The value of the turnover number (k

The value of the turnover number (kcat) was calculated using thefollowing equation:
kcat =
Vmax
[E]
where [E] refers to the active enzyme concentration and Vmaxtomaximal velocity.2.13. Determination of hydrolysis degree of STAP, SG-XIV, andKERAB proteasesCasein hydrolysis was carried out at 60◦C and pH 10. The pHwas kept constant throughout hydrolysis by adding NaOH 4N. Anamount of 3 g of casein was dissolved in 100 ml of 50 mM glycine-NaOH buffer containing 3 mM CaCl2at pH 10 and then treated with1000 U of the purified enzymes, namely STAP, SG-XIV, and KERAB.The degree of hydrolysis (DH) was calculated for each case fromthe amount of base (NaOH) added to keep the pH constant duringhydrolysis [24] as previously described by Zaraî Jaouadi et al. [23].2.14. Stability and compatibility of STAP, SG-XIV, and KERAB withlaundry detergentsThe stability and compatibility of the purified STAP, SG-XIV, andKERAB proteases with some currently commercialized liquid andsolid detergents were investigated. The list of liquid detergentsincluded Dixan and Nadhif (Henkel, Tunisia) and Ariel (Procter &Gamble, Switzerland). The solid detergents used were Tide (Procter& Gamble, Switzerland), Le CHAT and OMO (Unilever, France).In order to investigate their stability and compatibility, the men-tioned commercial detergents were diluted in tap water to obtaina final concentration of 7 mg/ml (to simulate washing conditions)[25]. The endogenous proteases present in these laundry deter-gents were inactivated by heating the diluted detergents for 1 h at65◦C, prior to the addition of the purified enzymes (STAP, SG-XIV,and KERAB). A 1000 U/ml of each purified protease was shake-incubated with each laundry detergent for 1 h at 40◦C, and residualactivity was determined at pH 10 and 60◦C using DMC as a sub-strate. The enzyme activity of a control (without any detergent),incubated under similar conditions, was taken as 100%.2.15. Effects of organic-solvents on protease activity and stabilityof STAP, SG-XIV, and KERAB proteasesVarious organic solvents, with different Log P values (50%, v/v),were tested with shaking at 150 strokes per min and 30◦C for 1 and180 d to evaluate their effects on protease activity and stability,respectively. The proteases used were STAP, SG-XIV, and KERAB.The relative and residual caseinolytic activities were assayed underthe same conditions at 60◦C and pH 10. The activity of the enzymewithout any organic solvent was taken as 100%.2.16. Gene cloning of the proteaseDNA manipulation was carried out using the methods describedby Sambrook et al. [19]. Two oligonucleotides were synthesizedbased on the high degree of sequence homology published for theprotease ssp gene from S. lividans strain 66 [26] and used for the iso-lation and determination of the stap encoding gene sequence. Thecomplete stap gene and its flanking regions were amplified usingthe upstream primer F-BM3 (5-GACACGGCGCCCCGCGGGGCC-3)and downstream primer R-BM4 (5-CCGTCCGGTCCGCCGCCCCCG-3) to generate an approximately 1.9 kb PCR fragment usinggenomic DNA from S. koyangensis strain TN650 as a template andDNA polymerase (Pyrococcus furiosus from Biotools, Madrid, Spain).DNA amplification was performed with the Techne-Prime G Gradi-ent Thermal Cycler, 96 × 0.2 ml (Cole-Parmer International, VernonHills, IL, USA). The amplification reaction mixtures (50 l) con-tained 20 pg of each primer, 200 ng of DNA template, amplificationbuffer, and 2 U of DNA polymerase. The cycling parameters usedwere 94◦C for 5 min, followed by 35 cycles of denaturation at 94◦Cfor 30 s, primer annealing at 56.1◦C for 45 s, and extension at 72◦Cfor 60 s. The PCR products were then purified using an agarosegel extraction kit (Jena Bioscience, GmbH, Germany). The purified1.9 kb PCR fragment was cloned in pCR-Blunt cloning vector intoan E. coli HB101 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) host strain. Therecombinant clones of E. coli were grown in LB broth media withthe addition of ampicillin (100 g/ml), IPTG (160 g/ml), and X-gal(360 g/ml). A clone was noted to harbor a plasmid called pMB2and was, therefore, retained for further study.2.17. DNA sequencing and bioinformatics analysisThe nucleotide sequences of the cloned 16S rRNA and stap geneswere determined on both strands using BigDye Terminator CycleSequencing Ready Reaction kits and the automated DNA sequencerABI PRISM®3100-Avant Genetic Analyser (Applied Biosystems,Foster City, CA, USA). Internal primers were used to completethe sequence of the two genes. Phylogenetic and molecular evo-lutionary genetic analyses were performed using the molecularevolutionary genetics analysis software v. 4.1. Distances and clus-tering were calculated using the neighbor-joining method. The treetopology of the neighbor-joining data was evaluated by Bootstrapanalysis with 100 re-samplings.Multiple nucleotide sequence alignment was performed usingthe BioEdit version 7.0.2 software program. The promoter waspredicted by Neural Network Promoter Prediction

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ค่าของหมายเลขหมุนเวียน (kcat) ถูกคำนวณโดยใช้สมการต่อไปนี้:kcat =Vmax[E]ที่ [E] หมายถึงความเข้มข้นของเอนไซม์ที่ใช้งานอยู่และ Vmaxtomaximal velocity.2.13 กำหนดสาขาย่อยของ STAP จำนวน XIV, andKERAB proteasesCasein สลายถูกดำเนินการที่ 60◦C และค่า pH 10 PHwas การเก็บคงที่ตลอดการสลาย โดยการเพิ่ม NaOH 4N Anamount 3 กรัมของเคซีนละลายใน 100 มิลลิลิตรของบัฟเฟอร์ glycine NaOH 50 มม.ที่ประกอบด้วยค่า pH 3 มม. CaCl2at 10 และถือ with1000 U ของเอนไซม์บริสุทธิ์ คือ STAP จำนวน XIV และ KERAB ระดับย่อย (DH) ถูกคำนวณสำหรับแต่ละกรณีจากจำนวนฐาน (NaOH) เพิ่มเพื่อให้การวัดค่า pH คง duringhydrolysis [24] ก่อนหน้านี้ อธิบายไว้โดย Zaraî Jaouadi et al. [23] .2.14 เสถียรภาพและความเข้ากันได้ของเสถียรภาพ detergentsThe withlaundry STAP จำนวน XIV และ KERAB และเข้ากันได้ของ STAP บริสุทธิ์ จำนวน XIV, andKERAB proteases บางกำลังถูกสอบสวนกรร andsolid เหลวผงซักฟอก รายการของของเหลว detergentsincluded Dixan และ Nadhif (เฮงเค็ล ตูนิเซีย) และแอเรียล (Procter & เสี่ยงโชค สวิตเซอร์แลนด์) ใช้ผงซักฟอกไม้มีไทด์ (Procter & เสี่ยงโชค สวิตเซอร์แลนด์), เลอสนทนา และโอโม (ยูนิลีเวอร์ ฝรั่งเศส) เพื่อตรวจสอบความเสถียรและความเข้ากันได้ของพวกเขา ผงซักฟอกพาณิชย์ tioned ผู้ชายถูกเจือจางในน้ำประปาเพื่อ obtaina ความเข้มข้นสุดท้ายของ 7 mg/ml (เพื่อจำลองสภาพล้าง) [25] Proteases ภายนอกอยู่ในนี้ซักเป็นอุปสรรคทั้งถูกยกโดยผงซักฟอกเจือจางสำหรับ 1 h at65◦C ก่อนการเพิ่มของเอนไซม์บริสุทธิ์ (STAP จำนวน XIV และ KERAB) U/ml 1000 โปรติเอสละบริสุทธิ์เป็นมบ่มเลี้ยงสั่น ด้วยผงซักฟอกแต่ละสำหรับ 1h ที่ 40◦C และ residualactivity กำหนดในค่า pH 10 และ 60◦C ใช้ DMC เป็นย่อย-strate ได้รับการกกเอนไซม์ของตัวควบคุม (ไม่มีผงซักฟอก), ภายใต้เงื่อนไขที่คล้ายกัน ถ่ายเป็น 100% .2.15 ผลของสารละลายอินทรีย์รติเอสกิจกรรมและ stabilityof STAP จำนวน XIV และ KERAB proteasesVarious อินทรีย์ ค่า P บันทึกที่แตกต่างกัน (50%, v/v), ที่ทดสอบกับสั่นที่ 150 จังหวะต่อนาทีและ 30◦C สำหรับ d 1 and180 การประเมินผลกิจกรรมรติเอสและเสถียรภาพ ตามลำดับ Proteases ใช้ STAP จำนวน XIV และ KERAB ได้ กิจกรรมสัมพันธ์ และส่วนที่เหลือ caseinolytic ได้ underthe assayed เหมือนสภาพที่ 60◦C และค่า pH 10 กิจกรรมของ enzymewithout การถ่ายตัวทำละลายอินทรีย์ใด ๆ 100% .2.16 ยีนของจัดการ proteaseDNA ดำเนินการโดยใช้วิธี describedby Sambrook et al. [19] Oligonucleotides สอง synthesizedbased ในระดับสูงของ homology ลำดับที่เผยแพร่สำหรับยีน ssp theprotease จากสายพันธุ์ S. lividans 66 [26] และใช้ iso เครื่องดูดและเรื่อง stap เข้ารหัสยีนลำดับ Thecomplete stap ยีนและภูมิภาคของ flanking ถูกค้นเพิ่มรองพื้นต้นน้ำ F-BM3 (5 - GACACGGCGCCCCGCGGGGCC-3) และรองพื้นปลาย R-BM4 (5 - CCGTCCGGTCCGCCGCCCCCG-3) การสร้างมีประมาณ 1.9 กิโล PCR ส่วน usinggenomic ดีเอ็นเอจาก S. koyangensis สายพันธุ์ TN650 เป็นแม่ andDNA พอลิเมอเรส (Pyrococcus furiosus จาก Biotools มาดริด สเปน) ดำเนินการขยายดีเอ็นเอกับที่นายก Techne G Gradi เอนท์ร้อน Cycler, 96 × 0.2 ml (นานาโคล Parmer, VernonHills, IL สหรัฐอเมริกา) ส่วนผสมปฏิกิริยาขยาย (50 ลิตร) 20 คอน tained pg ของรองพื้นแต่ละ 200 ฉบับ ของดีเอ็นเอต้นแบบ amplificationbuffer, U ของดีเอ็นเอพอลิเมอเรส 94◦C usedwere พารามิเตอร์ขี่จักรยาน 5 นาที ตาม ด้วยรอบ 35 ของ denaturation ที่ 94◦Cfor s รองพื้นหลอมที่ 56.1◦C สำหรับ 45 s และมีนามสกุลที่ 72◦Cfor 30 60 s ผลิตภัณฑ์ PCR ได้แล้วบริสุทธิ์โดยใช้ชุดการดูด agarosegel (Jena วิทยาศาสตร์ชีวภาพ GmbH เยอรมนี) ส่วนการ PCR kb purified1.9 ถูกโคลนในบลันท์ pCR โคลนเวกเตอร์ intoan HB101 ไล (Invitrogen คาร์ลบาด CA, USA) จัดสายพันธุ์ Therecombinant โคลนของ E. coli ที่ปลูกใน LB ซุปสื่อกับการเพิ่มของแอมพิซิลลิน (100 g/ml), IPTG (160 กรัม/มิลลิลิตร), และ X-gal(360 g/ml) โคลนถูกบันทึกไว้ไปยังท่าเรือที่ plasmid ที่เรียกว่า pMB2and ดังนั้น มีการเก็บไว้สำหรับ study.2.17 เพิ่มเติม ดีเอ็นเอลำดับและ bioinformatics analysisThe นิวคลีโอไทด์ลำดับของโคลน 16S rRNA และ stap geneswere กำหนดบนเส้นทั้งสองโดยใช้ BigDye ท้าย CycleSequencing ปฏิกิริยาพร้อมชุดและ sequencerABI ดีเอ็นเออัตโนมัติ PRISM® 3100-เปรี้ยววิเคราะห์ทางพันธุกรรม (ใช้ศาสตร์เชิงชีวภาพ เมืองฟอสเตอร์ CA สหรัฐอเมริกา) ไพรเมอร์ภายในเป็น completethe ลำดับของยีนที่สอง วิเคราะห์ทางพันธุกรรมระดับโมเลกุล และ phylogenetic evo lutionary ดำเนินการโดยใช้ซอฟต์แวร์การวิเคราะห์พันธุศาสตร์ molecularevolutionary v. 4.1 ระยะทางและ clus tering ถูกคำนวณโดยใช้วิธีเข้าร่วมบ้าน Treetopology ข้อมูลเพื่อนบ้านเข้าร่วมประกอบ ด้วย Bootstrapanalysis กับ 100 เรื่อง-samplings จัดลำดับของนิวคลีโอไทด์หลายถูกค้นดำเนิน BioEdit รุ่นส่งสัญญาณ 7.0.2 ซอฟต์แวร์โปรแกรม Waspredicted โปรโมเตอร์ โดยคาดเดาโปรโมเตอร์เครือข่ายประสาท

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ค่าของตัวเลขผลประกอบการ (kcat) ที่ได้รับการคำนวณโดยใช้สมการ thefollowing:
kcat =
Vmax
[E]
ที่ [E] หมายถึงความเข้มข้นของเอนไซม์ที่ใช้งานและ Vmaxtomaximal velocity.2.13 ความมุ่งมั่นของการศึกษาระดับปริญญาจองจำของขั้นตอนที่, SG-สี่ andKERAB proteasesCasein ย่อยสลายได้ดำเนินการที่60◦Cและค่า pH 10. pHwas เก็บไว้คงที่ตลอดการย่อยสลายโดยการเพิ่ม NaOH 4N Anamount 3 กรัมของเคซีนถูกละลายใน 100 มล. 50 มิลลิบัฟเฟอร์ glycine-NaOH มี 3 mm CaCl2at พีเอช 10 และรับการรักษา with1000 U ของเอนไซม์บริสุทธิ์คือขั้นตอนที่, SG-XIV และปริญญา KERAB.The ของการย่อยสลายแล้ว (DH ) ที่คำนวณได้สำหรับแต่ละกรณี fromthe ปริมาณของฐาน (NaOH) เพิ่มเพื่อให้ค่า pH duringhydrolysis คง [24] ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้โดยZaraî Jaouadi et al, [23] .2.14 ความเสถียรและความเข้ากันได้ของขั้นตอนที่, SG-XIV และ KERAB withlaundry เสถียรภาพ detergentsThe และเข้ากันได้ของขั้นตอนที่บริสุทธิ์ SG-สี่ andKERAB โปรตีเอสที่มีบางส่วนในเชิงพาณิชย์ในปัจจุบันผงซักฟอก andsolid ของเหลวถูกตรวจสอบ รายการของของเหลว detergentsincluded Dixan และ Nadhif (เฮงเค็ลตูนิเซีย) และเอเรียล (Procter & Gamble, วิตเซอร์แลนด์) ผงซักฟอกที่เป็นของแข็งที่ใช้ ได้แก่ ไทด์ (Procter & Gamble, วิตเซอร์แลนด์), Le Chat และโอโม (ยูนิลีเวอร์, ฝรั่งเศส) ในการสั่งซื้อเพื่อตรวจสอบความมีเสถียรภาพและความเข้ากันได้ของพวกเขา, ชายติดตั้งอยู่ผงซักฟอกเชิงพาณิชย์ถูกเจือจางในน้ำประปาให้กับ obtaina เข้มข้นสุดท้าย 7 มิลลิกรัม / ml (เพื่อจำลองสภาพการซักผ้า) [25] โปรตีเอสในปัจจุบันภายนอกเหล่านี้เป็นอุปสรรคซักรีด-เจนท์ถูกยกเลิกด้วยความร้อนผงซักฟอกปรับลดเป็นเวลา 1 ชั่วโมงat65◦Cก่อนที่จะมีการเพิ่มของเอนไซม์บริสุทธิ์ (ขั้นตอนที่, SG-XIV และ KERAB) 1000 U / ml ของแต่ละน้ำย่อยบริสุทธิ์ถูกสั่นบ่มกับแต่ละน้ำยาซักผ้าเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่40◦Cและ residualactivity ถูกกำหนดที่พีเอช 10 และ60◦Cใช้ DMC เป็นย่อย strate เอนไซม์ของการควบคุม (ไม่มีผงซักฟอกใด ๆ ) บ่มภายใต้เงื่อนไขที่คล้ายกันถูกนำมาเป็น 100% .2.15 ผลของตัวทำละลายอินทรีย์กับกิจกรรมโปรติเอสและขั้นตอนที่ stabilityof, SG-XIV และ KERAB proteasesVarious ตัวทำละลายอินทรีย์ที่แตกต่างกันกับค่า log P (50% v / v) ถูกทดสอบด้วยการเขย่าที่ 150 จังหวะต่อนาทีและ30◦Cสำหรับ 1 and180 D ในการประเมินผลกระทบต่อกิจกรรมโปรติเอสและความมั่นคงตามลำดับ โปรตีเอสที่ใช้เป็นขั้นตอนที่, SG-XIV และ KERAB.The กิจกรรม caseinolytic ญาติและที่เหลือถูก assayed สังกัดเงื่อนไขเดียวกันที่60◦Cและค่า pH 10. กิจกรรมของ enzymewithout ใดทำละลายอินทรีย์ถูกนำมาเป็น 100% บริษัท เดอะ .2.16 โคลนยีนของการจัดการ proteaseDNA ได้ดำเนินการโดยใช้วิธีการ describedby Sambrook et al, [19] สอง oligonucleotides ถูก synthesizedbased ในระดับสูงของลำดับที่คล้ายคลึงกันตีพิมพ์ theprotease ยีนเอสเอสเอสจาก lividans สายพันธุ์ 66 [26] และใช้สำหรับ ISO-lation และความมุ่งมั่นของขั้นตอนที่เข้ารหัสลำดับยีน ทำให้เสร็จสมบูรณ์ขั้นตอนที่ยีนและภูมิภาคขนาบข้างของมันถูกขยาย usingthe ไพรเมอร์ต้นน้ำ F-BM3 (5? -GACACGGCGCCCCGCGGGGCC-3?) และไพรเมอร์ปลายน้ำ R-BM4 (5? -CCGTCCGGTCCGCCGCCCCCG-3?) ในการสร้างดีเอ็นเอ usinggenomic ประมาณ 1.9 KB PCR ชิ้นส่วนจาก เอส koyangensis ความเครียด TN650 เป็นแม่แบบ andDNA โพลิเมอร์ (Pyrococcus furiosus จาก Biotools, มาดริด, สเปน) .DNA ขยายได้ดำเนินการด้วยความร้อน Cycler Techne นายกรัฐมนตรี G-Gradi Ent 96 × 0.2 มล. (โคล Parmer นานาชาติ VernonHills, IL , สหรัฐอเมริกา). ผสมขยายปฏิกิริยา (50 ลิตร) Con-tained 20 PG ของแต่ละไพรเมอร์ 200 NG ของแม่แบบดีเอ็นเอ amplificationbuffer และ 2 U ของดีเอ็นเอโพลิเมอร์ พารามิเตอร์การขี่จักรยาน usedwere 94◦Cเป็นเวลา 5 นาทีตามด้วย 35 รอบของการสูญเสียสภาพธรรมชาติที่94◦Cfor 30 S, หลอมไพรเมอร์ที่56.1◦C 45 S, และการขยายที่72◦Cfor 60 s ผลิตภัณฑ์ PCR บริสุทธิ์แล้วใช้ชุดสกัด agarosegel (เจชีววิทยาศาสตร์ GmbH ประเทศเยอรมนี) purified1.9 KB PCR ชิ้นส่วนเป็นโคลนใน PCR-Blunt โคลนเวกเตอร์ intoan E. coli HB101 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) สายพันธุ์โฮสต์ โคลน Therecombinant ของเชื้อ E. coli ปลูกในสื่อน้ำซุป LB withthe นอกเหนือจาก ampicillin (100 g / ml) IPTG (160 g / ml) และ X-แกลลอน (360? g / ml) โคลนก็ตั้งข้อสังเกตไปยังท่าเรือที่เรียกว่าพลาสมิด pMB2and ถูกจึงเก็บไว้ study.2.17 เพิ่มเติม ลำดับดีเอ็นเอและชีวสารสนเทศ analysisThe ลำดับเบสของโคลน rRNA 16S และขั้นตอนที่กำหนดบน geneswere เส้นทั้งสองใช้ BigDye Terminator CycleSequencing พร้อมชุดปฏิกิริยาและอัตโนมัติดีเอ็นเอ sequencerABI PRISM®3100-Avant พันธุกรรม Analyser (Applied Biosystems, ฟอสเตอร์ซิตี, แคลิฟอร์เนีย, สหรัฐอเมริกา) ไพรเมอร์ภายในถูกนำมาใช้เพื่อ completethe ลำดับของยีนทั้งสอง วิวัฒนาการและโมเลกุล EVO-lutionary วิเคราะห์ลักษณะทางพันธุกรรมที่ถูกดำเนินการโดยใช้พันธุศาสตร์ molecularevolutionary ซอฟต์แวร์การวิเคราะห์ v. 4.1 ระยะทางและ clus-tering ถูกคำนวณโดยใช้วิธีเพื่อนบ้านเข้าร่วม treetopology ข้อมูลเพื่อนบ้านเข้าได้รับการประเมินโดย Bootstrapanalysis ด้วย 100 อีกครั้ง samplings.Multiple ลำดับการจัดเรียงเบื่อหน่ายได้ดำเนินการรุ่น BioEdit usingthe โปรแกรมซอฟแวร์ 7.0.2 โปรโมเตอร์ waspredicted โดยโครงข่ายประสาทเทียมโปรโมเตอร์ทำนาย

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ค่าของจํานวนเวียน ( kcat ) คำนวณได้โดยใช้สมการต่อไปนี้ :kcat =วีแม็กซ์[ E ]ที่ไหน [ E ] หมายถึง การใช้ความเข้มข้นของเอนไซม์ และ vmaxtomaximal velocity.2.13 . การกำหนดระดับของขั้นตอนการย่อย sg-xiv andkerab การย่อย , , proteasescasein ได้ดําเนินการ 60 ◦พีเอช 10 การ phwas คงที่ตลอดระยะเวลาโดยการเพิ่ม NaOH 5 . anamount 3 G ของเคซีน ละลายได้ใน 100 มิลลิลิตร ประกอบด้วย 50 มม. ใช้บัฟเฟอร์ที่มีพีเอช 10 และ cacl2at 3 มิลลิเมตร ถือว่า with1000 U ของเอนไซม์บริสุทธิ์ คือ ขั้นตอน sg-xiv , และ kerab ระดับการย่อยสลาย ( DH ) คำนวณได้ในแต่ละกรณี จากปริมาณของเบส ( NaOH ) เพิ่มให้ pH คงที่ duringhydrolysis [ 24 ] ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้า โดยซาร่าî jaouadi et al . [ 23 ] . 2.14 . ความมั่นคงและความเข้ากันได้ของขั้นตอน sg-xiv , และ kerab withlaundry detergentsthe ความมั่นคงและความเข้ากันได้ของบริสุทธิ์ขั้นตอน sg-xiv ทาง , , andkerab กับบางปัจจุบันระบบ andsolid ผงซักฟอกของเหลวคือ รายชื่อ dixan detergentsincluded ของเหลวและ nadhif ( Henkel , ตูนิเซีย และ แอเรียล ( มิสเตอร์เคนเนดี , สวิตเซอร์แลนด์ ) ของแข็งที่ใช้น้ำ ( มิสเตอร์เคนเนดี , สวิตเซอร์แลนด์ ) , Le Chat และโอ ( Unilever , ฝรั่งเศส ) ในการตรวจสอบของพวกเขามีความมั่นคงและความเข้ากันได้ มนุษย์ tioned ผงซักฟอกพาณิชย์ลดในน้ำประปาเพื่อ obtaina ความเข้มข้นสุดท้าย 7 มก. / มล. ( จำลองล้างเงื่อนไข ) [ 25 ] ส่วนในทางปัจจุบัน เหล่านี้เป็นเครื่องยับยั้ง Gents บริการซักรีด ซึ่งจากผงซักฟอกเจือจาง 1 H at65 ◦ C ก่อนที่จะเพิ่มเอนไซม์บริสุทธิ์ ( ขั้นตอน sg-xiv , และ kerab ) 1000 U / ml ของแต่ละโปรก็เขย่าบริสุทธิ์แยกแต่ละผงซักฟอกเป็นเวลา 1 ชั่วโมง ที่อุณหภูมิ 40 ◦ C และ residualactivity ตั้งใจที่พีเอช 10 และ 60 ◦ C ใช้ DMC เป็นซับสเตรท . กิจกรรม เอนไซม์ควบคุม ( ไม่มีผงซักฟอก ) บ่มภายใต้เงื่อนไขที่คล้ายกัน คือ ถ่ายเป็นร้อย 2.15 . ผลของตัวทำละลายอินทรีย์ที่มีต่อกิจกรรมของเอนไซม์โปรติเอส และใช้ขั้นตอน sg-xiv , และ kerab proteasesvarious ตัวทำละลายอินทรีย์ที่มีค่า log P , ( 50 % v / v ) มาทดสอบกับสั่นที่ 150 ครั้งต่อนาที และ 30 ◦ C 1 and180 D เพื่อประเมินผลกระทบต่อกิจกรรมของเอนไซม์โปรติเอสและเสถียรภาพ ตามลำดับ การใช้ขั้นตอนทาง sg-xiv , และ kerab . ญาติและตกค้างอยู่ตามปริมาณกิจกรรม caseinolytic เงื่อนไขเดิมที่ 60 ◦พีเอช 10 กิจกรรมของ enzymewithout ตัวทำละลายอินทรีย์ใด ๆถูกจับเป็น 100% 2.16 . การโคลนยีนของ proteasedna จัดการโดยใช้วิธีการ describedby sambrook et al . [ 19 ] สองคือ synthesizedbased โอลิโกนิวคลีโอไทด์ในระดับสูงของลำดับซึ่งเผยแพร่ theprotease ตรวจยีนจาก S . lividans สายพันธุ์ 66 [ 26 ] และใช้ ISO lation ของขั้นตอนการเข้ารหัสและการหาลำดับยีน ขั้นตอนของยีนเมื่อ flanking เขตต้นน้ำ f-bm3 ใช้รองพื้นเบสรองพื้น r-bm4 ( 5-gacacggcgccccgcggggcc-3 ) และปลายน้ำ ( 5-ccgtccggtccgccgcccccg-3 ) สร้างประมาณ 1.9 กิโลเบส DNA PCR usinggenomic จาก S . koyangensis เมื่อย tn650 เป็นแม่แบบ anddna Polymerase ( pyrococcus furiosus จาก biotools , มาดริด , สเปน ) เพิ่มจำนวนดีเอ็นเอได้ด้วย techne นายกรัฐมนตรี gradi กรัม ใช้ความร้อนรอบ 96 × 0.2 ml ( โคล พาร์เมอร์ นานาชาติ vernonhills , IL , USA ) โดยการเพิ่มปฏิกิริยาผสม ( 50 ลิตร ) คอน tained 20 pg แต่ละ primer , 200 ng ของแม่แบบ amplificationbuffer ดีเอ็นเอ และ 2 U โดยดีเอ็นเอ พารามิเตอร์จักรยานที่ใช้◦ 94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาที ตามด้วย 3 รอบ ( ที่ 94 ◦ C เป็นเวลา 30 วินาที , รองพื้นอ่อนที่ 56.1 ◦ C 45 , และส่วนขยายที่ 72 ◦ C เป็นเวลา 60 วินาที ที่เพิ่มปริมาณแล้วสามารถใช้กาโร จลการสกัด Kit ( Jena วิทยาศาสตร์ชีวภาพ GmbH , Germany ) การ purified1.9 KB ซึ่งในส่วนนี้ถูกโคลน PCR ทื่อโคลนเวกเตอร์ intoan E . coli hb101 ( Invitrogen Carlsbad , CA , USA ) ซึ่งโฮสต์ therecombinant โคลนของ E . coli มีปลูกในปอนด์กับซุปสื่อนอกจากนี้เมอรีล สตรีป ( 100 g / ml ) , โปรตีน ( 160 กรัม / มิลลิลิตร ) และ x-gal ( 360 กรัม / มิลลิลิตร ) โคลน เป็นข้อสังเกตที่ท่าเรืออยู่ เรียกว่า pmb2and จึงเก็บไว้เพื่อ study.2.17 เพิ่มเติม ดีเอ็นเอและลำดับนิวคลีโอไทด์ของยีนรสน analysisthe ลำดับเบส 16S rRNA และ ขั้นตอน geneswere มุ่งมั่นทั้งเส้นใช้ bigdye Terminator cyclesequencing พร้อมชุดปฏิกิริยาและอัตโนมัติ sequencerabi ปริซึม® 3100 Avant พันธุกรรมดีเอ็นเอวิเคราะห์ ( Applied Biosystems ฟอสเตอร์ ซิตี้ , แคลิฟอร์เนีย , สหรัฐอเมริกา ภายในใช้ไพรเมอร์จำนวนลำดับสองยีน วิวัฒนาการโมเลกุลพันธุกรรมและ Evo lutionary การวิเคราะห์การใช้ molecularevolutionary พันธุศาสตร์การวิเคราะห์ซอฟต์แวร์ V . 4.1 . ระยะทางและคำนวณการใช้ clus tering เพื่อนบ้านร่วมด้วย การ treetopology ของเพื่อนบ้านรวมข้อมูลที่ประเมินโดย bootstrapanalysis 100 re-samplings.multiple ลำดับนิวคลีโอไทด์ตำแหน่งการใช้ bioedit รุ่น 7.0.2 โปรแกรมซอฟต์แวร์ ผู้สนับสนุนการขาย waspredicted โดยโครงข่ายประสาทเทียม