2. Materials and methods2.1. Plant

2. Materials and methods
2.1. Plant material

Mature green mango (M. indica L. cv. Guifei) fruit at 126.3 ± 5.6 N of firmness and 8.5 ± 0.2 °Brix of total soluble solids (n = 10) were harvested from a commercial orchard located in Dongfang city, Hainan Province of China. Fruit were transported to the postharvest laboratory within 6 h. Fruit of uniform size and appearance, and that are free of visible symptoms of any disease were selected for the experiments.

2.2. Pathogen

C. gloeosporioides was isolated from infected mango fruit and kept on potato dextrose agar (PDA) at 4 °C. The pathogen was inoculated into mango fruit wounds and re-isolated into potato dextrose broth (PDB) for further use. The spores of the pathogen were removed from 2-week-old PDB cultures incubated at 25 °C and then suspended in 10 mL of sterile distilled water containing 0.05% (v/v) Tween 80. The suspension was filtered through 4 layers of sterile cheese cloth to remove the mycelia. The number of spores was counted with a hemacytometer, and the concentration was adjusted to 1 × 106 spores mL−1 with sterile distilled water.

2.3. In vitro antifungal activity

The effects of BABA (Yuanye Co., Ltd., Shanghai, China) on the in vitro growth of C. gloeosporioides were tested. BABA solution mixed with molten PDA to give a total volume of 20 mL per petri plate (diameter: 120 mm). BABA concentrations in the PDA were 0, 25, 50, 100, 200 and 400 mM. After the PDA had solidified, an 8-mm diameter disk of mycelial mat from a 1-week-old culture was placed in the center of each Petri plate containing PDA and BABA. The mycelial growth as expressed by diameter (mm) was recorded after 1, 3, 5 and 7 days of incubation at 25 ± 1 °C. Each treatment concentration was replicated three times, and the experiment was repeated twice.

The effects of BABA on spore germination of C. gloeosporioides were assayed in PDB using the method of Yao and Tian (2005). Aliquots of 100 μL of spore suspension at 1 × 106 were individually transferred to glass tubes with PDB, which contained BABA at different concentrations (0, 25, 50, 100, 200 and 400 mM). All the tubes were put on a rotary shaker at 100 rpm at 25 °C and incubated for up to 12 h. Approximately 200 spores were measured at 3 h intervals for germination rate per replicate, with 3 replicates for each treatment. The experiment was repeated twice.

2.4. BABA treatment and inoculation

Mango fruit were disinfected with 2% (v/v) sodium hypochlorite for 2 min, rinsed with tap water, air-dried and then divided randomly into 4 treatment groups, 120 fruit for each group. Three groups were dipped in 25, 50 and 100 mM BABA solutions containing 0.05% (v/v) Tween 80 at 25 ± 1 °C for 5 min as described in Yin et al. (2010). Another group (control) was treated with distilled water containing 0.05% (v/v) Tween 80 for 5 min. After 24 h of treatments with BABA or water, a uniform wound (3 mm deep × 3 mm wide) was made at the equator of each fruit using a sterile dissecting needle, followed by inoculation of a 10-μL conidial suspension of C. gloeosporioides (1 × 106 spores mL−1) into each wounded site. Inoculated fruit were placed in covered plastic boxes with small holes and stored at 25 ± 1 °C and RH 85–90%. Diameters of lesions caused by C. gloeosporioides in the mango fruit were recorded at 4 and 6 days after inoculation, each treatment had three replicates with 15 fruit per replicate. The remaining fruit with inoculation were used for determination of physio-biochemical parameters as described below.

2.5. Sample collecting

The fruit mesocarp tissue at 3–10 mm below the skin and 5–15 mm from the edge of the inoculated lesion was daily taken with a stainless steel cork borer during storage. The tissue samples were frozen in liquid nitrogen and stored at −80 °C until analyzed.

2.6. Enzyme assays

The fruit treated with BABA at the optimum concentration of 100 mM, based on the results of antifungal activity in vivo, were used for analysis of enzymes and metabolites. Five-gram samples of frozen mango tissue derived from three fruit, with 3 replicates for each treatment, were ground with a mortar and pestle on ice and homogenized with various pre-cooled extracting buffers as follows: 5 mL of 100 mM boric acid buffer (pH 8.8) containing 4% (w/v) polyvinylpyrrolidone, 1 mM ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA) and 50 mM β-mercaptoethanol for phenylalanine ammonia lyase (PAL); 5 mL of 50 mM sodium acetate buffer (pH 5.2) containing 1 mM EDTA, 5 mM β-mercaptoethanol and 5 mM ascorbic acid for β-1,3-glucanase (GLU) and chitinase (CHT); 5 mL of 100 mM sodium phosphate buffer (pH 7.5) containing 5% (w/v) polyvinylpyrrolidone and 5 mM dithiothreitol for superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT), and 5 mL of 100 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5) containing 2% polyvinylpyrrolidone, 1 mM ascorbic acid and 1 mM EDTA for ascorbate peroxidase (APX). The extracts were then centrifuged at 15,000 × g for 20 min at 4 °C. The supernatants were used for the enzyme assays.

PAL activity was assayed as described by method of Assis et al. (2001), with some modifications. Enzyme extract (0.5 mL) was incubated with 0.5 mL of 20 mM l-phenylalanine and 2 mL of 50 mM borate buffer (pH 8.8) at 37 °C for 1 h. The reaction was stopped with 0.1 mL HCl (6 M). The increase in absorbance at 290 nm due to the formation of trans-cinnamate was measured spectrophotometrically. PAL activity was expressed as U290, where U290 = 0.01 ΔA290 mg−1 protein h−1.

GLU activity was assayed by measuring the amount of reducing sugar released from the substrate according to the method of Ippolito et al. (2000), with some modifications. Enzyme extract was dialyzed at 4 °C for 12 h and then centrifuged at 12,000 × g for 20 min at 4 °C. The supernatant (2 mL) was incubated with 0.2 mL of laminarin (0.5%, w/v) for 60 min at 37 °C. Afterward, 1 mL of the mixture was removed and diluted 1:1 with sterile distilled water. The color reaction was terminated by adding 1.5 mL of 3,5-dinitrosalicylate and boiling for 5 min in a water bath. The solution was diluted to 25 mL with distilled water, and the amount of reducing sugar was measured spectrophotometrically at 540 nm. Activity values were expressed as U μg−1 protein. One unit (U) was defined as the enzyme activity catalyzing the formation of 1 nmol s−1 glucose equivalent.

CHT activity was assayed using the method of Wirth and Wolf (1990), with slight modification. CHT activity was measured by mixing 1.5 mL of a crude enzyme dialytic solution as described for GLU, with 2 mL of 2% dye-labeled carboxymethylchitin in 50 mM sodium acetate buffer (pH 5.0). After incubation at 37 °C for 1 h, the reaction was stopped by adding 0.1 mL of 1.0 M HCl. The mixture was cooled on ice and centrifuged at 15,000 × g for 5 min. The absorbance of the supernatant was measured at 550 nm. CHT activity was calculated and expressed in U μg−1 protein. One unit (U) was defined as the amount of enzyme required to catalyze the formation of 1 nmol min−1 of product (N-acetyl-d-glucosamine).

SOD activity was determined photochemically as described in Toivonen and Sweeney (1998). The reaction solution contained 50 mM sodium phosphate (pH 7.8), 13 mM methionine, 100 μM EDTA and 75 μM nitro-blue-tetrazolium (NBT). To 2.7 mL of this solution were added 0.1 mL of enzyme extract and 0.2 mL of 200 μM riboflavin. The tubes were then placed in a 40 W-fluorescent-light incubator for 15 min. Blue formazan formation was then monitored by recording the absorbance at 560 nm. One unit (U) of SOD activity is defined as the amount of enzyme that causes a 50% inhibition of NBT reduction under assay conditions. The results are reported as U mg−1 protein.

CAT activity was assayed according to the method of Chance and Maehly (1955). The reaction mixture consisted of 50 mM sodium phosphate (pH 7.0), 20 mM H2O2 and 100 μL enzyme extract in a total volume of 3 mL. H2O2 degradation was measured by the decrease in absorbance at 240 nm. CAT activity is expressed as U240, where U240 = 0.01 ΔA240 mg−1 protein min−1.

APX activity was assayed using the method of Nakano and Asada (1987), with some modifications. The mixture contained 50 mM potassium phosphate (pH 7.0), 0.25 mM ascorbic acid, 0.05 mM EDTA and 0.2 mL enzyme extract in a total volume of 2.7 mL. After adding 0.3 mL of H2O2 to a final concentration of 0.2 mM, the change in absorbance was monitored at 290 nm. APX activity is expressed as U290, in which U290 = 0.01ΔA290 mg−1 protein min−1.

Protein content in the enzyme extracts was determined using the Bradford (1976) method with bovine serum albumin as the standard.

2.7. Assays of reactive oxygen determination

The superoxide radical (O2radical dot−) production rate was determined using the method of Elstner and Heupel (1976), with some modifications. Five gram samples of frozen mango tissue derived from three fruit, with 3 replicates for each treatment, were ground with a mortar and pestle on ice, and homogenized with 5 mL of 50 mM sodium phosphate buffer (pH 7.8) containing 1 mM EDTA, 1% polyvinylpyrrolidone (PVP, w/v) and 0.3% Triton X-100. The homogenate was centrifuged at 5000 × g for 15 min at 4 °C. A 0.5-mL aliquot of the supernatant was mixed with 1.0 mL of 100 mM sodium phosphate buffer (pH 7.8) and 0.5 mL of 10 mM hydroxylamine hydrochloride. After incubation for 20 min at 25 °C, 1 mL of the above reaction mixture was added to 1 mL of 17 mM 4-aminobenzene sulfonic acid, and 1 mL of 7 mM α-naphthylamine was added to the mixture for a further 20 min at 25 °C. Then, 4 mL of n-butanol was added into the reaction mixture. The absorbance of the n-butanol phase was measured at 530 nm used for the measurement of O2radical dot− The O2radical dot− production rate was expressed as μmol min−1 g−1 FW.

The hydrogen peroxide (H2O2) content was determined according to the method described by Prochazkova et al. (2001). Five-gram samples of f

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2. วัสดุและวิธีการ2.1. พืชวัสดุทีมสีเขียว (M. indica L. พันธุ์ Guifei) มะม่วงที่ 126.3 ± 5.6 N ของไอซ์และ 8.5 ± 0.2 ° Brix ของของแข็งละลายน้ำรวม (n = 10) ได้เก็บเกี่ยวผลผลิตจากสวนเชิงพาณิชย์ที่ตั้งอยู่ในเมืองตงฟาง มณฑลไหหลำของจีน ผลไม้ถูกขนส่งไปห้องปฏิบัติการหลังการเก็บเกี่ยวภายใน 6 h. ผลไม้เป็นรูปแบบขนาดและลักษณะ และที่ไม่ปรากฏอาการของโรคใด ๆ ถูกเลือกสำหรับการทดลอง2.2 การศึกษาC. gloeosporioides ที่แยกได้จากมะม่วงติดเชื้อ และเก็บไว้ในมันฝรั่งขึ้น agar (PDA) ที่ 4 องศาเซลเซียส การศึกษา inoculated เป็นแผลผลไม้มะม่วง และแยกต่างหากเป็นมันฝรั่งขึ้นซุป (PDB) เพิ่มเติมใช้อีกครั้ง เพาะเฟิร์นของการศึกษาถูกลบออกจากอายุ 2 สัปดาห์วัฒนธรรม PDB incubated ที่ 25 ° C และหยุดชั่วคราวแล้ว ใน 10 mL ใส่น้ำกลั่นประกอบด้วย 0.05% (v/v) Tween 80 การระงับที่กรองผ่านผ้ากอซชีเอา mycelia ชั้น 4 จำนวนเพาะเฟิร์นถูกนับ ด้วย hemacytometer เป็น และถูกปรับความเข้มข้น 1 × 106 mL−1 เพาะเฟิร์นน้ำกลั่นที่ฆ่าเชื้อ2.3 การกิจกรรมเพาะในต้านเชื้อรามีทดสอบผลของบาบา (Yuanye Co., Ltd. เซี่ยงไฮ้ จีน) การเจริญเติบโตการเพาะเลี้ยงของ C. gloeosporioides โซลูชั่นบาผสมกับ PDA ที่หลอมเหลวเพื่อให้ปริมาตรรวมของ 20 mL ต่อจาน petri (เส้นผ่าศูนย์กลาง: 120 mm) ความเข้มข้นของบาบาใน PDA มี 0, 25, 50, 100, 200 และ 400 มิลลิเมตร หลังจาก PDA ที่มีหล่อ ถูกวางไว้บนเส้นผ่าศูนย์กลาง 8 มม.ของพรม mycelial จากวัฒนธรรมอายุ 1 สัปดาห์ในแต่ละจาน Petri PDA และบาบา บันทึกการเจริญเติบโต mycelial เป็นแสดงโดยเส้นผ่าศูนย์กลาง (mm) หลัง 1, 3, 5 และ 7 วันบ่มที่ 25 ± 1 องศาเซลเซียส แต่ละความเข้มข้นรักษาถูกจำลองแบบแล้วสามครั้ง และทดลองได้ซ้ำสองผลของภาพในการงอกสปอร์ของ C. gloeosporioides ได้ assayed ใน PDB ที่ใช้วิธีการยาวและเทียน (2005) Aliquots μL 100 การระงับสปอร์ที่ 1 × 106 แต่ละได้ถูกโอนย้ายไปหลอดแก้วด้วย PDB ซึ่งประกอบด้วยภาพที่ความเข้มข้นแตกต่างกัน (0, 25, 50, 100, 200 และ 400 มิลลิเมตร) ทั้งหมดใส่เชคเกอร์โรตารี่ที่ 100 รอบต่อนาทีที่ 25 ° C และ incubated สำหรับ 12 h. 200 เพาะเฟิร์นถูกวัดในช่วงเวลา 3 h สำหรับอัตราการงอกต่อจำลอง 3 หลอดเหมือนกับการรักษาแต่ละ ทดลองถูกทำซ้ำสอง2.4 การภาพบำบัดและ inoculationมะม่วงถูกฆ่าเชื้อ ด้วยฟอก 2% (v/v) ใน 2 นาที rinsed ด้วยน้ำประปา air-dried กแล้ว แบ่งออกได้เป็น 4 รักษากลุ่ม ผลไม้ 120 สำหรับแต่ละกลุ่ม กลุ่มที่สามถูกจุ่มลงในโซลูชันภาพ 25, 50 และ 100 มม.ที่ประกอบด้วย 0.05% (v/v) Tween 80 ที่ 25 ± 1 ° C สำหรับ 5 นาทีตามที่อธิบายไว้ในยิน et al. (2010) กลุ่มอื่น (ควบคุม) ที่รักษา ด้วยน้ำกลั่นที่ประกอบด้วย 0.05% (v/v) Tween 80 สำหรับ 5 นาที หลังจากทำ 24 ชมของการบำบัดน้ำ เหมือนแผล (3 มม.ลึก×กว้าง 3 มิลลิเมตร) หรือบาที่เส้นศูนย์สูตรของผลไม้แต่ละใช้เข็ม dissecting กอซ ตาม ด้วย inoculation 10 μL conidial ระงับ C. gloeosporioides (1 × 106 เพาะเฟิร์น mL−1) ในแต่ละไซต์ที่ได้รับบาดเจ็บ ผลไม้ inoculated ถูกวางในกล่องครอบคลุมพลาสติกที่มีรูเล็ก ๆ และเก็บที่ 25 ± 1 ° C และ 85-90% RH ปัจจุบันได้เกิดจาก C. gloeosporioides ในมะม่วงผลไม้ถูกบันทึกในวันที่ 4 และ 6 หลังจาก inoculation ทรีตเมนท์ได้เหมือนกับสาม ด้วยผลไม้ 15 ต่อจำลอง ผลไม้ที่เหลือกับ inoculation ถูกใช้สำหรับการกำหนดพารามิเตอร์ physio ชีวเคมีอธิบายไว้ด้านล่าง2.5 การรวบรวมตัวอย่างถูกทุกวันมีนำเนื้อเยื่อ mesocarp ผลไม้ที่ 3-10 มม.ด้าน ล่างผิว และ 5-15 มม.จากขอบของรอยโรค inoculated กับ borer คอร์กเป็นสแตนเลสระหว่างการเก็บรักษา ตัวอย่างเนื้อเยื่อถูกแช่แข็งในไนโตรเจนเหลว และเก็บไว้ที่ −80 ° C จนกว่าจะวิเคราะห์2.6. เอนไซม์ assaysผลรับที่ความเข้มข้นสูงสุดของ 100 มม. ขึ้นอยู่กับผลลัพธ์ของกิจกรรมในสัตว์ทดลอง ต้านเชื้อราบาถูกใช้สำหรับการวิเคราะห์เอนไซม์และ metabolites ตัวอย่าง 5 กรัมของเนื้อเยื่อมะม่วงแช่แข็งที่มาจากผลไม้สาม กับ 3 เหมือนกับการรักษาแต่ละ ถูกพื้นดินกับตัวโกร่งบนน้ำแข็ง และ homogenized เป็นกลุ่มกับบัฟเฟอร์ขยายก่อนเย็น ๆ ต่าง ๆ เป็นดังนี้: mL 5 มม. 100 กรด boric บัฟเฟอร์ (pH 8.8) มี 4% (w/v) polyvinylpyrrolidone กรด tetraacetic diamine เอทิลีน 1 มม. (EDTA) และβ-mercaptoethanol 50 มม.สำหรับ phenylalanine แอมโมเนีย lyase (PAL); 5 mL 50 mM โซเดียม acetate บัฟเฟอร์ (pH 5.2) มี 1 mM EDTA β-mercaptoethanol 5 มม. และ 5 มม.กรดแอสคอร์บิคβ-1,3-คัด (GLU) และ chitinase (CHT); mL 5 ของ 100 มม.โซเดียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (pH 7.5) ที่มี 5% (w/v) polyvinylpyrrolidone และ 5 มม. dithiothreitol ซูเปอร์ออกไซด์ dismutase (SOD) catalase (แมว), และ 5 mL 100 มม.โพแทสเซียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (pH 7.5) มี 2% polyvinylpyrrolidone กรดแอสคอร์บิค 1 มม. และ 1 มม. EDTA สำหรับ ascorbate peroxidase (ให้ APX) สารสกัดได้จากนั้น centrifuged ที่ 15000 × g สำหรับ 20 นาทีที่ 4 องศาเซลเซียส Supernatants ถูกใช้สำหรับ assays เอนไซม์กิจกรรมพาลถูก assayed ตามที่อธิบายไว้ โดยวิธีของช่วยเหลือและ al. (2001), มีการปรับเปลี่ยนบางอย่าง สารสกัดจากเอนไซม์ (0.5 มล.) ที่ incubated กับ 0.5 mL 20 มม. l phenylalanine และ 2 mL 50 มม. borate บัฟเฟอร์ (pH 8.8) ที่ 37 ° C สำหรับ 1 h หยุดปฏิกิริยากับ HCl (6 M) 0.1 mL เพิ่ม absorbance ที่ 290 nm เนื่องจากการก่อตัวของทรานส์ cinnamate เป็นวัด spectrophotometrically กิจกรรมพาลถูกแสดงเป็น U290 ที่ U290 = 0.01 ΔA290 mg−1 โปรตีน h−1กิจกรรม GLU ถูก assayed โดยวัดจำนวนลดน้ำตาลออกจากพื้นผิวตามวิธีของ Ippolito et al. (2000), มีการปรับเปลี่ยนบางอย่าง สารสกัดจากเอนไซม์ dialyzed ที่ 4 ° C สำหรับ 12 h และ centrifuged แล้ว ที่ 12000 × g สำหรับ 20 นาทีที่ 4 องศาเซลเซียส Supernatant (2 mL) ถูก incubated กับ 0.2 mL ของ laminarin (0.5%, w/v) ใน 60 นาทีที่ 37 องศาเซลเซียส หลังจากนั้น 1 mL ของผสมถูกเอาออก และผสม 1:1 ด้วยน้ำกลั่นฆ่าเชื้อ ปฏิกิริยาสีถูกยกเลิก โดยเพิ่ม 1.5 mL 3,5 dinitrosalicylate และเดือดสำหรับ 5 นาทีในการอาบน้ำ โซลูชันถูกผสมกับ 25 mL ด้วยน้ำกลั่น และยอดลดน้ำตาลที่วัด spectrophotometrically ที่ 540 nm กิจกรรมค่าถูกแสดงเป็นโปรตีน μg−1 U หนึ่งหน่วย (U) ถูกกำหนดเป็นเอนไซม์ catalyzing การก่อตัวของ 1 nmol s−1 กลูโคสเทียบเท่ากิจกรรม CHT ถูก assayed ด้วยวิธีของ Wirth และหมาป่า (1990), ปรับเปลี่ยนเล็กน้อย กิจกรรม CHT ถูกวัด โดยผสม 1.5 mL ของเอนไซม์ดิบ dialytic แก้ไขปัญหาตามที่อธิบายไว้สำหรับ GLU กับ mL 2 ของ carboxymethylchitin การย้อมชื่อ 2% ในบัฟเฟอร์ acetate โซเดียม 50 มม. (pH 5.0) หลังจากบ่มที่ 37 ° C สำหรับ 1 h ปฏิกิริยาถูกหยุดลง โดยเพิ่ม 0.1 mL ของ 1.0 M HCl ส่วนผสมระบายความร้อนด้วยออ และ centrifuged ที่ 15000 × g ใน 5 นาที มีที่วัด absorbance ของ supernatant 550 nm กิจกรรม CHT ถูกคำนวณ และแสดงในโปรตีน μg−1 U หนึ่งหน่วย (U) ถูกกำหนดเป็นจำนวนของเอนไซม์ที่จำเป็นในการสถาบันการก่อตัวของ min−1 1 nmol ผลิตภัณฑ์ (N-acetyl-d-glucosamine)ได้กำหนดกิจกรรมสด photochemically ใน Toivonen และ Sweeney (1998) การแก้ปัญหาปฏิกิริยาอยู่ 50 mM โซเดียมฟอสเฟต (pH 7.8), 13 มม. methionine, 100 μM EDTA และ 75 μM ไนโตรบลู-tetrazolium (เอ็นบีที) การ 2.7 mL ของโซลูชั่นนี้ได้เพิ่ม 0.1 mL สารสกัดเอนไซม์ และ 0.2 mL ของวิตามิน μM 200 หลอดแล้วไว้ใน incubator เป็น W แสงฟลูออเรสเซนต์ 40 สำหรับก่อ formazan บลู 15 นาทีได้แล้วตรวจสอบบันทึก absorbance ที่ 560 nm หนึ่งหน่วย (U) ของกิจกรรมสดไว้เป็นจำนวนของเอนไซม์ที่ทำให้เกิดการยับยั้ง 50% ลดเอ็นบีทีภายใต้เงื่อนไขการทดสอบ มีรายงานผลเป็นโปรตีน mg−1 Uกิจกรรมแมวถูก assayed ตามวิธีการของโอกาสและ Maehly (1955) ส่วนผสมปฏิกิริยาประกอบด้วยฟอสเฟตโซเดียม 50 มม. (pH 7.0), 20 มม. H2O2 และเอนไซม์ μL 100 สารสกัดในปริมาณรวมของ 3 mL สลายตัวของ H2O2 ถูกวัด โดยลดลง absorbance ที่ 240 nm กิจกรรมแมวจะแสดงเป็น U240 ที่ U240 = 0.01 ΔA240 mg−1 โปรตีน min−1กิจกรรมให้ APX ถูก assayed ด้วยวิธีของนากาโนะและ Asada (1987), ปรับเปลี่ยนบางอย่าง ผสมอยู่ 50 มม.โพแทสเซียมฟอสเฟต (pH 7.0), กรดแอสคอร์บิค 0.25 mM, 0.05 mM EDTA และเอนไซม์ 0.2 mL สารสกัดในปริมาณรวมของ 2.7 mL หลังจากเพิ่ม 0.3 mL ของ H2O2 ที่ความเข้มข้นสุดท้ายของ 0.2 mM การเปลี่ยนแปลง absorbance ถูกตรวจสอบที่ 290 nm แสดงเป็น U290 กิจกรรมให้ APX ในที่ U290 = 0.01ΔA290 min−1 mg−1 โปรตีนโปรตีนในสารสกัดจากเอนไซม์ถูกกำหนดด้วยวิธีแบรดฟอร์ด (1976) วัว serum albumin เป็นมาตรฐาน2.7. assays ของกำหนดปฏิกิริยาออกซิเจนการซูเปอร์ออกไซด์รุนแรง (O2radical dot−) อัตราการผลิตที่ถูกกำหนดด้วยวิธีการของ Elstner และ Heupel (1976), ปรับเปลี่ยนบางอย่าง ตัวอย่าง 5 กรัมของเนื้อเยื่อมะม่วงแช่แข็งที่มาจากผลไม้สาม กับ 3 เหมือนกับการรักษาแต่ละ ถูกพื้นดินกับตัวโกร่งบนน้ำแข็ง และ homogenized เป็นกลุ่ม ด้วย 5 mL ของ 50 mM โซเดียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (pH 7.8) 1 มม.ที่มี EDTA, polyvinylpyrrolidone 1% (PVP, w/v) และ 0.3% ไตรตั้น X 100 Homogenate ถูก centrifuged ที่ 5000 × g สำหรับ 15 นาทีที่ 4 องศาเซลเซียส ส่วนลงตัว 0.5 mL ของ supernatant ถูกผสมกับ 1.0 mL 100 มม.โซเดียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (pH 7.8) และ 0.5 mL ของ 10 มม. hydroxylamine ไฮโดรคลอไรด์ หลังจากฟักตัวใน 20 นาทีที่ 25 ° C, 1 mL ของผสมปฏิกิริยาข้างต้นถูกเพิ่มเข้ามา 1 mL ของ 17 มม. 4 aminobenzene ลกรด และ 1 mL ของ 7 มมด้วยกองทัพ-naphthylamine ถูกเพิ่มส่วนผสมสำหรับ 20 นาทีเพิ่มเติมที่ 25 องศาเซลเซียส , 4 mL ของเอ็นบิวทานอถูกเพิ่มลงในส่วนผสมของปฏิกิริยาด้วย มีที่วัด absorbance ของเฟสเอ็นบิวทานอ 530 nm ใช้สำหรับวัดอัตราการผลิต dot− dot− O2radical O2radical ถูกแสดงเป็น μmol min−1 g−1 FWไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ (H2O2) เนื้อหาที่ถูกกำหนดตามวิธีการอธิบายไว้โดย Prochazkova et al. (2001) ตัวอย่าง 5 กรัมของ f

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2. วัสดุและวิธีการ
2.1 โรงงานวัสดุผู้ใหญ่มะม่วงสีเขียว (เอ็มพันธุ์ indica L. . Guifei) ผลไม้ที่ 126.3 ± 5.6 ไม่มีความแน่นของและ 8.5 ± 0.2 ° Brix ของของแข็งที่ละลายได้ทั้งหมด (n = 10) ได้รับการเก็บเกี่ยวจากสวนผลไม้ในเชิงพาณิชย์ตั้งอยู่ในเมือง Dongfang ไหหลำ จังหวัดของจีน ผลไม้ถูกส่งไปยังห้องปฏิบัติการหลังการเก็บเกี่ยวภายใน 6 ชั่วโมง ผลไม้ที่มีขนาดสม่ำเสมอและลักษณะและการที่มีอิสระของอาการที่มองเห็นของโรคใด ๆ ที่ถูกเลือกสำหรับการทดลอง. 2.2 เชื้อโรคซี gloeosporioides ที่แยกได้จากผลไม้มะม่วงที่ติดเชื้อและเก็บไว้ในอาหารเลี้ยงเชื้อเดกซ์โทรสมันฝรั่ง (PDA) ที่ 4 ° C เชื้อโรคได้รับเชื้อเข้าไปในแผลผลไม้มะม่วงและอีกครั้งที่แยกลงในน้ำซุปมันฝรั่งเดกซ์โทรส (PDB) สำหรับการใช้งานต่อไป สปอร์ของเชื้อออกจาก 2 สัปดาห์อายุวัฒนธรรม PDB บ่มที่อุณหภูมิ 25 องศาเซลเซียสและระงับแล้วใน 10 มิลลิลิตรของน้ำกลั่นปลอดเชื้อที่มี 0.05% (v / v) Tween 80 ช่วงล่างที่ได้รับการกรองผ่านชั้น 4 ของการฆ่าเชื้อ ผ้าชีสที่จะเอาเส้นใย จำนวนสปอร์ที่ได้รับการนับด้วย hemacytometer และความเข้มข้นปรับ 1 × 106 สปอร์ mL-1 ด้วยน้ำกลั่นปลอดเชื้อ. 2.3 ในกิจกรรมต้านเชื้อราหลอดทดลองผลของ BABA (Yuanye จำกัด , เซี่ยงไฮ้, จีน) ในในหลอดทดลองการเจริญเติบโตของ gloeosporioides ซีได้มีการทดสอบ วิธีการแก้ปัญหา BABA ผสมกับ PDA เหลวที่จะให้ปริมาณรวมของ 20 มิลลิลิตรต่อจานเพาะเชื้อ (เส้นผ่าศูนย์กลาง 120 มิลลิเมตร) ความเข้มข้นใน BABA PDA เป็น 0, 25, 50, 100, 200 และ 400 มิลลิ หลังจากที่พีดีเอได้ผลึกดิสก์ขนาดเส้นผ่าศูนย์กลาง 8 มิลลิเมตรเสื่อเส้นใยจากวัฒนธรรม 1 สัปดาห์เก่า ๆ ได้ถูกวางไว้ในศูนย์ของแต่ละจานเลี้ยงเชื้อที่มี PDA และ BABA การเจริญเติบโตของเส้นใยที่แสดงโดยมีขนาดเส้นผ่าศูนย์กลาง (มม) จะถูกบันทึกหลังวันที่ 1, 3, 5 และ 7 วันของการบ่มที่อุณหภูมิ 25 ± 1 ° C ความเข้มข้นของการรักษาแต่ละคนได้รับการจำลองแบบสามครั้งและทดลองซ้ำเป็นครั้งที่สอง. ผลของ BABA ต่อการงอกของสปอร์ของเชื้อรา C. ถูก assayed ใน PDB ใช้วิธีการยาวและท่าเตียน (2005) aliquots 100 ไมโครลิตรของสปอร์แขวนลอยที่ 1 × 106 ถูกย้ายเป็นรายบุคคลเพื่อหลอดแก้วที่มี PDB ซึ่งประกอบด้วย BABA ที่ระดับความเข้มข้นที่แตกต่างกัน (0, 25, 50, 100, 200 และ 400 มิลลิเมตร) หลอดทั้งหมดถูกใส่ในเครื่องปั่นหมุนที่ 100 รอบต่อนาทีที่ 25 ° C และบ่มนานถึง 12 ชั่วโมง ระยะทางประมาณ 200 สปอร์วัดที่ 3 ช่วงเวลาชั่วโมงสำหรับอัตราการงอกต่อซ้ำมี 3 ซ้ำสำหรับการรักษาแต่ละ การทดลองซ้ำกันสองครั้ง. 2.4 การรักษาและการให้วัคซีน BABA ผลไม้มะม่วงถูกฆ่าเชื้อ 2% (v / v) โซเดียมไฮโปคลอไรต์เป็นเวลา 2 นาทีล้างด้วยน้ำประปาอากาศแห้งและแบ่งออกสุ่มเป็น 4 กลุ่มการรักษาผลไม้ 120 สำหรับแต่ละกลุ่ม กลุ่มที่สามถูกจุ่มลงในวันที่ 25, 50 และ 100 มิลลิ BABA โซลูชั่นที่มี 0.05% (v / v) Tween 80 ที่ 25 ± 1 ° C เป็นเวลา 5 นาทีตามที่อธิบายไว้ในหยิน et al, (2010) อีกกลุ่ม (ควบคุม) ได้รับการรักษาด้วยน้ำกลั่นที่มี 0.05% (v / v) Tween 80 เป็นเวลา 5 นาที หลังจาก 24 ชั่วโมงของการรักษาด้วย BABA หรือน้ำแผลเครื่องแบบ (3 มม× 3 มม) ที่ถูกสร้างขึ้นที่เส้นศูนย์สูตรของแต่ละผลไม้โดยใช้เข็มผ่าตัดปลอดเชื้อตามด้วยการฉีดวัคซีนของการระงับ 10 ไมโครลิตรเชื้อรา C. gloeosporioides ของ (1 × 106 สปอร์ mL-1) ในแต่ละเว็บไซต์ที่ได้รับบาดเจ็บ ผลไม้เชื้อถูกวางไว้ในกล่องพลาสติกที่ครอบคลุมที่มีรูเล็ก ๆ และเก็บไว้ที่ 25 ± 1 องศาเซลเซียสและความชื้นสัมพัทธ์ 85-90% เส้นผ่าศูนย์กลางของรอยโรคที่เกิดจาก C. gloeosporioides ในผลไม้มะม่วงที่ถูกบันทึกไว้ที่ 4 และ 6 วันหลังจากการฉีดวัคซีนการรักษาแต่ละคนมีสามซ้ำกับ 15 ผลไม้ต่อซ้ำ ผลไม้ที่มีการฉีดวัคซีนที่เหลือถูกนำมาใช้สำหรับการกำหนดค่าพารามิเตอร์ออกกำลัง-ชีวเคมีตามที่อธิบายไว้ด้านล่าง. 2.5 การเก็บรวบรวมตัวอย่างเนื้อเยื่อเนื้อผลไม้ที่ 3-10 มมใต้ผิวหนังและ 5-15 มิลลิเมตรจากขอบของแผลเชื้อถูกนำตัวในชีวิตประจำวันที่มีหนอนเจาะสแตนเลสเหล็กไม้ก๊อกระหว่างการเก็บรักษา กลุ่มตัวอย่างเนื้อเยื่อถูกแช่แข็งในไนโตรเจนเหลวและเก็บไว้ที่ -80 องศาเซลเซียสจนวิเคราะห์. 2.6 การตรวจเอนไซม์ผลไม้ที่รับการรักษาด้วย BABA ที่ความเข้มข้นที่เหมาะสมของ 100 มิลลิบนพื้นฐานของผลของกิจกรรมต้านเชื้อราในร่างกายที่ถูกใช้ในการวิเคราะห์ของเอนไซม์และสาร ตัวอย่างห้ากรัมมะม่วงแช่แข็งที่ได้มาจากสามผลไม้ที่มี 3 ซ้ำสำหรับการรักษาในแต่ละครั้งมาบดด้วยครกและสากบนน้ำแข็งและปั่นที่มีการสกัดก่อนระบายความร้อนต่างๆบัฟเฟอร์ดังต่อไปนี้: 5 มิลลิลิตร 100 มิลลิบัฟเฟอร์กรดบอริก ( ค่า pH 8.8) ที่มี 4% (w / v) polyvinylpyrrolidone 1 มิลลิ diamine เอทิลีนกรด tetraacetic (EDTA) และ 50 มิลลิβ-mercaptoethanol แอมโมเนีย phenylalanine ไอเลส (PAL); 5 มิลลิลิตร 50 มิลลิโซเดียมอะซิเตตบัฟเฟอร์ (pH 5.2) ที่มี 1 มิลลิ EDTA 5 มิลลิβ-mercaptoethanol และ 5 มิลลิวิตามินซีสำหรับβ-1,3-glucanase (GLU) และไคติเนส (CHT); 5 มิลลิลิตร 100 โซเดียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์มิลลิ (pH 7.5) ที่มี 5% (w / v) polyvinylpyrrolidone และ 5 มิลลิ dithiothreitol สำหรับ dismutase superoxide (SOD) และ catalase (กสท.) และ 5 มิลลิลิตร 100 มิลลิโพแทสเซียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (pH 7.5) มี polyvinylpyrrolidone 2%, วิตามินซี 1 มิลลิ 1 มิลลิ EDTA สำหรับ ascorbate peroxidase (APX) สารสกัดถูกแล้วหมุนเหวี่ยงที่ 15,000 ×กรัมเป็นเวลา 20 นาทีที่ 4 ° C supernatants ถูกนำมาใช้สำหรับการตรวจเอนไซม์. กิจกรรม PAL ได้รับการวิเคราะห์ตามที่อธิบายวิธีการ Assis et al, (2001) ด้วยการปรับเปลี่ยนบางอย่าง สารสกัดจากเอนไซม์ (0.5 มิลลิลิตร) ถูกบ่ม 0.5 มิลลิลิตร 20 มิลลิ l-phenylalanine 2 มิลลิลิตรและ 50 มิลลิบัฟเฟอร์ borate (pH 8.8) ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 ชั่วโมง ปฏิกิริยาถูกหยุดอยู่กับที่ 0.1 มิลลิลิตร HCl (6 M) การเพิ่มขึ้นของการดูดกลืนแสงที่ 290 นาโนเมตรเกิดจากการก่อตัวของทรานส์ cinnamate ถูกวัด spectrophotometrically กิจกรรม PAL ถูกแสดงเป็น U290, U290 ที่ = 0.01 ΔA290มิลลิกรัมโปรตีน-1 H-1. กิจกรรม GLU ได้รับการวิเคราะห์โดยการวัดปริมาณน้ำตาลรีดิวซ์ปล่อยออกมาจากพื้นผิวตามวิธีการของ Ippolito et al, (2000) ด้วยการปรับเปลี่ยนบางอย่าง สารสกัดจากเอนไซม์ถูก dialyzed ที่ 4 ° C เป็นเวลา 12 ชั่วโมงและจากนั้นหมุนเหวี่ยงที่ 12,000 ×กรัมเป็นเวลา 20 นาทีที่ 4 ° C สารละลาย (2 มิลลิลิตร) ถูกบ่มกับ 0.2 มิลลิลิตร laminarin (0.5% w / v) เป็นเวลา 60 นาทีที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส หลังจากนั้น 1 มิลลิลิตรผสมจะถูกลบออกและเจือจาง 1: 1 ด้วยน้ำกลั่นผ่านการฆ่าเชื้อ ปฏิกิริยาสีถูกยกเลิกโดยการเพิ่ม 1.5 มิลลิลิตร 3,5-dinitrosalicylate และเดือด 5 นาทีในอ่างน้ำ วิธีการแก้ปัญหาที่ได้รับการปรับลดถึง 25 มลด้วยน้ำกลั่นและปริมาณของการลดน้ำตาลวัด spectrophotometrically ที่ 540 นาโนเมตร ค่ากิจกรรมถูกแสดงเป็น U-1 ไมโครกรัมโปรตีน หนึ่งหน่วย (U) ถูกกำหนดเป็นเอนไซม์เร่งการก่อตัวของ 1 nmol s-1 เทียบเท่ากลูโคส. กิจกรรม CHT ได้รับการวิเคราะห์โดยใช้วิธีการของเวิร์ ธ และหมาป่า (1990) ที่มีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย กิจกรรม CHT วัดโดยการผสม 1.5 ml ของเอนไซม์ dialytic แก้ปัญหาตามที่อธิบายไว้สำหรับ GLU มี 2 มิลลิลิตร 2% carboxymethylchitin สีย้อมที่มีข้อความใน 50 มิลลิโซเดียมอะซิเตตบัฟเฟอร์ (pH 5.0) หลังจากการบ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 ชั่วโมงปฏิกิริยาก็หยุดโดยการเพิ่ม 0.1 มิลลิลิตร 1.0 M HCl ส่วนผสมที่ถูกระบายความร้อนบนน้ำแข็งและหมุนเหวี่ยงที่ 15,000 ×กรัมเป็นเวลา 5 นาที การดูดกลืนแสงของสารละลายที่ถูกวัดที่ 550 นาโนเมตร กิจกรรม CHT ที่คำนวณและแสดงใน U-1 ไมโครกรัมโปรตีน หนึ่งหน่วย (U) ถูกกำหนดเป็นปริมาณของเอนไซม์ที่จำเป็นในการกระตุ้นการก่อตัวของ nmol 1 นาที 1 ของผลิตภัณฑ์ (N-acetyl-D-glucosamine) ได้. กิจกรรม SOD ถูกกำหนด photochemically ที่อธิบายไว้ใน Toivonen และสวีนีย์ (1998) วิธีการแก้ปัญหาที่มีปฏิกิริยาโซเดียมฟอสเฟต 50 มิลลิ (pH 7.8) 13 มิลลิ methionine 100 ไมครอน EDTA และ 75 ไมครอนไนโตรสีฟ้า tetrazolium (NBT) 2.7 มิลลิลิตรของการแก้ปัญหานี้ถูกเพิ่ม 0.1 มิลลิลิตรของสารสกัดจากเอนไซม์และ 0.2 มิลลิลิตร riboflavin 200 ไมครอน หลอดถูกวางไว้แล้วในศูนย์บ่มเพาะ 40 W-เรืองแสงเป็นเวลา 15 นาที ก่อบลู formazan คือการตรวจสอบแล้วโดยการบันทึกการดูดกลืนแสงที่ 560 นาโนเมตร หนึ่งหน่วย (U) ของกิจกรรม SOD ถูกกำหนดให้เป็นปริมาณของเอนไซม์ที่ทำให้เกิดการยับยั้ง 50% ของการลด NBT ภายใต้เงื่อนไขการทดสอบ ผลที่จะได้รับรายงานว่า U-1 มิลลิกรัมโปรตีน. กิจกรรมกสทได้รับการวิเคราะห์ตามวิธีการของโอกาสและ Maehly นี้ (1955) ผสมปฏิกิริยาประกอบด้วยโซเดียมฟอสเฟต 50 มิลลิ (pH 7.0) 20 มิลลิ H2O2 และ 100 สารสกัดจากเอนไซม์ไมโครลิตรในปริมาณรวมของ 3 มิลลิลิตร การย่อยสลาย H2O2 โดยวัดจากการลดลงของการดูดกลืนแสงที่ 240 นาโนเมตร กิจกรรมที่กสท. จะแสดงเป็น U240, U240 ที่ = 0.01 ΔA240มิลลิกรัมโปรตีน-1 นาที 1. กิจกรรม APX ได้รับการวิเคราะห์โดยใช้วิธีการของ Nakano และ Asada (1987) ด้วยการปรับเปลี่ยนบางอย่าง ส่วนผสมที่มีอยู่ 50 มิลลิฟอสเฟตโพแทสเซียม (pH 7.0), 0.25 มมวิตามินซี, 0.05 มิลลิ EDTA และสารสกัดจากเอนไซม์ 0.2 มิลลิลิตรในปริมาณ 2.7 มิลลิลิตร หลังจากที่เพิ่ม 0.3 มิลลิลิตร H2O2 ที่จะมีความเข้มข้นสุดท้ายของ 0.2 มิลลิการเปลี่ยนแปลงในการดูดกลืนแสงที่ถูกตรวจสอบที่ 290 นาโนเมตร กิจกรรม APX จะแสดงเป็น U290 ซึ่งใน U290 = 0.01ΔA290มิลลิกรัมโปรตีน-1 นาที 1. ปริมาณโปรตีนในสารสกัดจากเอนไซม์ที่ถูกกำหนดโดยใช้แบรดฟอ (1976) วิธีการที่มีโปรตีนชนิดหนึ่งในซีรั่มวัวเป็นมาตรฐาน. 2.7 การตรวจวัดปริมาณออกซิเจนของปฏิกิริยาThe radical superoxide (O2radical dot-) อัตราการผลิตที่ถูกกำหนดโดยใช้วิธีการของ Elstner และ Heupel (1976) ด้วยการปรับเปลี่ยนบางอย่าง ห้าตัวอย่างกรัมมะม่วงแช่แข็งที่ได้มาจากสามผลไม้ที่มี 3 ซ้ำสำหรับการรักษาในแต่ละครั้งมาบดด้วยครกและสากบนน้ำแข็งและปั่น 5 มิลลิลิตร 50 มิลลิโซเดียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (pH 7.8) ที่มี 1 มิลลิ EDTA, 1 polyvinylpyrrolidone% (PVP, w / v) และ 0.3% Triton X-100 homogenate ถูกหมุนเหวี่ยงที่ 5000 ×กรัมเป็นเวลา 15 นาทีที่ 4 ° C aliquot 0.5 มิลลิลิตรใสผสมกับ 1.0 มิลลิลิตร 100 โซเดียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์มิลลิ (pH 7.8) และ 0.5 มิลลิลิตร 10 มิลลิไฮโดรคลอไรไฮดรอกซิ หลังจากการบ่มเป็นเวลา 20 นาทีที่ 25 ° C, 1 มิลลิลิตรผสมปฏิกิริยาดังกล่าวข้างต้นถูกบันทึกอยู่ใน 1 มิลลิลิตร 17 มิลลิกรด 4 aminobenzene sulfonic และ 1 มิลลิลิตร 7 มิลลิα-naphthylamine ถูกบันทึกอยู่ในส่วนผสมอีก 20 นาที ที่ 25 ° C จากนั้น 4 มิลลิลิตร n-butanol ถูกบันทึกลงในส่วนผสมปฏิกิริยา การดูดกลืนแสงของเฟส n-butanol ที่ได้รับการวัดที่ 530 นาโนเมตรใช้สำหรับการวัด O2radical dot- อัตราการผลิต O2radical dot- ถูกแสดงเป็นไมโครโมลนาที 1 กรัม-1 FW. ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ (H2O2) เนื้อหาถูกกำหนดตาม วิธีการอธิบายโดย Prochazkova et al, (2001) ตัวอย่างห้ากรัมฉ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2 . วัสดุและวิธีการ
2.1 .

เป็นวัสดุปลูกมะม่วง ( M . Indica L . cv . guifei ) ผลไม้ที่ 126.3 ± 5.6 N ความแน่วแน่และ 8.5 ± 0.2 องศาบริกซ์ของของแข็งที่ละลายได้ทั้งหมด ( N = 10 ) พบจากการเก็บเกี่ยวในเชิงพาณิชย์สวนที่ตั้งอยู่ในในเมือง , จังหวัดไหหนานของจีน ผลไม้ที่ถูกส่งไปยังห้องปฏิบัติการภายใน 6 ชั่วโมงหลังการเก็บเกี่ยวผลไม้ขนาดสม่ำเสมอและลักษณะที่ปรากฏและที่เป็นอิสระของอาการที่มองเห็นของโรคใด ๆถูกเลือกสำหรับการทดลอง .

. . เชื้อ C . gloeosporioides

ถูกแยกจากผลมะม่วงที่ติดเชื้อและเก็บไว้บนอาหาร Potato Dextrose Agar ( PDA ) ที่อุณหภูมิ 4 องศา เชื้อนี้เป็นเชื้อที่แยกได้ในผลมะม่วง บาดแผลและ potato dextrose broth ( PDB ) สำหรับการใช้งานต่อไปสปอร์ของเชื้อนี้ถูกถอดออกจาก 2-week-old PDB วัฒนธรรมที่อุณหภูมิ 25 °องศาเซลเซียสและแขวนลอยใน 10 ml เป็นหมันของน้ำกลั่นที่มี 0.05 % ( v / v ) Tween 80 ระงับถูกกรองผ่านผ้า 4 ชั้นชีสเป็นหมันเพื่อเอาเส้นใย . จํานวนนับ hemacytometer สปอร์ถูกด้วย ,และมีค่าปรับ 1 × 106 สปอร์มิลลิลิตร− 1 กับหมันน้ำ

2.3 ในหลอดทดลองในกิจกรรม

ผลของบาบา ( จีน yuanye Co . , Ltd . Shanghai ) ในการเจริญของ C . gloeosporioides ได้ถูกทดสอบ บาบา สารละลายผสมกับหล่อ PDA เพื่อให้ปริมาณ 20 มล. ต่อจาน Petri ( เส้นผ่าศูนย์กลาง 120 มม. ) บาบา ใน PDA ความเข้มข้นคือ 0 , 25 , 50 , 100 ,200 และ 400 มม. หลังจาก PDA มีก้อน มี 8-mm ดิสก์เส้นผ่านศูนย์กลางของเส้นใยพรมจาก 1-week-old วัฒนธรรมอยู่ในศูนย์กลางของแต่ละจาน Petri ประกอบด้วย PDA และ บาบา การเจริญเติบโตที่แสดงออกโดยเส้นผ่านศูนย์กลาง ( มม. ) ถูกบันทึกหลังจาก 1 , 3 , 5 และ 7 วัน ตามลำดับ ที่ 25 ± 1 องศา ความเข้มข้นของการรักษาแต่ละจำนวน 3 ครั้ง และทำการทดลองซ้ำ 2 ครั้ง

ผลของการงอกของ C . gloeosporioides บาบาที่สปอร์มีปริมาณเส้นใยโดยใช้วิธี และ เถียนเหยา ( 2005 ) เฉยๆของ 100 μลิตรช่วงล่างสปอร์ 1 × 106 เป็นแบบโอนไปยังหลอดแก้วซึ่งบรรจุด้วยเส้นใยบาบาที่ความเข้มข้นต่างๆ ( 0 , 25 , 50 , 100 , 200 และ 400 มม. )