2.5. Gene expression analysis by qR

2.5. Gene expression analysis by qRT-PCR
After identification of the altered seed oil profile in the first
greenhouse experiment, gene expression analyses were performed
on samples grown in the second greenhouse experiment from June
2012 to September 2012. In developing B. napus seeds, significant
accumulation of oil starts at 28 DAP (days after pollination), and
reaches its maximum level at 35 DAP (Fowler and Downey, 1970;
Gurr et al., 1972). Thus, to evaluate the expression levels of transcription
factors participating in oil biosynthesis i.e., BRASSICA
NAPUS LEAFY COTYLEDON1 and 2 (BnLEC1 and 2), ABSCISIC ACIDINSENSITIVE
3 (BnABI3) and WRINKLED1 (BnWRI1), seeds samples
were collected at 14, 21, 28 and 35 DAP. For all other experiments,
seed was collected at 35 DAP unless otherwise stated.
All gene expression analyses were conducted using quantitative
(q) RT-PCR (Elhiti et al., 2010) with existing primer sequences
(Prystenski, 2011; Elhiti et al., 2012) listed in Supplementary
Table 1. These analyses also included genes involved in glycolysis:
FRUSCOSE BISPHOSPHATE ALDOLASE (BnFPA), PHOSPHOGLYCERATE
KINASE (BnPGK), GLYCERALDEHYDE 3-PHOSPHATE DEHYDROGENASE
(BnGDPH), HEXOSE KINASE (BnHXK) and PYROPHOSPHATE-DEPENDENT
PHOSPHOFRUCTOKINASE (BnPPK); sucrose transport and
metabolism: SUCROSE TRANSPORTER 1 and 4 (BnSUT 1 and 4) and 4,
SUCROSE SYNTHASE 1 and 3, (BnSUS1 and 3) and ADP-GLUCOSE
PHOSPHORYLASE (BnAGP); FA biosynthesis: SUBUNIT A of ACETYLCoA
CARBOXYLASE (BnACCA2), u-3 FA DESATURASE (BnFAD3), FA
ELONGATION1 (BnFAE1), and MALONYL-CoA:ACP TRANSACYLASE
(BnMCAT); and five representative Brassica OLEOSIN genes: OLEOSIN
S-1, S-2, S-3, S-4 and S-5. The relative level of gene expression
was estimated with the 2
DDCT method (Livak and Schmittgen,
2001) using UBC21 (EV086936, ubiquitin-conjugating enzyme 21)
as a reference. Analyses were performed in three biological
replicates.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.5 การวิเคราะห์ยีนนิพจน์ โดย qRT PCRหลังจากรหัสของโพรไฟล์น้ำมันเมล็ดเปลี่ยนแปลงในครั้งแรกเรือนกระจกทดลอง ยีนดำเนินวิเคราะห์ในตัวอย่างปลูกในเรือนกระจกทดลองสองเดือนมิถุนายน2012 กันยายน 2555 ในการพัฒนาเมล็ดพันธุ์เกิด napus สำคัญรวบรวมน้ำมันเริ่มต้นที่ 28 หลักสูตร DAP (วันหลัง pollination), และถึงระดับสูงสุดที่ 35 DAP (ฟาวเลอร์และเบิร์ดดาวนีย์ 1970Gurr et al., 1972) ดังนั้น การประเมินระดับนิพจน์ของราชบัณฑิตยสถานปัจจัยที่มีส่วนร่วมในการสังเคราะห์น้ำมันเช่น ผักNAPUS COTYLEDON1 ใบและ 2 (BnLEC1 2), แอบไซซิก ACIDINSENSITIVE3 (BnABI3) และ WRINKLED1 (BnWRI1), เมล็ดพืชตัวอย่างได้รวบรวมไว้ที่ 14, 21, 28 และ 35 DAP สำหรับการทดลองอื่น ๆ ทั้งหมดเมล็ดพันธุ์รวบรวมที่ 35 DAP เว้นแต่ระบุไว้เป็นอย่างอื่นวิเคราะห์นิพจน์ยีนทั้งหมดได้ดำเนินการใช้เชิงปริมาณ(q) RT-PCR (Elhiti et al., 2010) กับลำดับรองพื้นที่มีอยู่(Prystenski, 2011 Elhiti et al., 2012) แสดงใน Supplementaryตารางที่ 1 วิเคราะห์เหล่านี้รวมยีนที่เกี่ยวข้องใน glycolysis:FRUSCOSE BISPHOSPHATE ALDOLASE (BnFPA), PHOSPHOGLYCERATEKINASE (BnPGK), DEHYDROGENASE GLYCERALDEHYDE 3-ฟอสเฟต(BnGDPH), KINASE เฮกโซส (BnHXK) และขึ้นอยู่กับ PYROPHOSPHATEPHOSPHOFRUCTOKINASE (BnPPK); ขนส่งซูโครส และเผาผลาญ: ขนส่งซูโครส 1 และ 4 (BnSUT 1 และ 4) และ 4SYNTHASE ซูโครส 1 และ 3, (BnSUS1 และ 3) และระดับน้ำตาล ใน ADPPHOSPHORYLASE (BnAGP); การสังเคราะห์ FA: A ACETYLCoA ย่อยCARBOXYLASE (BnACCA2), u-3 FA DESATURASE (BnFAD3), FAELONGATION1 (BnFAE1), และ MALONYL-CoA:ACP TRANSACYLASE(BnMCAT); และยีน OLEOSIN ผักพนักงานห้า: OLEOSINS 1, S 2, S 3, S-4 ก S-5 ระดับสัมพัทธ์ของยีนมีประเมิน ด้วยวิธีการ DDCT 2 (Livak และ Schmittgen2001) โดยใช้ UBC21 (EV086936, ubiquitin conjugating เอนไซม์ 21)เป็นการอ้างอิง ได้ดำเนินการวิเคราะห์ทางชีวภาพ 3เหมือนกับการ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.5 การวิเคราะห์การแสดงออกของยีนโดยวิธี PCR ของข้าพเจ้า
หลังจากการเปลี่ยนแปลงน้ำมันเมล็ดโปรไฟล์ในการทดลองเรือนกระจกครั้งแรก

ในการวิเคราะห์การแสดงออกของยีน การปลูกในโรงเรือนทดลอง ตัวอย่างที่สองจากเดือนมิถุนายน
2012 กันยายน 2012 . ในการพัฒนาพ. napus เมล็ดสะสมอย่างมีนัยสำคัญ
น้ำมันเริ่มต้นที่ 28 DAP ( วันหลังการผสมเกสร ) , และ
ถึงระดับสูงสุดที่ 35 DAP ( ฟาวเลอร์และดาวนี่ย์ , 1970 ;
เกอร์ et al . , 1972 ) ดังนั้น เพื่อประเมินระดับการแสดงออกของปัจจัยการถอดความ
มีส่วนร่วมในการพัฒนาน้ำมัน ได้แก่ ผักใบ cotyledon1
napus 2 ( bnlec1 และ 2 ) โดย acidinsensitive
3 ( bnabi3 ) และ wrinkled1 ( bnwri1 ) , เมล็ดพันธุ์การเก็บตัวอย่าง
ที่ 14 , 21 , 28 และ 35 DAP . สำหรับการทดลองอื่น ๆทั้งหมด ,
เมล็ดที่เก็บรวบรวมที่ 35 DAP เว้นแต่ที่ระบุไว้เป็นอย่างอื่น ทั้งการวิเคราะห์การแสดงออกของยีนจำนวน

( Q ) โดยใช้ปริมาณ RT-PCR ( elhiti et al . , 2010 ) ด้วยไพรเมอร์ที่มีอยู่ลำดับ
( prystenski 2011 ; elhiti et al . , 2012 ) ที่ระบุไว้ในตารางเสริม
1 เหล่านี้รวมถึงวิเคราะห์ยีนที่เกี่ยวข้องกับไกลโคลิซิส :
fruscose bisphosphate ลโดเลส ( bnfpa ) phosphoglycerate
ไคเนส ( bnpgk )