3. Results and discussion3.1. Valid

3. Results and discussion
3.1. Validation and determination of the most suitable miRNA normalizers

Applying the geNorm algorithm, the following stability rank order was obtained: miR92 < miR191 < miR374 < miR484 < miR423 < RNU48. Due to missing data, candidates miR26b, RNU24, RNU44 and RNU47 were automatically excluded from analysis (no detectable expression of these targets across the tested sample set). After changing from SYBR® Green to TaqMan®, miR191 was excluded due to chemistry related differences. With M-values of 0.545 and 0.658, respectively, candidates miR92 and miR374 were determined to be the most stable expressed genes and thus used as normalizers for following experiments.

3.2. Impact assessment of using validated or non-validated normalizers on miRNA target expression

The choice of endogenous controls for normalization influenced the relative quantity of examined markers. Regarding the blood-specific marker miR16, it was clearly possible to differentiate blood (mean NRQ: 276.28) from the other body fluids and skin (mean NRQs < 1) using U6B as normalizer. In comparison, it was not possible to distinguish blood cells from the other cell types when miR92 and miR374 were applied as normalizers. All mean NRQs scattered in a range between 0.19 and 2.52. Results for miR451 also showed the possibility for an unambiguous identification of blood, applying both U6B and the previously validated references. Solely, the expression of blood compared to all other samples was much higher using U6B (mean NRQ of blood: 2384.53). Applying miR92 and miR374, blood samples showed a mean NRQ of 32.32.

Regarding both semen markers and skin marker miR203, an unambiguous identification of the cell type’s origin was only possible if both validated endogenous controls were used as normalizers. Data of semen-specific marker miR135b generally showed higher expressions when using miR92 and miR374 to correct the relative quantities measured (Fig. 1). The NRQs for blood clustered around 0.005, while the values for the other cell types showed higher expressions (highest mean NRQ of 19.95 in semen samples). This indicates that miR135b is not specifically expressed in semen but rather in epithelial cells. Data for skin-specific marker miR203 revealed similar results showing high expression values in semen, saliva and skin samples. In comparison, NRQs of all sample types clustered in a narrow range when data were corrected with U6B. In these cases, a positive cell type identification was not possible. Both saliva markers (miR205 and miR658) did not give any results probably due to technical problems.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

3. ผล และการอภิปราย3.1 การตรวจสอบและการกำหนด normalizers เที่ยวเหมาะสมที่สุดใช้อัลกอริทึม geNorm ลำดับยศเสถียรต่อมา: miR92 < miR191 < miR374 < miR484 < miR423 < RNU48 เนื่องจากข้อมูลที่หายไป ผู้สมัคร miR26b, RNU24, RNU44 และ RNU47 โดยอัตโนมัติไม่รวมวิเคราะห์ (นิพจน์ไม่ปนของเป้าหมายเหล่านี้ในการตั้งค่าตัวอย่างทดสอบ) หลังจากเปลี่ยนจากสีเขียว SYBR ® TaqMan ® miR191 ถูกคัดออกเนื่องจากเคมีที่เกี่ยวข้องกับความแตกต่างกัน M-ค่า 0.545 และ 0.658 ตามลำดับ ผู้สมัคร miR92 และ miR374 กำหนด แสดงยีนมีเสถียรภาพมาก และจึง ใช้เป็น normalizers สำหรับการทดลองต่อไปนี้3.2. ผลกระทบต่อการประเมินโดยใช้การตรวจสอบหรือ normalizers ที่ไม่ได้ผ่านการตรวจสอบบนเที่ยวเป้าหมายนิพจน์ทางเลือกของการควบคุมภายนอกสำหรับฟื้นฟูผลปริมาณสัมพันธ์ของเครื่องหมายตรวจสอบ เกี่ยวกับ miR16 เครื่องหมายเฉพาะเลือด มันเป็นไปได้อย่างชัดเจนเพื่อแบ่งแยกเลือด (หมายถึง NRQ: 276.28) จากร่างกายและผิวอื่น ๆ (หมายถึง NRQs < 1) ใช้ U6B เป็นนอร์มอลไลเซอร์ ในการเปรียบเทียบ ไม่สามารถแยกเซลล์เม็ดเลือดจากเซลล์ชนิดอื่น ๆ เมื่อใช้ miR92 และ miR374 เป็น normalizers ทั้งหมดหมายถึง NRQs ที่กระจายอยู่ในช่วงระหว่าง 0.19 และ 2.52 ผลลัพธ์สำหรับ miR451 ยังแสดงให้เห็นความเป็นไปได้สำหรับการระบุที่ชัดเจนของเลือด การใช้ U6B และการอ้างอิงที่ผ่านการตรวจสอบก่อนหน้านี้ เท่า นิพจน์ของเลือดเปรียบเทียบกับตัวอย่างอื่น ๆ ได้มากขึ้นโดยใช้ U6B (หมายถึง NRQ เลือด: 2384.53) ใช้ miR92 และ miR374 ตัวอย่างเลือดพบว่ามีความหมาย NRQ ของ 32.32เกี่ยวกับเครื่องหมายน้ำเชื้อและ miR203 เครื่องหมายผิว การระบุที่ชัดเจนของจุดเริ่มต้นของชนิดของเซลล์เป็นสามารถทำได้ถ้าตัวควบคุมภายนอกผ่านการตรวจสอบทั้งสองถูกใช้เป็น normalizers ข้อมูลของเครื่องหมายเฉพาะน้ำเชื้อ miR135b พบว่าสูงกว่านิพจน์ทั่วไปเมื่อใช้ miR92 และ miR374 เมื่อต้องการแก้ไขปริมาณสัมพัทธ์วัด (รูปที่ 1) NRQs เลือดจับกลุ่มรอบ 0.005 ในขณะที่ค่าของเซลล์ชนิดอื่น ๆ พบว่าสูงกว่านิพจน์ (NRQ หมายถึงสูงสุดของ 19.95 ในตัวอย่างน้ำเชื้อ) บ่งชี้ว่า miR135b ไม่แสดงโดยเฉพาะ ในน้ำเชื้อ แต่ ในเซลล์เยื่อบุผิวค่อนข้าง ข้อมูลสำหรับ miR203 เครื่องหมายเฉพาะผิวเผยผลคล้ายการแสดงนิพจน์สูงค่าในตัวอย่างน้ำเชื้อ น้ำลาย และผิว ในการเปรียบเทียบ NRQs ทุกตัวอย่างประเภทกลุ่มในช่วงแคบเมื่อข้อมูลถูกแก้ไข โดย U6B ในกรณีเหล่านี้ การบวกเซลล์ระบุชนิดไม่ได้ เครื่องหมายทั้งน้ำลาย (miR205 และ miR658) ไม่ได้ไม่ให้ผลลัพธ์ใด ๆ อาจเป็น เพราะปัญหาทางเทคนิค

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

3. ผลการทดลองและการอภิปราย
3.1 การตรวจสอบและความมุ่งมั่นของ normalizers miRNA ที่เหมาะสมที่สุดในการใช้อัลกอริทึม geNorm ที่เสถียรภาพลำดับต่อไปนี้ได้: miR92 <miR191 <miR374 <miR484 <miR423 <RNU48 เนื่องจากข้อมูลที่หายไปผู้สมัคร miR26b, RNU24, RNU44 และ RNU47 ได้รับการยกเว้นจากการวิเคราะห์โดยอัตโนมัติ (ไม่มีการตรวจพบการแสดงออกของเป้าหมายเหล่านี้ผ่านการทดสอบชุดตัวอย่าง) หลังจากที่เปลี่ยนจากสีเขียวSYBR®TaqMan®, miR191 ได้รับการยกเว้นเนื่องจากความแตกต่างที่เกี่ยวข้องกับเคมี ด้วย M-ค่า 0.545 และ 0.658 ตามลำดับผู้สมัคร miR92 และ miR374 ได้รับการพิจารณาให้เป็นยีนที่แสดงความมีเสถียรภาพมากที่สุดจึงนำมาใช้เป็น normalizers สำหรับการทดลองต่อไป. 3.2 การประเมินผลกระทบของการใช้การตรวจสอบหรือ normalizers ไม่ใช่การตรวจสอบการแสดงออกเป้าหมาย miRNA ทางเลือกของการควบคุมภายนอกสำหรับการฟื้นฟูอิทธิพลต่อปริมาณญาติของเครื่องหมายการตรวจสอบ เกี่ยวกับเลือดเฉพาะ miR16 เครื่องหมายมันเป็นไปได้อย่างชัดเจนถึงความแตกต่างในเลือด (หมายถึง NRQ: 276.28) จากของเหลวในร่างกายและผิวหนังอื่น ๆ (หมายถึง NRQs <1) ใช้เป็น U6B Normalizer ในการเปรียบเทียบมันเป็นไปไม่ได้ที่จะแยกแยะเซลล์เม็ดเลือดจากเซลล์ชนิดอื่น ๆ เมื่อ miR92 และ miR374 ถูกนำไปใช้เป็น normalizers ทั้งหมด NRQs เฉลี่ยกระจายอยู่ในช่วงระหว่าง 0.19 และ 2.52 ผลการค้นหาสำหรับ miR451 ยังแสดงให้เห็นความเป็นไปได้สำหรับการระบุตัวตนที่ชัดเจนของเลือดใช้ทั้ง U6B และการอ้างอิงการตรวจสอบก่อนหน้านี้ แต่เพียงผู้เดียว, การแสดงออกของเลือดเมื่อเทียบกับตัวอย่างอื่น ๆ ทั้งหมดเป็นที่สูงขึ้นมากโดยใช้ U6B (หมายถึง NRQ เลือด: 2384.53) การประยุกต์ใช้ miR92 และ miR374, ตัวอย่างเลือดพบว่ามีค่าเฉลี่ยของ NRQ 32.32. เกี่ยวกับทั้งเครื่องหมายน้ำอสุจิและผิวหนังเครื่องหมาย miR203, บัตรประจำตัวที่ชัดเจนของแหล่งที่มาประเภทของเซลล์เป็นเพียงเป็นไปได้ถ้าทั้งการตรวจสอบการควบคุมภายนอกถูกนำมาใช้เป็น normalizers ข้อมูลของน้ำอสุจิเฉพาะเครื่องหมาย miR135b ทั่วไปแสดงให้เห็นการแสดงออกที่สูงขึ้นเมื่อใช้ miR92 และ miR374 เพื่อแก้ไขปริมาณการวัด (รูปที่ 1). NRQs เลือดห้อมล้อม 0.005 ในขณะที่ค่าสำหรับเซลล์ชนิดอื่น ๆ ที่แสดงให้เห็นการแสดงออกที่สูงขึ้น (สูงสุดเฉลี่ยของ NRQ 19.95 ในตัวอย่างน้ำอสุจิ) นี้บ่งชี้ว่า miR135b จะไม่แสดงเฉพาะในน้ำอสุจิ แต่ในเซลล์เยื่อบุผิว ข้อมูลสำหรับผิวเฉพาะ miR203 เครื่องหมายเปิดเผยผลที่คล้ายกันแสดงค่าการแสดงออกในระดับสูงในน้ำอสุจิน้ำลายและตัวอย่างผิว ในการเปรียบเทียบ NRQs ประเภทตัวอย่างทุกกลุ่มในช่วงแคบ ๆ เมื่อข้อมูลที่ได้รับการแก้ไขด้วย U6B ในกรณีนี้การระบุชนิดของเซลล์ในเชิงบวกเป็นไปไม่ได้ ทั้งน้ำลายเครื่องหมาย (miR205 และ miR658) ไม่ได้ให้ผลใด ๆ อาจเป็นเพราะปัญหาทางเทคนิค