การใช้สารละลายสังเคราะห์และโปรแกรมเพิ่มเติมในตัวอย่างแท้จริง โดยทั่วไปจะต้องมีการปรับเปลี่ยนที่รุนแรงนี้อาจนำไปสู่วิธีการใหม่ที่แตกต่างจากเดิมหนึ่ง ใช้จริงเมทริกซ์ทั้งหมดตามกระบวนการที่เป็นทางเลือกที่สะดวกสำหรับการพัฒนา การศึกษา และการเพิ่มประสิทธิภาพการวิเคราะห์ด้วยวิธีการที่ถูกพัฒนา ในความรู้สึกนี้ , ไม่เพียง แต่สัญญาณเพิ่มเนื่องจากการปรับปรุงประสิทธิภาพในการสกัดผลอย่างมีนัยสำคัญ แต่ยังเมทริกซ์การโหลด ,ซึ่งนำไปสู่ความพึงพอใจ และการวิเคราะห์ ประเด็นเหล่านี้เป็นสิ่งที่ตัดสินใจไวและการเลือกเกิดของผลวิเคราะห์ต่อไป ดังนั้น ปัจจัยเฉพาะของเมทริกซ์จริงเช่นเดียวกับเงื่อนไขการตอบสนองเชิงทดลองตัวแปรของยาต้านไวรัส ได้แก่ การสกัดด้วยสารลดแรงตึงผิว รวมถึง pH , ความเข้มข้นเวลาในการสกัดและอุณหภูมิ , เกลือออก ผลกระทบ และการใช้คำ รวมทั้งสิวปริมาณกรด , และ ตามลำดับ การศึกษานี้ได้ดำเนินการโดยการปรับเปลี่ยนตัวแปรหนึ่งที่เวลาในการรักษาค่าคงที่ตัวที่เหลือ 500 μ L ส่วนลงตัวของพลาสม่า แต่เดิมฟรียา , C มาตรฐานการผสม ( TC 750 ของมล − 1 3 และ ABC 300 ng ml − 1 nfv 150 นาโน ml − 1 efv ใน H2O :ปริมาณ 5 v / v ) และ 50 μลิตร ( มาตรฐาน ภายใน nelfinavir-d3 2200 ของมล − 1 ) สําหรับการดําเนิน ) ซึ่งได้กระทำโดยทำสำเนาสามฉบับ . พื้นที่สูงสุด และถูกใช้เพื่อศึกษาผลกระทบของการปรับเปลี่ยนสภาวะในการตอบสนองเชิงวิเคราะห์

ส่วน 3.2 , 3.3 , 3.4 และ 3.5 จะเสนอผลและการอภิปรายของตัวแปรที่เกี่ยวข้องกับงานนี้เหลือตัวที่กล่าวถึงข้างต้น ไม่ได้แสดงผลต่อการตอบสนองการใช้ยาต้านไวรัส .

1 . uflc-ms / MS เงื่อนไข

ในงานปัจจุบัน , การเพิ่มประสิทธิภาพ MS ได้ โดยใช้ฉีดโดยตรงของโซลูชั่นมาตรฐานของแต่ละยาต้านไวรัสใน de ESI แหล่งของแมสสเปกโทรมิเตอร์ที่ 20 μผมมิน− 1 โดยใช้ปั๊มเข็มในตัวฐานไอออนของแต่ละยาได้รับเลือกจากแบบเต็มสแกนโหมดบันทึกในช่วง 50 - 600 m / Z . ทุกกรณี [ M ] โหมดที่ถูกเลือก declustering ศักยภาพ ( DP ) ที่มีศักยภาพเข้า ( EP ) และศักยภาพเข้าชน ( ซี พี ) แรงดันไฟฟ้าเซลล์ถูกเลือกตามความไวของฐานสารไอออนในขณะที่พลังงานการชน ( CE ) และศักยภาพออกจากเซลล์ชน ( cxp ) ถูกเลือกเพื่อให้สูงสุดได้มีความเข้มของฐานไอออน เหลือและเงื่อนไขดังนี้ 250 ms เวลาหน่วง 5500 V ไอออนสเปรย์แรงดัน 20 psi nebulizer ก๊าซ ( GS1 : N2 ) 20 psi ม่านก๊าซ 7 PSI แก๊สชน ( 2 ) 20 psi ก๊าซแห้ง ( GS2 : N2 )500 ° C อุณหภูมิ 100 องศา C แหล่งก๊าซและอุณหภูมิการอบแห้ง สเปกโตรมิเตอร์มวลใช้ในการตรวจสอบหลายปฏิกิริยา ( mrm ) และโหมดการเปลี่ยน M / Z สำหรับปริมาณเก็บรวบรวมในโหมดบวกเป็น 287.1 → keyboard - key - name 191.2 316.0 → keyboard - key - name , 168.2 230.0 → keyboard - key - name , 112.1 568.4 → keyboard - key - name , และ 330.1 571.4 → keyboard - key - name 333.1 สำหรับ ABC , efv 3 TC และ nfv

nfv-d3 ตามลำดับการแยกและการใช้เฟสเคลื่อนที่สององค์ประกอบ : A และ B : 10 มม. nh4ac : ACN ( 70 : 30 v / v ) และ B : 100% ต. . อัตราการไหลไว้ที่ 0.25 มิลลิลิตรต่อนาที− 1 และคอลัมน์ที่ถูกเก็บไว้ที่อุณหภูมิ 40 องศา C พร้อมวิ่ง ปริมาณการฉีด คือ 30 μ L และใช้เวลา 4 นาทีเวลาการเก็บรักษาสำหรับเป้าหมายสารเป็น 1.30 , 1.34 , 1.61 2.06 นาที 3 TC , ABCและ nfv efv ตามลำดับ ตัวแทนกลิ่นของส่วนผสมมาตรฐานของสารถูกแสดงในรูปที่ 1