Pyrosequencing is a DNA sequencing

Pyrosequencing is a DNA sequencing technique that is based on the detection of released pyrophosphate (PPi) during DNA synthesis. In a cascade of enzymatic reactions, visible light is generated that is proportional to the number of incorporated nucleotides (Fig.1). The cascade starts with a nucleic acid polymerization reaction in which inorganic PPi is released as a result of nucleotide incorporation by polymerase. The released PPi is subsequently converted to ATP by ATP sulfurylase, which provides the energy to luciferase to oxidize luciferin and generate light. Because the added nucleotide is known, the sequence of the template can be determined. The nucleic acid molecule can be either RNA or DNA. However, because DNA polymerases show higher catalytic activity than RNA polymerases for limited nucleotide extension, efforts have been focused on the use of a primed DNA template for pyrosequencing. Standard pyrosequencing uses the Klenow fragment of Escherichia coli DNA Pol I, which is a relatively slow polymerase (Benkovic and Cameron 1995). The ATP sulfurylase used in pyrosequencing is a recombinant version from the yeast Saccharomyces cerevisiae(Karamohamed et al. 1999a) and the luciferase is from the American firefly Photinus pyralis. The overall reaction from polymerization to light detection takes place within 3–4 sec at room temperature. One pmol of DNA in a pyrosequencing reaction yields 6 × 1011 ATP molecules which, in turn, generate more than 6 × 109 photons at a wavelength of 560 nanometers. This amount of light is easily detected by a photodiode, photomultiplier tube, or a charge-coupled device camera (CCD) camera. There are two different pyrosequencing strategies that are currently available: solid-phase pyrosequencing (Ronaghi et al. 1996) and liquid-phase pyrosequencing (Ronaghi et al. 1998b). Solid-phase pyrosequencing (Fig. 2) utilizes immobilized DNA in the three-enzyme system described previously. In this system a washing step is performed to remove the excess substrate after each nucleotide addition. In liquid-phase pyrosequencing (Fig.3) apyrase, a nucleotide-degrading enzyme from potato, is introduced to make a four-enzyme system. Addition of this enzyme has eliminated the need for solid support and intermediate washing thereby enabling the pyrosequencing reaction to be performed in a single tube. These formats are described in detail in this review.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

Pyrosequencing เป็นเทคนิคลำดับดีเอ็นเอที่ใช้ในการตรวจจับออก pyrophosphate (PPi) ในระหว่างการสังเคราะห์ดีเอ็นเอ ในการเรียงซ้อนของปฏิกิริยาเอนไซม์ แสงที่มองเห็นการสร้างที่เป็นสัดส่วนกับจำนวนนิวคลีโอไทด์ที่จัดตั้งขึ้น (Fig.1) ทั้งหมดเริ่มต้น ด้วยปฏิกิริยา polymerization กรดนิวคลีอิกที่ PPi อนินทรีย์ออกเป็นผลมาจากการรวมตัวกันของนิวคลีโอไทด์ โดยพอลิเมอเรส PPi ออกมาได้จะถูกแปลงเป็น ATP โดย ATP sulfurylase ซึ่งให้พลังงานเพื่อ luciferase ออกซิไดซ์ luciferin และสร้าง เนื่องจากนิวคลีโอไทด์เพิ่มทราบ สามารถกำหนดลำดับของแม่ โมเลกุลของกรดนิวคลีอิกอาจเป็น RNA หรือ DNA อย่างไรก็ตาม เนื่องจากดีเอ็นเอ polymerases แสดงกิจกรรมเร่งสูงกว่า RNA polymerases สำหรับส่วนขยายของนิวคลีโอไทด์จำกัด ความพยายามมีการมุ่งเน้นในการใช้แม่แบบดีเอ็นเอรองสำหรับ pyrosequencing ใช้มาตรฐาน pyrosequencing Klenow การแยกส่วนของ Escherichia coli Pol ดีเอ็นเอ ซึ่งเป็นพอลิเมอเรสค่อนข้างช้า (Benkovic และคาเมรอน 1995) Sulfurylase ATP ที่ใช้ pyrosequencing เป็นรุ่น recombinant จากยีสต์ Saccharomyces cerevisiae (Karamohamed et al. 1999a) และ luciferase ที่จากหิ่งห้อยอเมริกัน Photinus pyralis ปฏิกิริยาโดยรวมจากจำนวนการตรวจจับแสงเกิดขึ้นใน 3 – 4 วินาทีที่อุณหภูมิห้อง Pmol หนึ่งของดีเอ็นเอในปฏิกิริยา pyrosequencing ผลผลิต 6 × 1011 ATP โมเลกุลซึ่ง เปิด สร้างมากกว่า 6 × 109 โฟตอนที่ความยาวคลื่น 560 นาโนเมตร สามารถมีการตรวจจับแสงจำนวนนี้โฟโตไดโอด หลอด photomultiplier หรือกล้องกล้อง (CCD) อุปกรณ์ควบคู่–ค่าธรรมเนียม มีสองวิธี pyrosequencing แตกต่างที่มีอยู่: pyrosequencing เฟสของแข็ง (Ronaghi et al. 1996) และ pyrosequencing เฟสของของเหลว (Ronaghi et al. 1998b) Pyrosequencing เฟสของแข็ง (รูป 2) ใช้ดีเอ็นเอแบบตรึงในระบบเอนไซม์สามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ในระบบนี้ เป็นขั้นตอนการซักผ้าจะดำเนินการลบพื้นผิวส่วนเกินหลังจากนิวคลีโอไทด์แต่ละ ในเฟสของของเหลว pyrosequencing (Fig.3) apyrase เอนไซม์ที่ย่อยสลายนิวคลีโอไทด์จากมันฝรั่ง นำมาใช้เพื่อให้ระบบเอนไซม์สี่ นอกจากนี้เอนไซม์นี้จะตัดออกไปต้อง การสนับสนุนไม้ และกลางซักจึงเปิด pyrosequencing ปฏิกิริยาจะดำเนินในหลอดเดียว รูปแบบเหล่านี้จะอธิบายในรายละเอียดในรีวิวนี้

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

pyrosequencing เป็นเทคนิคลำดับดีเอ็นเอที่อยู่บนพื้นฐานของการตรวจสอบการปล่อยตัว pyrophosphate (PPI) ในระหว่างการสังเคราะห์ดีเอ็นเอ ในน้ำตกของปฏิกิริยาของเอนไซม์ที่แสงที่มองเห็นว่าจะถูกสร้างขึ้นเป็นสัดส่วนกับจำนวนนิวคลีโอรวม (รูปที่ 1) น้ำตกจะเริ่มต้นด้วยการเกิดปฏิกิริยาของกรดนิวคลีอิกพอลิเมอที่ PPI นินทรีย์จะถูกปล่อยออกเป็นผลมาจากการรวมตัวกันเบื่อหน่ายจากโพลิเมอร์ ปล่อย PPI จะถูกแปลงต่อมาเอทีพีเอทีพีโดย sulfurylase ซึ่งให้พลังงานในการออกซิไดซ์ luciferase luciferin และสร้างแสง เพราะเบื่อหน่ายเพิ่มเป็นที่รู้จักกันลำดับของแม่สามารถกำหนด โมเลกุลของกรดนิวคลีอิกสามารถเป็นได้ทั้ง RNA หรือดีเอ็นเอ อย่างไรก็ตามเนื่องจากดีเอ็นเอ polymerases แสดงการเร่งปฏิกิริยาสูงกว่า polymerases RNA สำหรับการขยายเบส จำกัด มีความพยายามมุ่งเน้นไปที่การใช้แม่แบบดีเอ็นเอเตรียมไว้สำหรับ pyrosequencing pyrosequencing มาตรฐานใช้ส่วน Klenow ของ Escherichia coli Pol ดีเอ็นเอผมซึ่งเป็นโพลิเมอร์ค่อนข้างช้า (Benkovic และคาเมรอน 1995) เอทีพี sulfurylase ใช้ใน pyrosequencing เป็นรุ่น recombinant จากยีสต์ Saccharomyces cerevisiae (Karamohamed et al. 1999a) และ luciferase มาจากหิ่งห้อยอเมริกัน pyralis Photinus ปฏิกิริยาโดยรวมจากพอลิเมอที่จะตรวจจับแสงจะเกิดขึ้นภายใน 3-4 วินาทีที่อุณหภูมิห้อง หนึ่ง pmol ของดีเอ็นเอในปฏิกิริยา pyrosequencing อัตราผลตอบแทน 6 × 1011 โมเลกุลเอทีพีซึ่งในที่สุดก็สร้างมากกว่า 6 × 109 โฟตอนที่ความยาวคลื่น 560 นาโนเมตร ปริมาณของแสงนี้จะตรวจพบได้ง่ายโดยโฟโตไดโอดหลอด photomultiplier หรือกล้องของอุปกรณ์ชาร์จคู่ (CCD) กล้อง ของเหลวเฟส pyrosequencing (. Ronaghi et al, 1998b) เฟสของแข็ง pyrosequencing (Ronaghi et al, 1996.) และมีสองกลยุทธ์ pyrosequencing ที่แตกต่างกันที่มีอยู่ขณะนี้ เฟสของแข็ง pyrosequencing (รูปที่. 2) ใช้ดีเอ็นเอตรึงในระบบสามเอนไซม์อธิบายไว้ก่อนหน้า ในระบบนี้ขั้นตอนการซักผ้าจะดำเนินการเพื่อลบพื้นผิวส่วนเกินหลังจากแต่ละนอกจากเบื่อหน่าย ในของเหลวเฟส pyrosequencing (รูปที่ 3) apyrase, เอนไซม์ย่อยสลายเบื่อหน่ายจากมันฝ​​รั่งเป็นที่รู้จักที่จะทำให้ระบบสี่เอนไซม์ นอกเหนือจากเอนไซม์นี้ได้ตัดความจำเป็นสำหรับการสนับสนุนที่มั่นคงและซักผ้ากลางจึงทำให้เกิดปฏิกิริยา pyrosequencing ที่จะดำเนินการในหลอดเดียว รูปแบบเหล่านี้จะอธิบายในรายละเอียดในการตรวจสอบนี้

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ไพโรซีเควนซิงเป็นดีเอ็นเอเทคนิคที่ใช้ในการตรวจปล่อยไพโร ( PPI ) ในการสังเคราะห์ดีเอ็นเอ ในน้ำตกปฏิกิริยาของเอนไซม์ที่มองเห็นแสงถูกสร้างขึ้นที่เป็นสัดส่วนกับจำนวนรวมนิวคลีโอไทด์ ( ” ) น้ำตกเริ่มด้วยกรดนิวคลีอิกเกิดปฏิกิริยาที่สารอนินทรีย์ PPI ออกมาเป็นผลของการใช้ลำดับเบสโดย . ออก PPI เป็นต่อมาแปลงเป็น ATP โดยเอทีพี sulfurylase ซึ่งให้พลังงานกับลูซิเฟอเรสในการออกซิไดซ์ลูซิเฟอริน และสร้างแสง เพราะเพิ่มเบสที่เป็นที่รู้จักกัน ลำดับของแม่แบบที่สามารถได้รับการพิจารณา โมเลกุลกรดนิวคลีอิกสามารถ RNA หรือ DNA อย่างไรก็ตาม เนื่องจากสำนักงานปลัดกระทรวงศึกษาธิการแสดงให้ค่าความว่องไวที่สูงกว่า RNA เพื่อส่งเสริมความพยายาม polymerases เบส จำกัด ได้รับการมุ่งเน้นไปที่การใช้ดีเอ็นเอแม่แบบ primed สำหรับไพโรซีเควนซิง . ไพโรซีเควนซิงมาตรฐานใช้ klenow เบสของ Escherichia coli ดีเอ็นเอพล ผม ซึ่งเป็นวิธีที่ค่อนข้างช้า ( benkovic และคาเมรอน 1995 ) เอทีพี sulfurylase ใช้ไพโรซีเควนซิงเป็นรุ่นโปรตีนจากยีสต์ Saccharomyces cerevisiae ( karamohamed et al . 1999a ) และเอนไซม์ลูซิเฟอเรสจากอเมริกัน หิ่งห้อย โฟตินัส pyralis . ปฏิกิริยาพอลิเมอไรเซชันเพื่อตรวจจับแสงโดยรวมจากการใช้สถานที่ภายใน 3 – 4 วินาทีที่อุณหภูมิห้อง หนึ่ง pmol ของดีเอ็นเอในปฏิกิริยาไพโรซีเควนซิงผลผลิต 6  × คุณ ATP โมเลกุลซึ่ง จะสร้างมากกว่า 6  ×  109 โฟตอนที่ความยาวคลื่น 550 นาโนเมตร ปริมาณของแสงนี้ สามารถตรวจพบโดยภายในหลอด , หรือประจุบวกอุปกรณ์กล้อง ( CCD ) กล้อง มีไพโรซีเควนซิงที่แตกต่างกันสองกลยุทธ์ที่พร้อมใช้งานในขณะนี้ : ส่วนไพโรซีเควนซิง ( ronaghi et al . 1996 ) และของเหลวไพโรซีเควนซิง ( ronaghi et al . 1998b ) โซลิดเฟสไพโรซีเควนซิง ( รูปที่ 2 ) ใช้ตรึงเอนไซม์ดีเอ็นเอใน 3 ระบบที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ในระบบล้างขั้นตอนจะดำเนินการเพื่อลบพื้นผิวส่วนเกินหลังจากแต่ละนิวคลีโอไทด์เพิ่มเติม ในการผลิตไพโรซีเควนซิง ( fig.3 ) apyrase , เบสสลายเอนไซม์จากมันฝรั่งจะแนะนำเพื่อให้ระบบสี่เอนไซม์ นอกจากนี้เอนไซม์นี้กำจัดความต้องการการสนับสนุนที่มั่นคงและซักผ้ากลางจึงทำให้ปฏิกิริยาไพโรซีเควนซิงได้ในหลอดเดียว รูปแบบเหล่านี้จะอธิบายในรายละเอียดในบทความนี้