RNA purification and reverse transc

RNA purification and reverse transcription/The nucleic acid eluates were treated with DNase (Turbo DNA-free DNase treatment and removal reagents kit; Ambion Inc., Austin, TX, USA) to remove DNA, DNase, and divalent cations from the RNA preparations. Briefly, 1 ul of Turbo DNase and 5 ul of DNase buffer were added to 50 ul of the extraction sample and incubated for 20 min at 37°C. Next, 5ul of DNase inactivation reagent was added to the sample, which was subsequently mixed and incubated for 5 min at room temperature. The sample mix was then centrifuged at 10,000 x g for 2 min, and the supernatant containing RNA was transferred to a new tube. We then verified that the RNA solution was free of any residual DNA by performing a PCR assay prior to reverse transcripttion.One-step reverse transcription was performed using TaqMan reverse transcription reagents (Applied Biosystems, Roche Molecular Systems Inc., Branchburg, NJ, USA). RNA (10 ul) was added to 40 ul of PCR mix containing MgCl2, deoxynucleoside triphosphates (dNTPs), reverse transcription (RT) buffer, random hexamers, and reverse transcriptase, and reverse transcription was performed using the following cycling conditions: 10 min at 25°C, 30 min at 48°C, and 5 min at 95°C. Random hexamers were used instead of poly(A) oligonucleotides to ensure equivalent reverse transcription efficiency of all targets localized on the same polycistronic RNA strand.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

การทำให้บริสุทธิ์ RNA และการถอดรหัสแบบย้อนกลับ / สารกรดนิวคลีอิกได้รับการบำบัดด้วย DNase (ชุดรีเอเจนต์การรักษาและการกำจัด DNase ที่ปราศจากเทอร์โบ DNA; Ambion Inc., Austin, TX, USA) เพื่อกำจัด DNA, DNase และแคตไอออนไดวาเลนต์จากการเตรียม RNA โดยสรุป Turbo DNase 1 ไมโครลิตรและบัฟเฟอร์ DNase 5 ไมโครลิตรถูกเติมไปยังตัวอย่างการสกัด 50 ไมโครลิตรและบ่มเป็นเวลา 20 นาทีที่ 37°C ต่อไป เติมรีเอเจนต์การยับยั้ง DNase 5 ไมโครลิตรลงในตัวอย่าง ซึ่งต่อมาถูกผสมและบ่มเป็นเวลา 5 นาทีที่อุณหภูมิห้อง จากนั้น ส่วนผสมของตัวอย่างถูกปั่นแยกที่ 10,000 xg เป็นเวลา 2 นาที และส่วนเหนือตะกอนที่มี RNA ถูกถ่ายโอนไปยังหลอดใหม่ จากนั้นเราตรวจสอบว่าสารละลาย RNA ไม่มี DNA ตกค้างโดยทำการทดสอบ PCR ก่อนที่จะทำการถอดรหัสแบบย้อนกลับ การถอดรหัสแบบย้อนกลับขั้นตอนเดียวดำเนินการโดยใช้รีเอเจนต์การถอดรหัสแบบย้อนกลับของ TaqMan (Applied Biosystems, Roche Molecular Systems Inc., Branchburg, NJ, USA) RNA (10 ul) ถูกเติมลงใน 40 ul ของส่วนผสม PCR ที่มี MgCl2, ดีออกซีนิวคลีโอไซด์ไตรฟอสเฟต (dNTPs), บัฟเฟอร์การถอดรหัสแบบย้อนกลับ (RT), เฮกซาเมอร์แบบสุ่ม และทรานสคริปต์แบบย้อนกลับ และการถอดรหัสแบบย้อนกลับถูกดำเนินการโดยใช้เงื่อนไขการหมุนเวียนต่อไปนี้: 10 นาทีที่ 25°C, 30 นาที ที่ 48°C และ 5 นาที ที่ 95°C เฮกซาเมอร์แบบสุ่มถูกนำมาใช้แทนโพลี (A) โอลิโกนิวคลีโอไทด์เพื่อให้แน่ใจว่าประสิทธิภาพการถอดรหัสแบบย้อนกลับที่เทียบเท่าของเป้าหมายทั้งหมดที่แปลเป็นภาษาท้องถิ่นบนสาย RNA polycistronic เดียวกัน

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การทำให้บริสุทธิ์ RNA และการถอดรหัสย้อนกลับ /
การบำบัดด้วยเอนไซม์ดีเอ็นเอสำหรับการล้างกรดนิวคลีอิก (Turbo DNA Free DNA Enzyme Treatment and Removal Kit; Ambion Co. , Ltd, Austin, TX, USA) เพื่อกำจัดดีเอ็นเอเอ็นไซม์ดีเอ็นเอและไอออนไซม์ divalent จากการเตรียม RNA ในระยะสั้นเพิ่ม 1 ul Turbo DNase และบัฟเฟอร์ 5 ul DNase ลงในตัวอย่างการสกัด 50 ul และบ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 20 นาที ถัดไปน้ำยาฆ่าเชื้อ DNase ของ 5ul จะถูกเพิ่มลงในตัวอย่างจากนั้นผสมและบ่มที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 5 นาที จากนั้นส่วนผสมของตัวอย่างจะถูกหมุนเหวี่ยงที่ 10,000xg เป็นเวลา 2 นาทีและถ่ายโอน supernatural ที่มี RNA ลงในหลอดใหม่ จากนั้นเราจะตรวจสอบว่าสารละลาย RNA ไม่มีดีเอ็นเอตกค้างโดยการทดสอบ PCR ก่อนที่จะถอดรหัสย้อนกลับ
การถอดรหัสขั้นตอนเดียวโดยใช้ TaqMan Reverse Reagent (Aplied Biosystems, Roche Molecular Systems Co. , Ltd. สาขา, NJ, USA) เพิ่ม RNA (10ul) ลงใน 40ul PCR ผสมกับ MgCl2, d

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การทําให้บริสุทธิ์ของ rna และการถอดรหัสย้อนกลับ /
การบําบัดกรดนิวคลีอิกด้วยดีเอ็นเอ( Turboไม่มีดีเอ็นเอดีเอ็นเอดีเอสและการกําจัดชุดทดสอบ; Ambion Inc.,Austin,TX,USA )เพื่อขจัดดีเอ็นเอ,ดีเอ็นเอและไอออนไบนารีจากการเตรียมRNA ในระยะสั้น1ไมโครลิตรเทอร์โบดีเอสและ5ไมโครลิตรดีเอ็นเอสบัฟเฟอร์ถูกเพิ่มลงในตัวอย่างที่สกัด50ไมโครลิตรและบ่มที่37°Cเป็นเวลา20นาที จากนั้นเพิ่มตัวทําละลายDNase 5ไมโครลิตรลงในตัวอย่างแล้วผสมและบ่มที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา5นาที จากนั้นส่วนผสมตัวอย่างจะถูกหมุนเหวี่ยงเป็นเวลา2นาทีที่10,000×gและสารละลายที่มีRNAถูกถ่ายโอนไปยังหลอดทดสอบใหม่ จากนั้นเราตรวจสอบว่าสารละลายRNAไม่มีดีเอ็นเอตกค้างใดๆโดยการทดสอบPCRก่อนการถอดรหัสย้อนกลับ
การถอดรหัสแบบย้อนกลับแบบขั้นตอนเดียวได้ดําเนินการโดยใช้ระบบชีวภาพแบบแอ็พพลิเคชัน( Applied Biosystems,Roche Molecular Systems Inc.,Branchburg,NJ,USA ) RNA ( 10μl )ถูกเพิ่มเข้าไปในส่วนผสมPCRที่มี40μlของMgCl 2,dNTPs,บัฟเฟอร์การถอดรหัสย้อนกลับ( RT ),stochasomerและtranscriptaseย้อนกลับถูกถอดรหัสโดยใช้เงื่อนไขการหมุนเวียนต่อไปนี้: 25°Cเป็นเวลา10นาที,48°Cเป็นเวลา30นาทีและ95°Cเป็นเวลา5นาที hexameroแบบสุ่มใช้แทนpoly ( a ) oligonucleotideเพื่อให้แน่ใจว่าประสิทธิภาพการถอดรหัสแบบย้อนกลับของเป้าหมายทั้งหมดที่อยู่ในห่วงโซ่polisparasonsเดียวกัน