2. Materials and methods2.1. Plant

2. Materials and methods
2.1. Plant material
Two apple cultivars (‘Golden Delicious’ and ‘Fuji’, Fig. 1) which
were selected for uniformity of size and absence of defects were
picked from 18-year-old trees grown. The sampling period of
‘Golden Delicious’ was from 14th May to 10th September 2009, corresponding
to 33 and 152 days after full bloom, respectively. The
sampling period of ‘Fuji’ was from 14th May to 8th October 2009,
corresponding to 31 and 178 days after full bloom, respectively.
The sampling intervals were four weeks at early growth stage and
two or three weeks at late growth stage. At each sampling date, 10
fruits were taken for analysis of endogenous NO. In addition 1.5 kg
of apple fruits were frozen in liquid N2 and taken for analysis of the
enzyme activity and NO metabolites.
2.2. Determination of endogenous NO
Endogenous NO was determined according to the procedure
of Leshem et al. (1998) by the Apollo 1000 free radical analyzer
equipped with an NO probe (ISO-NOPF200, World Precision Instruments,
USA). The probe tip was inserted into an incision made with
a finely knife, and the depth of penetration into the fruit flesh was
about 3mm. The probe was held in place until a steady sensor reading
was obtained after 30–150 s. Based on fruit weight, production
rate of endogenous NO was expressed as nmol h−1 g−1 FW.
2.3. l-Arginine-dependent NOS activity assay
NOS activity was assayed according to the method described
by Guo et al. (2003), with slight modifications. Briefly, apple samples
(1 g) and polyvinylpolypyrrolidone (50 mg)were homogenized
in 1ml extraction buffer containing 50mM tri(hydroxymethyl)
aminomethane–hydrochloric acid (Tris–HCl, pH 7.4), 1mM ethylene
diamine tetraacetic acid (EDTA), 320mM sucrose, 1mM
dithiothreitol, 1M pepstatin and 1mM phenylmethanesulfonyl
fluoride. The homogenate was centrifuged at 4 ◦C for 10 min
(10,000×g) and then 30 min (15,000×g). Reaction mixture contained
300l of reaction buffer (25mM Tris–HCl, pH 7.4, 1M
flavin adenine dinucleotide, 1Mflavin mononucleotide, 1mM-
NADPH, 0.6mM calcium chloride, 2mM l-arginine) with 100l
extract. After incubation for 30 min at 37 ◦C, the reaction was
stopped by adding 400l deaerated stop buffer containing 50mM
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES, pH
5.5) and 5mM EDTA. NO content was determined by the Apollo
1000 free radical analyzer equipped with an NO probe (ISONOPF200,
World Precision Instruments, USA). Protein content in
the enzyme extract was determined with the method of Bradford
(1976), using bovine serum albumin as a standard. NOS activity was
expressed as nmolNOmin−1 mg−1 protein.2.4. NR activity assay
NR activity was determined by a slightly modified method
used by Lea et al. (2004). Apple samples (1 g) were ground with
30mg polyvinylpolypyrrolidone in 1ml extract buffer (50mM
HEPES–potassium hydroxide, pH 7.5, 1mM dithiothreitol, 1mM
EDTA and 7mM cysteine), and the homogenate was centrifuged
at 4 ◦C for 10 min (10,000×g). 300l of assayed mixture (50mM
HEPES–potassium hydroxide, pH 7.5, 100M NADH, 5mM potassium
nitrate, 6mM magnesium chloride) was added to 100l
extract. After incubation at 30 ◦C for 30 min, the reaction was
terminated by adding 400l of 1:1 mixture of 1% (w/v) sulfanilamide
in 1.5M HCl and 0.2% (w/v) n-naphtylethylenediamine
dihydrochloride. After color development for 15 min, nitrite
formed was determined spectrophotometrically by measuring
A540.
2.5. Determination of l-arginine
l-Arginine was extracted as described by Gao et al. (2009). Apple
samples (1 g) were ground in 2ml of 10% trichloroacetic acid (w/v),
and the extract was centrifuged at 4 ◦C for 10 min (10,000×g).2.6. Determination of RSNOs
Frozen apple samples (5 g) and polyvinylpolypyrrolidone
(50 mg) were ground with 5ml extract buffer (PBS, pH= 7.4, 10mM
N-ethylmaleimide, 2.5mM EDTA) in the dark. The extract was
centrifuged at 4 ◦C for 10 min (10,000×g). The reductive decomposition
of RSNOs released NO by the addition of 0.1Mcopper sulfate,
subsequently, NO was determined by an NO-sensitive electrode
(ISO-NOPF200, World Precision Instruments). The NO sensor was
immersed into 10.0 ml of 0.1M copper sulfate (pH = 4.0) solution,
and the background current became stable. Next, 0.1 ml of the sample
was injected into the copper sulfate solution, and the response
current was recorded within a few seconds (Zhang et al., 2000).
Based on sensor calibration using nitrosocysteine as a standard,
the RSNOs content was calculated.
2.7. Determination of nitrite and nitrate
5 g of apple samples, together with 50mg polyvinylpolypyrrolidone,
was homogenized with 1ml saturated borax and 5ml doubly
distilled water, and then heated for 15 min in a boiling water bath.
After cooling, 2ml potassium ferrocyanide (0.25M) and 2ml zinc
acetate (1M) were added. The mixture was centrifuged at room
temperature for 10 min (10,000×g). Nitrite and nitrate concentrations
were simultaneously obtained using reduction of nitrate
by vanadium (III) combined with detection by the acidic Griess
reaction (Beda and Nedospasov, 2005).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2. วัสดุและวิธีการ2.1. พืชวัสดุสองพันธุ์แอปเปิ้ล ('ทองอร่อย' และ 'ฟูจิ' Fig. 1) ซึ่งเลือกสำหรับขนาดความรื่นรมย์และขาดความบกพร่องรับจากปลูกต้นไม้อายุ 18 ปี ระยะเวลาการสุ่มตัวอย่าง'ทองอร่อย' ถูก 14 พฤษภาคมถึง 10 2552 กันยายน สอดคล้องกัน33 และ 152 วันหลังบาน ตามลำดับ ที่รอบระยะเวลาในการสุ่มตัวอย่างของ 'ฟูจิ' ถูก 14 พฤษภาคม 2552 ถึง 8 2552 ตุลาคมตรงกับวันที่ 31 และ 178 หลังบาน ตามลำดับช่วงสุ่มได้ 4 สัปดาห์ในระยะแรก ๆ ของการเจริญเติบโต และสอง หรือสามสัปดาห์ในระยะเจริญเติบโตช้า ในแต่ละวันสุ่มตัวอย่าง 10ผลไม้ที่ใช้สำหรับวิเคราะห์เลข endogenous นอกจากนี้ 1.5 กก.แอปเปิ้ล ผลไม้แช่แข็งใน N2 เหลว และใช้สำหรับวิเคราะห์การเอนไซม์และ metabolites ไม่2.2 การกำหนดของ endogenous NOEndogenous ไม่ได้กำหนดตามขั้นตอนของ Leshem et al. (1998) โดยวิเคราะห์อนุมูลอิสระ 1000 อ่าวอพอลโล่พร้อมโพรบไม่ (ISO-NOPF200 เครื่องมือความแม่นยำของโลกสหรัฐอเมริกา) ปลายโพรบถูกแทรกเข้าไปในแผลเป็นที่เกิดขึ้นด้วยความประณีตมีด และความลึกของการเจาะเข้าไปในเนื้อผลไม้มีประมาณ 3 มม. โพรบจัดขึ้นในสถานที่จนกระทั่งอ่านเซ็นเซอร์มั่นคงกล่าวหลังจาก 30 – 150 s ได้ยึดน้ำหนักผลไม้ ผลิตอัตราของ endogenous ไม่ถูกแสดงเป็น nmol h−1 g−1 FW2.3 การวิเคราะห์ l-อาร์จินีนขึ้นอยู่กับหมายเลขกิจกรรมหมายเลขกิจกรรมที่ assayed ตามวิธีการอธิบายไว้โดยกู et al. (2003), มีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย ตัวอย่างสั้น ๆ แอปเปิ้ล(1 กรัม) และ polyvinylpolypyrrolidone (50 มิลลิกรัม) ถูก homogenized เป็นกลุ่มใน 1 มล.สกัดบัฟเฟอร์ที่ประกอบด้วย tri(hydroxymethyl) 50 มม.กรดไฮโดรคลอริก-aminomethane (ตรี – HCl ค่า pH 7.4), เอทิลีน 1 มม.diamine tetraacetic กรด (EDTA), ซูโครส 320mM, 1mMdithiothreitol, pepstatin 1 M และ phenylmethanesulfonyl 1 มม.ฟลูออไรด์ Homogenate ถูก centrifuged ที่ ◦C 4 ใน 10 นาที(10, 000 × g) แล้ว 30 นาที (15, 000 ซื้อ g) ประกอบด้วยส่วนผสมของปฏิกิริยาl 300 ปฏิกิริยาบัฟเฟอร์ (25 มม.ตรี – HCl ค่า pH 7.4, 1 Mflavin adenine dinucleotide 1 Mflavin mononucleotide 1mM-NADPH แคลเซียมคลอไรด์ 0.6 mM, 2 mM l-อาร์จินีน) กับ 100 lแยก หลังจากฟักตัวใน 30 นาทีที่ 37 ◦C มีปฏิกิริยาหยุดเพิ่ม 400 l deaerated หยุดบัฟเฟอร์ประกอบด้วย 50 มม.กรด-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 4 (HEPES ค่า pH5.5) และ 5 mM EDTA เนื้อหาไม่เป็นไปตามอพอลโลวิเคราะห์อนุมูลอิสระ 1000 พร้อมโพรบไม่มี (ISONOPF200โลกความแม่นยำเครื่องมือ สหรัฐอเมริกา) เนื้อหาในโปรตีนสารสกัดจากเอนไซม์ถูกกำหนดกับวิธีของแบรดฟอร์ด(1976), ใช้วัว serum albumin เป็นมาตรฐาน มีหมายเลขกิจกรรมแสดงเป็น nmolNOmin−1 mg−1 protein.2.4 ทดสอบกิจกรรม NRNR กิจกรรมถูกกำหนด โดยวิธีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อยใช้โดย Lea et al. (2004) ตัวอย่างแอปเปิ้ล (1 g) ถูกพื้นดินด้วยpolyvinylpolypyrrolidone 30 มิลลิกรัมใน 1ml แยกบัฟเฟอร์ (50 มม.HEPES – โพแทสเซียมไฮดรอกไซด์ pH 7.5, dithiothreitol 1mM, 1mMEDTA และ 7 มม. cysteine), และ homogenate ถูก centrifugedที่ ◦C 4 ใน 10 นาที (10, 000 ซื้อ g) l 300 assayed ส่วนผสม (50 มม.HEPES – โพแทสเซียมไฮดรอกไซด์ pH 7.5, 100 M NADH โพแทสเซียม 5 มม.ไนเตรต แมกนีเซียมคลอไรด์ 6 mM) ถูกเพิ่มไปยัง 100 lแยก หลังจากบ่มที่ 30 ◦C สำหรับ 30 นาที มีปฏิกิริยายกเลิก โดยเพิ่ม 400 ลิตรส่วนผสม 1:1 ของซัลฟานิลาไมด์ 1% (w/v)1.5 M HCl และ 0.2% (w/v) n-naphtylethylenediaminedihydrochloride หลังจากพัฒนาสีสำหรับ 15 นาที ไนไตรต์รูปแบบที่กำหนด spectrophotometrically โดยวัดA5402.5 การกำหนด l-อาร์จินีนอาร์จินีน l ถูกสกัดตามที่อธิบายไว้โดยเกา et al. (2009) แอปเปิ้ลตัวอย่าง (1 g) ถูกพื้นใน 2ml ของกรด trichloroacetic 10% (w/v),และสารสกัดมี centrifuged ที่ ◦C 4 ใน 10 นาที (10, 000 ซื้อ g) .2.6 กำหนด RSNOsแช่ตัวอย่างแอปเปิ้ล (5 กรัม) และ polyvinylpolypyrrolidone(50 มิลลิกรัม) มีพื้นดินที่ มี 5ml สารสกัดบัฟเฟอร์ (PBS, pH = 7.4, 10 มม.N-ethylmaleimide, 2.5 mM EDTA) ในมืด สารสกัดได้centrifuged ที่ ◦C 4 ใน 10 นาที (10, 000 ซื้อ g) การเน่ากล้าหาญของ RSNOs ไม่ออกด้านนอก 0.1Mcopper ซัลเฟตในเวลาต่อมา ไม่ถูกกำหนด โดยการไฟฟ้าไม่สำคัญ(ISO-NOPF200 เครื่องมือความแม่นยำของโลก) การเซ็นเซอร์ไม่ได้ไปเป็น 10.0 ml ของคอปเปอร์ซัลเฟต 0.1M (ค่า pH = 4.0) โซลูชั่นและพื้นหลังที่ปัจจุบันกลายเป็นมีเสถียรภาพ ถัดไป 0.1 มล.ของตัวอย่างถูกฉีดเข้าไปในโซลูชันคอปเปอร์ซัลเฟต และการตอบสนองปัจจุบันถูกบันทึกไว้ภายในไม่กี่วินาที (Zhang et al., 2000)ตามเทียบเซ็นเซอร์ที่ใช้ nitrosocysteine เป็นมาตรฐานเนื้อหา RSNOs ไม่ได้2.7 การกำหนดของไนไตรต์และไนเตรต5 กรัมอย่างแอปเปิ้ล กับ polyvinylpolypyrrolidone 50 mgถูก homogenized เป็นกลุ่ม borax 1 มล.ที่อิ่มตัวและ 5ml สองเหตุการณ์น้ำกลั่น แล้ว ความร้อนสำหรับในน้ำน้ำเดือด 15 นาทีหลังจากทำความเย็น ferrocyanide โพแทสเซียม 2ml (0.25M) และสังกะสี 2 mlมีเพิ่ม acetate (1M) ส่วนผสมถูก centrifuged ห้องอุณหภูมิใน 10 นาที (10, 000 ซื้อ g) ความเข้มข้นของไนไตรต์และไนเตรตได้พร้อมกันรับใช้ลดไนเตรตโดยวาเนเดียม (III) พร้อมกับตรวจสอบ โดย Griess เปรี้ยวปฏิกิริยา (Beda และ Nedospasov, 2005)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2. วัสดุและวิธีการ
2.1 วัสดุจากพืช
สองสายพันธุ์แอปเปิ้ล ('โกลเด้นอร่อย' และ 'ฟูจิ', รูป. 1) ซึ่ง
ได้รับการคัดเลือกสำหรับความสม่ำเสมอของขนาดและการขาดของข้อบกพร่องที่ถูก
หยิบมาจากต้นไม้ 18 ปีที่ปลูก ระยะเวลาการเก็บตัวอย่างของ
'โกลเด้นอร่อย' จาก 14 พฤษภาคม - 10 กันยายน 2009 ที่เกี่ยวข้อง
ถึง 33 และ 152 วันหลังดอกบานตามลำดับ
ระยะเวลาการเก็บตัวอย่างของ 'ฟูจิ' จาก 14 พฤษภาคม - 8 ตุลาคม 2009
ที่สอดคล้องกับวันที่ 31 และ 178 วันหลังดอกบานตามลำดับ.
ช่วงเวลาการสุ่มตัวอย่างสี่สัปดาห์ในขั้นตอนการเจริญเติบโตของต้นและ
สองหรือสามสัปดาห์ในขั้นตอนการเจริญเติบโตในช่วงปลาย ณ วันที่สุ่มตัวอย่างแต่ละ 10
ผลไม้ที่ถูกนำสำหรับการวิเคราะห์ภายนอก NO นอกจากนี้ 1.5 กก.
ของผลไม้แอปเปิ้ลถูกแช่แข็งในของเหลว N2 และนำการวิเคราะห์
กิจกรรมของเอนไซม์และสาร NO.
2.2 ความมุ่งมั่นของภายนอก NO
NO Endogenous ถูกกำหนดขึ้นมาตามขั้นตอน
ของ Leshem และคณะ (1998) โดยอพอลโล 1000 วิเคราะห์อนุมูลอิสระ
พร้อมกับสอบสวน NO (ISO-NOPF200 โลกเครื่องมือความแม่นยำ
USA) เคล็ดลับการสอบสวนถูกใส่เข้าไปในแผลที่ทำด้วย
มีดอย่างประณีตและความลึกของการเจาะเข้าไปในเนื้อผลไม้ที่เป็น
เกี่ยวกับ 3mm สอบสวนที่จัดขึ้นในสถานที่จนกว่าการอ่านเซ็นเซอร์มั่นคง
ที่ได้รับหลังจากที่ S 30-150 ขึ้นอยู่กับน้ำหนักผลไม้, การผลิต
อัตรา NO ภายนอกได้รับการแสดงเป็นนาโนโม h-1 กรัม-1 FW.
2.3 L-Arginine ขึ้นอยู่กับการทดสอบกิจกรรม NOS
กิจกรรม NOS ได้รับการวิเคราะห์ตามวิธีการที่อธิบายไว้
โดย Guo และคณะ (2003) ที่มีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย สั้น ๆ ตัวอย่างแอปเปิ้ล
(1 กรัม) และ polyvinylpolypyrrolidone (50 มก.) ได้รับการหดหาย
ในบัฟเฟอร์สกัด 1ml มีไตร 50mm (hydroxymethyl)
กรดไฮโดรคลอริก-aminomethane (Tris-HCl ค่า pH 7.4), เอทิลีน 1mM
diamine กรด tetraacetic (EDTA) 320mm น้ำตาลซูโครส , 1mM
dithiothreitol 1? M pepstatin และ 1mM phenylmethanesulfonyl
ฟลูออไร homogenate ถูกหมุนเหวี่ยงที่ 4 ◦Cเป็นเวลา 10 นาที
(10,000 ×กรัม) และจากนั้น 30 นาที (15,000 ×กรัม) ผสมปฏิกิริยาบรรจุ
300 ลิตรของบัฟเฟอร์ปฏิกิริยา (25mm Tris-HCl พีเอช 7.4, 1 M?
adenine dinucleotide Flavin 1 Mflavin mononucleotide, 1mM? -
NADPH แคลเซียมคลอไรด์ 0.6mm, 2mm L-arginine) กับ 100 ลิตร
สารสกัดจาก . หลังจากการบ่มเป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิ 37 ◦Cปฏิกิริยาถูก
หยุดโดยการเพิ่ม 400? L deaerated หยุดบัฟเฟอร์ที่มี 50mm
4- (2-hydroxyethyl) กรด -1-piperazineethanesulfonic (HEPES ค่า pH
5.5) และ EDTA 5mm เนื้อหาถูกกำหนดโดยอพอลโล
1000 วิเคราะห์อนุมูลอิสระพร้อมกับสอบสวน NO (ISONOPF200,
โลกเครื่องมือความแม่นยำ, ประเทศสหรัฐอเมริกา) ปริมาณโปรตีนใน
สารสกัดจากเอนไซม์ที่ถูกกำหนดด้วยวิธีของ Bradford
(1976) โดยใช้ซีรั่มอัลบูมิวัวเป็นมาตรฐาน กิจกรรม NOS ถูก
แสดงเป็น nmolNOmin-1 มิลลิกรัม-1 protein.2.4 ทดสอบกิจกรรม NR
กิจกรรม NR ถูกกำหนดโดยวิธีการแก้ไขเล็กน้อย
ใช้โดยทุ่งหญ้าและคณะ (2004) ตัวอย่างแอปเปิ้ล (1 กรัม) มีพื้นดินที่มี
polyvinylpolypyrrolidone 30mg ในบัฟเฟอร์สารสกัดจาก 1ml (50 มม
ไฮดรอกไซ HEPES โพแทสเซียมพีเอช 7.5, 1 mM dithiothreitol, 1 mM
EDTA และ 7mm cysteine) และ homogenate ถูกหมุนเหวี่ยง
ที่ 4 ◦Cเป็นเวลา 10 นาที (10,000 × กรัม) 300? ลิตรส่วนผสม assayed (50 มม
ไฮดรอกไซ HEPES โพแทสเซียมพีเอช 7.5, 100 M NADH โพแทสเซียม 5mm
ไนเตรต, แมกนีเซียมคลอไรด์ 6mm) ถูกบันทึกอยู่ใน 100 ลิตร
สารสกัดจาก หลังจากการบ่มที่อุณหภูมิ 30 ◦Cเป็นเวลา 30 นาที, ปฏิกิริยาถูก
ยกเลิกโดยการเพิ่ม 400 ลิตร 1: 1 ผสม 1% (w / v) ซัลฟานิลาไมด์
ใน 1.5M HCl และ 0.2% (w / v) n-naphtylethylenediamine
dihydrochloride หลังจากการพัฒนาสีเป็นเวลา 15 นาที, ไนไตรท์
ที่เกิดขึ้นถูกกำหนดโดยการวัด spectrophotometrically
A540.
2.5 ความมุ่งมั่นของ L-Arginine
L-Arginine ถูกสกัดตามที่อธิบายไว้โดย Gao และคณะ (2009) แอปเปิ้ล
ตัวอย่าง (1 กรัม) เป็นพื้นดินใน 2ml 10% กรดไตรคลอโร (w / v)
และสารสกัดจากถูกหมุนเหวี่ยงที่ 4 ◦Cเป็นเวลา 10 นาที (10,000 ×กรัม) .2.6 การกำหนด RSNOs
ตัวอย่างแอปเปิ้ลสดแช่เย็นแช่แข็ง (5 กรัม) และ polyvinylpolypyrrolidone
(50 มก.) ได้รับการพื้นดินที่มีสารสกัดจากบัฟเฟอร์ 5ml (พีบีเอสมีค่า pH = 7.4, 10 mM
N-ethylmaleimide, 2.5mm EDTA) ในที่มืด สารสกัดที่ได้รับการ
หมุนเหวี่ยงที่ 4 ◦Cเป็นเวลา 10 นาที (10,000 ×กรัม) การสลายตัวลดลง
ของ RSNOs การปล่อยตัว NO โดยนอกเหนือจากซัลเฟต 0.1Mcopper,
ต่อมาไม่ถูกกำหนดโดยไม่มีขั้วไฟฟ้าที่มีความอ่อนไหว
(ISO-NOPF200 โลก Precision Instruments) เซ็นเซอร์ไม่ได้รับการ
แช่ใน 10.0 มิลลิลิตร 0.1M คอปเปอร์ซัลเฟต (pH = 4.0) วิธีการแก้ปัญหา
ในปัจจุบันและพื้นหลังกลายเป็นมีเสถียรภาพ ถัดไป 0.1 มลของกลุ่มตัวอย่างที่
ถูกฉีดลงในสารละลายคอปเปอร์ซัลเฟตและการตอบสนอง
ในปัจจุบันได้รับการบันทึกภายในไม่กี่วินาที (Zhang et al., 2000).
จากการสอบเทียบเซ็นเซอร์ใช้ nitrosocysteine ​​เป็นมาตรฐาน
เนื้อหา RSNOs ที่คำนวณได้
2.7 ความมุ่งมั่นของไนไตรท์และไนเตรท
5 กรัมของตัวอย่างแอปเปิ้ลพร้อมกับ polyvinylpolypyrrolidone 50mg,
ทำให้เป็นเนื้อเดียวกันกับ 1ml อิ่มตัวบอแรกซ์และ 5ml ทวีคูณ
น้ำกลั่นและจากนั้นความร้อนเป็นเวลา 15 นาทีในอ่างน้ำเดือด.
หลังจากที่เย็นโพแทสเซียม 2ml ferrocyanide (0.25m) และสังกะสี 2ml
อะซิเตท (1M) ถูกเพิ่ม ส่วนผสมที่ถูกหมุนเหวี่ยงที่ห้อง
อุณหภูมิ 10 นาที (10,000 ×กรัม) ไนไตรท์และไนเตรทความเข้มข้น
ที่ได้รับพร้อมกันโดยใช้การลดลงของไนเตรต
โดยวานาเดียม (III) รวมกับการตรวจสอบโดย Griess เป็นกรด
ปฏิกิริยา (ปรีดาและ Nedospasov, 2005)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2 . วัสดุและวิธีการ
2.1 . วัสดุปลูก
2 พันธุ์แอปเปิ้ล ( 'golden อร่อย ' และ ' ฟูจิ ' รูปที่ 1 ) ซึ่ง
เลือกความสม่ำเสมอของขนาดและไม่มีข้อบกพร่องถูก
เลือกจากอายุ 18 ปี ต้นไม้โต การศึกษาของ
'golden อร่อย " จาก 14 พฤษภาคมถึงวันที่ 10 กันยายน 2552 ที่
33 และ 152 วัน หลังดอกบาน ตามลำดับ
การศึกษาของ ' ฟูจิ ' จาก 14 พฤษภาคมถึงวันที่ 8 ตุลาคม 2552
ที่ 31 และ 178 วัน หลังดอกบาน ตามลำดับ ในช่วง 4 สัปดาห์
ตัวอย่างเร็วระยะการเจริญเติบโตและ
2 หรือ 3 สัปดาห์ที่ระยะการเจริญเติบโตช้า ที่แต่ละคนวันที่ 10
ผลไม้ นำมาวิเคราะห์โครงสร้างไม่ นอกจากนี้
1.5 กก.ผลไม้แช่แข็งในไนโตรเจนเหลวและแอปเปิ้ลได้นำการวิเคราะห์กิจกรรมของเอนไซม์และสาร
.
2.2 . การกำหนดโครงสร้างภายในไม่มีกำหนดไม่มี

ตามขั้นตอนของ leshem et al . ( 1998 ) โดยอพอลโล 1000 อนุมูลอิสระวิเคราะห์
พร้อมกับไม่สอบสวน ( iso-nopf200 โลกความแม่นยำเครื่องมือ
สหรัฐอเมริกา ) หัวทิปถูกแทรกลงในการผ่าตัดด้วย
มีดสับละเอียดและความลึกของการเจาะเข้าไปในผลไม้ เนื้อสด
ประมาณ 3mm . การสอบสวนที่จัดขึ้นในสถานที่จนกว่า steady เซ็นเซอร์อ่าน
ได้หลัง 30 – 150 วินาที ขึ้นอยู่กับน้ำหนักผล อัตราการผลิต
ของภายนอกจะแสดงเป็นไม่ ? H − 1 G − 1 FW .
2.3 l-arginine-dependent NOS NOS กิจกรรมกิจกรรมการทดสอบ
ซีรั่มตามวิธีการอธิบาย
โดย Guo et al . ( 2003 )กับการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย สั้น , ตัวอย่างแอปเปิ้ล
( 1 กรัม ) และ polyvinylpolypyrrolidone ( 50 มิลลิกรัม ) ในบัฟเฟอร์ที่มีการสกัดโฮโม
1ml 50mm ไตร ( ซี )
อะมิโนมีเธนและกรดเกลือ ( HCl ทริส ( pH 7.4 ) , 1mm เอทิลีน Diamine
tetraacetic acid ( EDTA ) , 320mm ซูโครส 1 mm
บัตรแข็ง , 1  M pepstatin และ 1 mm phenylmethanesulfonyl
ฟลูออไรด์โดยแยกเป็นระดับที่ 4 ◦ C นาน 10 นาที ( × 10
กรัม ) และอีก 30 นาที ( × 15 , 000 กรัม ) ผสมปฏิกิริยาที่มีอยู่
300  L ของบัฟเฟอร์ขนาดนอกจากนี้ปฏิกิริยาและ HCl , pH 7.4 1  M
เฟลวินอูไดนิวคลีโอไทด์ 1  mflavin mononucleotide 1mm ,  -
nadph 0.6mm , แคลเซียมคลอไรด์ , 2mm แอลอาร์จินิน ) กับ 100  L
สารสกัด หลังจากบ่มเป็นเวลา 30 นาทีที่ 37 ◦ปฏิกิริยาคือ
Cแวะมาเพิ่ม 400  ผม deaerated หยุดบัฟเฟอร์ที่มี 50mm
4 - ( 2-hydroxyethyl ) - 1-piperazineethanesulfonic acid ( ฮีเปส , pH 5.5 มม.
) และ EDTA ไม่มีเนื้อหาที่ถูกกำหนดโดยอพอลโล
1000 อนุมูลอิสระวิเคราะห์พร้อมกับไม่สอบสวน ( USA isonopf200
โลก , ความแม่นยำเครื่องมือ ) โปรตีนในเอนไซม์สกัด
ถูกกำหนดด้วยวิธี Bradford
( 1976 )การใช้อัลบูมินเป็นมาตรฐาน กิจกรรม NOS เป็น
แสดงเป็น nmolnomin − 1 ต่อมิลลิกรัมโปรตีน− 1 . 2.4 . กิจกรรมทดสอบยาง NR
กิจกรรมถูกกำหนดโดยการแก้ไขเล็กน้อยวิธี
ใช้โดย Lea et al . ( 2004 ) ตัวอย่างแอปเปิ้ล ( 1 กรัม ) มีพื้น
30mg polyvinylpolypyrrolidone ใน 1ml สกัดบัฟเฟอร์ ( 50mm
ฮีเปส ( โพแทสเซียมไฮดรอกไซด์ pH 7.5 , 1mm บัตรแข็ง 1mm และกรดอะมิโน EDTA ,
7 )และแยกเป็นระดับ
ที่ 4 ◦นาน 10 นาที ( × 10 , 000 กรัม ) 300  ลิตรปริมาณส่วนผสม ( 50mm
ฮีเปส ( โพแทสเซียมไฮดรอกไซด์ pH 7.5 , 100  NADH โพแทสเซียมไนเตรต 5 M ,
, 6mm แมกนีเซียมคลอไรด์ ) คือเพิ่ม 100  L
สารสกัด หลังจากบ่มที่อุณหภูมิ 30 ◦ C เป็นเวลา 30 นาที ปฏิกิริยาที่ถูกยกเลิกโดยการเพิ่ม 400 
L 1 : 1 ผสม 1% ( w / v ) sulfanilamide
ใน HCl 1.5 เมตรและ 0.2 % ( w / v )
n-naphtylethylenediamine: . หลังจากการพัฒนาสี 15 นาที , ไนไตรท์
รูปแบบตั้งใจนี้วัด a540
.
2.5 ความมุ่งมั่นของแอลอาร์จีนีน
แอลอาร์จินีนสกัด ตามที่อธิบายไว้โดยเกา et al . ( 2009 ) ตัวอย่างแอปเปิ้ล
( 1 กรัม ) มีพื้นใน 2ml 10% กรดไตรคลอโรอะซิติก ( w / v )
และแยกเป็นระดับที่ 4 ◦ C นาน 10 นาที ( × 10 , 000 กรัม ) 2.6 การกำหนด rsnos
ตัวอย่างแอปเปิ้ลแช่แข็ง ( 5 กรัม ) และ polyvinylpolypyrrolidone
( 50 มก. ) สารสกัดจากดินด้วย กบัฟเฟอร์ ( PBS , pH = 7.4 , 10mm
n-ethylmaleimide 2.5mm , EDTA ) ในที่มืด สารสกัดที่เป็นระดับที่ 4
◦ C นาน 10 นาที ( × 10 , 000 กรัม ) การลดลงของการย่อยสลาย
rsnos ออก ไม่มี โดยการเพิ่ม 0.1mcopper ซัลเฟต ,
ต่อมาไม่ถูกกําหนดโดยไม่มีขั้ว ( iso-nopf200
,เครื่องมือความแม่นยำของโลก ) ไม่มีเซ็นเซอร์ที่ถูกแช่ใน 0.1m
10.0 กรัมคอปเปอร์ซัลเฟต ( pH = 4.0 ) โซลูชั่น
และปัจจุบันพื้นหลังเป็นมั่นคง ต่อไป 0.1 มิลลิลิตรตัวอย่าง
ถูกฉีดเข้าไปในสารละลายคอปเปอร์ซัลเฟตและการตอบสนอง
ปัจจุบันถูกบันทึกไว้ภายในไม่กี่วินาที ( Zhang et al . , 2000 ) .
ตามการสอบเทียบเซนเซอร์ใช้ nitrosocysteine
เป็นมาตรฐานเนื้อหาที่ rsnos คำนวณ .
2.7 . การหาปริมาณไนไตรต์และไนเตรต
5 G ตัวอย่างแอปเปิ้ล พร้อมกับ polyvinylpolypyrrolidone 50 , เป็นโฮโมด้วย
1ml และอิ่มตัว สารบอแรกซ์ กทวีคูณ
น้ำกลั่น แล้วอุ่น 15 นาที ในการต้มน้ำร้อน .
หลังจากเย็น 2ml โพแทสเซียมเฟอร์โรไซยาเนท ( 0.25m ) และสังกะสี ( 1 ) 2ml
อะซิเตตมีการเพิ่ม ส่วนผสมคือระดับที่ห้อง
อุณหภูมิประมาณ 10 นาที ( × 10 , 000 กรัม ) ไนไตรต์และไนเตรตที่ความเข้มข้น
ถูกพร้อมกันได้รับการลดไนเตรท
โดยวาเนเดียม ( III ) รวมกับการตรวจสอบปฏิกิริยา griess
กรด ( beda และ nedospasov , 2005 )