Selected enzymes were finally teste

Selected enzymes were finally tested on alkB gene amplicons of
whole community soil DNA extracts from the microcosms (see
microcosms experiment), using different enzyme- (0.1, 1 and 2 U)
and DNA concentrations (50e100 ng for environmental samples).
2.2. Microcosm experiments
Microcosm experiments were performed as described in Schulz
et al. [12]. Briefly, soil cores (diameter 5 cm; height 5 cm) were
taken from two different top soils at the agricultural research farm
Scheyern (www.helmholtz-muenchen.de/scheyern) in autumn
2007. The soil texture was determined earlier [silty soil: 60.6% silt,
18% sand, 21.4% clay; sandy soil: 31.4% silt, 55.2% sand, 13.4% clay;
both soils had a pH of 6.0 [29]]. After equilibration [2 weeks at 14
C,
55% of the maximum water holding capacity (mWHC)], three cores
of each soil type were sampled prior to incubation with plant litter
(T0). Nine cores of each soil type were amended with 1 g dry weight
(dw) of fresh litter material of maize (Zea mays) and pea (Pisum
sativum), respectively. The mode of alkane provision assured the
establishment of a spatial alkane gradient more than the provision
of liquid alkanes would have done. All cores were incubated in the
dark under constant laboratory conditions (14
C; 55% of mWHC).
Three soil cores of each treatment were sacrificed after two (T2),
eight (T8) and 30 (T30) weeks after litter addition. For each core the
soil subsamples [litteresoil interface (0e0.5 cm below litter) and
bulk soil (1e1.5 cm below litter)] were analyzed. Soil cores incubated
without any litter served as controls and were treated
identical to litter-incubated cores.
2.3. Enrichment of alkane degrading bacteria
Enrichment cultures were established to increase the fraction of
alkane-degrading community members. Conventional liquid subcultivation
combined with a growth matrix-based technique
(litter- and Teflon membranes) was applied [3]. Sand soil subsamples
from the microcosms incubated with maize were incubated
with a 10-fold (w/v) amount of mineral medium (per 1 L:
0.5 g NaCl, 0.5 g KH2PO4, 0.4 g NH4Cl, 0.2 g Na2SO4, 0.4 g KCl, 0.1 g
CaCl2  2H2O, 0.5 g MgCl2  2H2O) and 0.2% sterile n-hexadecane
(Alfa Aesar, Karlsruhe Germany) as a liquid straight-chain model
alkane. Incubation, re-feeding and separation transfer to fresh
mineral medium containing n-hexadecane were performed as
described earlier [3].
2.4. DNA extraction and PCR amplification
Whole community DNA from soil samples was extracted as
described by Griffith et al. [30]. DNA of enrichment cultures was
extracted as described by Maher et al. [31] and modified as
described by Giebler et al. [3]. DNA quality and quantity were
determined by agarose gel electrophoresis and spectrophotometrically
(Nanodrop® ND-1000, Peqlab, Germany). The extracts of
individual replicates were pooled prior to community analysis to
take into account the natural variability of the soil cores and
overcoming heterogeneity effects. Alkane monooxygenase (alkB)
genes were amplified in PCR reactions comprising 15e20 ng of
DNA, 1x Taq PCR Master Mix Kit (Qiagen, Hilden, Germany), 0.12%
BSA and 0.1 mM alkB primers [32] with modifications as described
by Schulz et al. [33] (forward primer alkB 1f_deg 50-AAY ACI GCI
CAY GAR CTI GGI CAY AA-30, reverse primer alkB 1r_deg 50-GCR TGR
TGR TCI GAR TGI CGY TG-30). They covered a broad alkB sequence
diversity and were already applied in three former alkB T-RFLP
protocols [10e12]. PCR was carried out in 25 ml (95
C/10 min, 30
cycles: 95
C/45 s, 58.7
C/1 min, 72
C/45 s and final elongation at
72
C/10 min).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

สุดท้ายทดสอบเลือกเอนไซม์บน alkB amplicons ยีนของชุมชนดินดีเอ็นเอแยกจาก microcosms (ดูmicrocosms ทดลอง), ใช้แตกต่างกันเอนไซม์- (0.1, 1 และ 2 U)และความเข้มข้นของดีเอ็นเอ (50e100 ng ตัวอย่างสิ่งแวดล้อม)2.2. พิภพในการทดลองพิภพในการทดลองได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ใน Schulzal. ร้อยเอ็ด [12] สั้น ๆ ดินแกน (เส้นผ่าศูนย์กลาง 5 ซม. ความสูง 5 ซม.) ได้นำมาจากสองแตกต่างกันบนดินเนื้อปูนที่ฟาร์มเกษตรวิจัยScheyern (www.helmholtz-muenchen.de/ scheyern) ในฤดูใบไม้ร่วง2007.เนื้อดินถูกกำหนดก่อนหน้านี้ [ดินปนทรายแป้ง: 60.6% ตะกอน18% ทราย ดินเหนียว 21.4% ดินทราย: 31.4% ตะกอน ทราย 55.2%, 13.4 ดินดินเนื้อปูนทั้งสองมี pH 6.0 [29]] หลังจาก equilibration [2 อาทิตย์ที่ 14 C55% ของน้ำสูงสุดที่เก็บความจุ (mWHC)], 3 แกนของดินแต่ละชนิดมีตัวอย่างก่อนการบ่มด้วยแคร่โรงงาน(T0) มีแก้ไขแกนเก้าของดินแต่ละชนิด มีน้ำหนักแห้ง 1 กรัม(dw) วัสดุแคร่สดข้าวโพด (ซี mays) และถั่ว (Pisumsativum), ตามลำดับ วิธีการสำรองอัลเคนที่มั่นใจได้ของอัลเคนปริภูมิไล่ให้มากกว่าของเหลว alkanes จะทำ แกนทั้งหมดถูก incubated ในการมืดภายใต้เงื่อนไขปฏิบัติคง (14 C; 55% ของ mWHC)สามแกนดินของแต่ละทรีทเม้นต์ได้เสียสละหลังสอง (T2),แปด (T8) และสัปดาห์ที่ 30 (T30) หลังจากนี้แคร่ สำหรับแต่ละหลักการดิน subsamples [litteresoil อินเตอร์เฟซ (0e0.5 ซม.ใต้แคร่) และเป็นกลุ่มดิน (1e1.5 ซม.ใต้แคร่)] ได้วิเคราะห์ แกนดิน incubatedไม่แคร่ใด ๆ เสิร์ฟ เป็นควบคุม และได้รับการรักษาเหมือนกับแกน incubated แคร่2.3 การเพิ่มความสมบูรณ์ของอัลเคนลดแบคทีเรียโดดเด่นวัฒนธรรมก่อตั้งขึ้นเพื่อเพิ่มสัดส่วนของอัลเคนลดสมาชิกชุมชน Subcultivation ของเหลวทั่วไปรวมกับเทคนิคเมทริกซ์การเจริญเติบโต(แคร่และสารเทฟลอน) ที่ใช้ [3] ดินทราย subsamplesจาก microcosms incubated กับข้าวโพดถูก incubatedมียอดเงิน (w/v) 10-fold ของกลางแร่ (ต่อ 1 l:0.5 กรัม KCl 0.4 g NaCl, KH2PO4 0.5 g, 0.4 g NH4Cl, Na2SO4 0.2 g 0.1 gCaCl2 2H2O, 0.5 g MgCl2 2H2O) และ 0.2% n-hexadecane กอซ(Alfa Aesar คาร์ลส์รูเออเยอรมนี) เป็นแบบโซ่ตรงของเหลวอัลเคน คณะทันตแพทยศาสตร์ การให้อาหาร และแยกโอนย้ายไปที่สดแร่ขนาดกลางที่มี n-hexadecane ดำเนินเป็นอธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [3]2.4. ดีเอ็นเอแยกและขยาย PCRชุมชนทั้งหมดดีเอ็นเอจากตัวอย่างดินที่ถูกแยกเป็นอธิบายโดยมหานคร Griffith et al. [30] มีดีเอ็นเอของวัฒนธรรมโดดเด่นแยกตามที่อธิบายไว้โดยมาฮิรร้อยเอ็ด al. [31] และปรับเปลี่ยนเป็นอธิบายโดย Giebler et al. [3] ดีเอ็นเอตรวจสอบคุณภาพและปริมาณกำหนด โดย agarose เจ electrophoresis และ spectrophotometrically(Nanodrop ® ND-1000, Peqlab เยอรมนี) บางส่วนของสามารถจำลองแต่ละถูกทางถูกพูก่อนวิเคราะห์ชุมชนเพื่อคำนึงถึงความแปรผันธรรมชาติของแกนดิน และขจัดหมดสิ้นลักษณะพิเศษ heterogeneity Monooxygenase อัลเคน (alkB)ยีนที่ถูกขยายในปฏิกิริยา PCR ประกอบด้วย 15e20 ng ของดีเอ็นเอ PCR x Taq 1 หลักผสมชุด (Qiagen, Hilden เยอรมนี), 0.12%บีเอสเอและ 0.1 มม. alkB ไพรเมอร์ [32] ด้วยการปรับเปลี่ยนดังที่โดย Schulz et al. [33] (ส่งต่อพื้น alkB 1f_deg 50-AAY GCI อะCAY CAY gar คู CTI GGI AA-30 พื้นกลับ alkB 1r_deg 50 GCR TGRTGR TCI TGI GAR คู CGY TG-30) จะครอบคลุมกว้าง alkB ลำดับความหลากหลาย และถูกนำไปใช้แล้วในสามอดีต alkB T-RFLPโพรโทคอล [10e12] PCR ถูกดำเนินการใน 25 ml (95 C/10 min, 30รอบ: C/45 s, 58.7 C/1 นาที 72 C 95/45 s และ elongation ขั้นสุดท้ายที่10 นาที 72 C)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

เอนไซม์ที่เลือกไว้ถูกนำมาทดสอบในที่สุด alkB amplicons ยีนของ
ชุมชนของสารสกัดดีเอ็นเอจากดินทั้งจุลภาค (ดู
นิเวศน์จำลองการทดลอง) โดยใช้ enzyme- แตกต่างกัน (0.1, 1 และ 2 U)
และความเข้มข้นของดีเอ็นเอ (50e100 ng สำหรับตัวอย่างสิ่งแวดล้อม).
2.2 พิภพการทดลอง
การทดลอง Microcosm ได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ในชัลส์
และคณะ [12] สั้น ๆ แกนดิน (เส้นผ่าศูนย์กลาง 5 ซมความสูง 5 ซม.) ถูก
นำมาจากสองดินด้านบนที่แตกต่างกันที่ฟาร์มวิจัยทางการเกษตร
Scheyern (www.helmholtz-muenchen.de/scheyern) ในฤดูใบไม้ร่วง
2007 เนื้อดินที่ถูกกำหนดไว้ก่อนหน้านี้ [ดินปนทรายแป้ง: ตะกอน 60.6%,
18% ทราย, ดิน 21.4%; ดินทราย: ตะกอน 31.4%, 55.2% ทราย, ดิน 13.4%;
ดินทั้งสองมีค่า pH 6.0 [29]] หลังจากที่สมดุล [2 สัปดาห์ที่ 14 องศาเซลเซียส,
55% ของกำลังการผลิตน้ำสูงสุดโฮลดิ้ง (MWHC)] สามแกน
ของชนิดของดินแต่ละตัวอย่างก่อนที่จะบ่มเพาะกับครอกพืช
(T0) เก้าแกนของชนิดของดินแต่ละที่มีการแก้ไขเพิ่มเติม 1 กรัมน้ำหนักแห้ง
(DW) ของวัสดุครอกสดข้าวโพด (Zea mays) และกฟภ. (pisum
sativum) ตามลำดับ โหมดของการให้เคนมั่นใจได้
จัดตั้งลาดอวกาศเคนมากกว่าบทบัญญัติ
ของอัลเคนของเหลวจะทำ แกนทั้งหมดถูกบ่มใน
ที่มืดภายใต้เงื่อนไขการทดลองคงที่ (14 C? 55% ของ MWHC).
สามแกนดินของการรักษาแต่ละเสียสละหลังจากที่สอง (T2)
แปด (T8) และ 30 (T30) สัปดาห์หลังจากนอกจากครอก สำหรับแต่ละแกน
ดิน subsamples [litteresoil อินเตอร์เฟซ (0e0.5 ซม. ด้านล่างครอก) และ
ดินเป็นกลุ่ม (1e1.5 ซม. ด้านล่างครอก)] ที่ได้มาวิเคราะห์ แกนดินบ่ม
โดยไม่ทิ้งขยะใด ๆ ที่ทำหน้าที่เป็นผู้ควบคุมและการได้รับการปฏิบัติ
เหมือนกันกับแกนครอกบ่ม.
2.3 เพิ่มคุณค่าของแบคทีเรียย่อยสลายเคน
วัฒนธรรมการตกแต่งที่ถูกจัดตั้งขึ้นเพื่อเพิ่มส่วนของ
สมาชิกในชุมชนเคนย่อยสลาย subcultivation ของเหลวธรรมดา
รวมกับที่ใช้เมทริกซ์การเจริญเติบโตเทคนิค
(litter- และเยื่อเทฟลอน) ถูกนำมาใช้ [3] ดินทราย subsamples
จากจุลภาคบ่มกับข้าวโพดถูกบ่ม
กับ 10 เท่า (w / v) มูลค่าของกลางแร่ (ต่อ 1 ลิตร:
0.5 กรัมโซเดียมคลอไรด์, 0.5 กรัม KH2PO4 0.4 กรัม NH4Cl, 0.2 กรัม Na2SO4 0.4 กรัมโพแทสเซียม 0.1 กรัม
CaCl2? 2H2O, 0.5 กรัม MgCl2? 2H2O) และ 0.2% เป็นหมัน n-hexadecane
(เคมีเภสัช, Karlsruhe เยอรมนี) เป็นของเหลวแบบตรงโซ่
เคน บ่มเพาะอีกครั้งการให้อาหารและการถ่ายโอนการแยกสด
ขนาดกลางที่มีแร่ n-hexadecane ถูกดำเนินการตามที่
อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [3].
2.4 สกัดดีเอ็นเอและขยาย PCR
ดีเอ็นเอชุมชนทั้งจากตัวอย่างดินที่ถูกสกัดเป็น
อธิบายโดยริฟฟิ ธ และคณะ [30] ดีเอ็นเอของวัฒนธรรมที่เพิ่มคุณค่าถูก
สกัดตามที่อธิบายไว้โดยเฮอร์และคณะ [31] และแก้ไขตามที่
อธิบายไว้โดย Giebler และคณะ [3] ที่มีคุณภาพและปริมาณดีเอ็นเอถูก
กำหนดโดยข่าวคราว agarose และ spectrophotometrically
(Nanodrop® ND-1000, Peqlab, เยอรมนี) สารสกัดจาก
ซ้ำแต่ละคนมารวมกลุ่มกันก่อนที่จะมีการวิเคราะห์ชุมชนเพื่อ
คำนึงถึงความแปรปรวนของธรรมชาติของแกนดินและ
การเอาชนะผลกระทบแตกต่าง อัลเคน monooxygenase (alkB)
ยีนที่ถูกขยายในปฏิกิริยา PCR ประกอบ 15e20 ศึกษาของ
ดีเอ็นเอ 1x Taq PCR Master Mix Kit (Qiagen, ฮิลเดน, เยอรมนี), 0.12%
BSA และ 0.1 มิลลิไพร alkB [32] มีการปรับเปลี่ยนตามที่อธิบายไว้
โดยชัลส์และคณะ . [33] (ไปข้างหน้าไพร alkB 1f_deg 50 AAY ACI GCI
CAY GAR CTI GGI CAY AA-30, reverse ไพร alkB 1r_deg 50 GCR TGR
TGR TCI GAR TGI CGY TG-30) พวกเขาครอบคลุมลำดับ alkB กว้าง
หลากหลายและถูกนำไปใช้แล้วในสามอดีต alkB T-RFLP
โปรโตคอล [10e12] PCR ได้ดำเนินการใน 25 มล. (95 C / 10 นาที, 30?
รอบ?? 95 C / 45 วินาที, 58.7 C / 1 นาที, 72 C / 45 และการยืดตัวสุดท้ายที่
72 C / 10 นาที)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การคัดเลือกเอนไซม์ก็ทดสอบบน alkb ยีน amplicons ของ
ทั้งชุมชนดินดีเอ็นเอ สารสกัดจาก microcosms ( ดู
microcosms การทดลองใช้เอนไซม์ที่แตกต่างกัน ( 0.1 , 1 และ 2 u )
และ DNA ความเข้มข้น ( 50e100 ng สำหรับตัวอย่างสิ่งแวดล้อม ) .
2.2 . พิภพการทดลอง
พิภพทดลองตามที่อธิบายไว้ในชูลซ์
et al . [ 12 ] สั้น , แกนดิน ( เส้นผ่าศูนย์กลาง 5 ซม.ความสูง 5 cm )
ถ่ายจากด้านบนที่แตกต่างกันสองดินวิจัยเกษตรฟาร์ม
scheyern ( www.helmholtz-muenchen . de / scheyern ) ในฤดูใบไม้ร่วง
2007 พระเนื้อดิน ตัดสินใจเร็ว [ ปนทรายแป้ง ดิน : 60.6 % ตะกอน
18 % ทราย , 21.4% ดินเหนียว ดินทราย : 31.4 % ตะกอน ประชาชนร้อยละ 13.4 % ทราย ดินเหนียว ดินมีความเป็นกรด
ทั้ง 6 [ 29 ] ] หลังจาก equilibration [ 2 สัปดาห์ที่ 14

C55% ของอุ้งน้ำสูงสุด ( mwhc ) ] ,
3 แกนของดินแต่ละประเภท จำนวนก่อนการบ่มด้วย
แคร่พืช ( t0 ) เก้าแกนของดินแต่ละชนิดผสมกับ 1 g
( DW ) น้ำหนักแห้งของวัสดุเศษซากพืชสดของข้าวโพด ( ข้าวโพด ) และการไฟฟ้าส่วนภูมิภาค ( pisum
sativum ) ตามลำดับ โหมดของการจัดตั้งโครงสร้างมั่นใจ
ไล่สีแอลเคนพื้นที่มากกว่าการให้
ของเหลวของการทำ ทุกแกนถูกบ่มใน
มืดภายใต้สภาวะห้องปฏิบัติการคงที่ ( 14
C ; 55% ของ mwhc )
3 ดินแกนของการรักษาแต่ละพลีชีพหลัง 2 ( T2 )
8 ( T8 ) และ 30 ( T30 ) สัปดาห์หลังจาก 2 แคร่ สำหรับแต่ละแกนดิน subsamples
[ litteresoil อินเตอร์เฟซ ( 0e0.5 ซม. ด้านล่าง ซากพืชและดิน ( เป็นกลุ่ม )
1e1.5 ซม. ด้านล่างแคร่ ) ข้อมูลแกนดินบ่ม
โดยไม่แคร่ทำหน้าที่ควบคุมและถูกปฏิบัติเหมือนกันครอกบ่มแกน
.
2.3 เสริมโครงสร้างย่อยสลายเชื้อโรค
เสริมวัฒนธรรมก่อตั้งขึ้นเพื่อเพิ่มสัดส่วนของสมาชิกชุมชนย่อยสลายโครงสร้าง
.
subcultivation เหลวปกติ รวมกับการใช้เทคนิคเมทริกซ์
( ครอกและเทฟลอน ใช้ membranes ) [ 3 ]ทรายดิน subsamples
จาก microcosms เลี้ยงด้วยข้าวโพดหมัก
ด้วย 10 เท่า ( w / v ) ปริมาณของแร่ขนาดกลาง ( ต่อ 1 L :
0.5 g NaCl 0.5 กรัม kh2po4 0.4 กรัม 4 . 0.2 กรัม na2so4 0.4 กรัมโพแทสเซียม , 0.1 g
CaCl2  2H2O-dx , 0.5 กรัม ชุด  2H2O-dx ) และ 0.2% เป็นหมัน n-hexadecane
( Alfa aesar Karlsruhe , เยอรมนี ) เป็นโครงสร้างแบบโซ่ตรง
ของเหลว ระยะเวลาการโอนอีกครั้งและให้อาหารสด
แร่อาหารที่ n-hexadecane มีการปฏิบัติ
อธิบายไปก่อนหน้านี้ [ 3 ] .
2.4 . การสกัดดีเอ็นเอและดีเอ็นเอ ( DNA จากตัวอย่างดินทั้งชุมชน

ถูกสกัดเป็นอธิบายโดย Griffith et al . [ 30 ] ดีเอ็นเอของเสริมวัฒนธรรมคือ
สกัดตามที่อธิบายไว้โดย Maher et al . [ 31 ] และดัดแปลงเป็น
อธิบายโดย giebler et al . [ 3 ] คุณภาพและปริมาณเป็น
ดีเอ็นเอกำหนดโดยวิธีเจล , นี้
( nanodrop ® nd-1000 peqlab , เยอรมนี ) สารสกัดจาก
ซ้ำแต่ละตัวก่อนการวิเคราะห์รวมชุมชน
คำนึงถึงความผันแปรตามธรรมชาติของดินและแกน
เอาชนะสามารถผล monooxygenase แอลเคน ( alkb )
ยีนขยายในปฏิกิริยา PCR ประกอบด้วย 15e20 นาโน
ดีเอ็นเอ1 ) อาจารย์ผสมได้ดี Kit ( QIAGEN Hilden เยอรมนี , ) , ( 0.12 %
และ 0.1 มิลลิเมตร alkb ไพรเมอร์ [ 32 ] กับการปรับเปลี่ยนตามที่อธิบาย
โดยชูลซ์ et al . [ 33 ] ( ส่งต่อรองพื้น alkb 1f_deg 50-aay ACI GCI
Cay Gar CTI GGI เคย์ aa-30 ย้อนกลับรองพื้น alkb 1r_deg 50-gcr tgr
tgr สบท Gar TGI ระหว่าง tg-30 ) ครอบคลุมกว้าง alkb ลำดับ
ความหลากหลายและก็ใช้สามอดีต alkb t-rflp
โปรโตคอล [ 10e12 ]โดยได้ดำเนินการใน 25 ml ( 95
C / 10 นาที , 30
รอบ : 95
C / 45 S , 58.7
C / นาที 1 , 72
C / 45 และยืดตัวสุดท้ายที่
72
C / 10 นาที )