PBMCs are re-suspended in RPMI -10%

PBMCs are re-suspended in RPMI -10% (or RPMI -0 if RPMI -20% was used to prepare the antigen plates) and should not sit for more than one hour at room temperature. Do not place the cells on ice.
5.22.6. Count ≥300 cells for white blood count and ≥100 cells for viability. Adjust PBMC concentration to 1x106 viable cells/mL for dispensing into culture wells. For Pediatric protocols, some wells may be omitted if not enough PBMCs are obtained; follow guidelines in the protocol or the PIIS.
6. ASSAY SETUP
6.1.1. Thaw antigen/mitogen culture plates at 37°C in an incubator. Label the tissue culture plate with patient identification (PID), date plated, date to be pulsed with isotope and harvested.
6.1.2. Dispense 100μL of the PBMC suspension (106 cells/mL or 100,000 cells per well) into culture wells. Be certain to keep cells suspended, by gentle mixing, while the cells are being dispensed. Cells should be dispensed as soon as possible in order to avoid the medium becoming alkaline. This is day 0. It may be necessary to store LPA plates in bags inside the incubator if lack of humidity is a problem.
7. HARVESTING AND COUNTING
7.1. On the morning of day 6, pulse plates with 25μL/well (1μCi/well) of [H3]TdR.
7.2. After six hours, harvest on glass fiber filters using a cell harvester. If the cell harvester is not in a biohazard hood or splashing during harvesting is a concern, then add 25μL/well of a 5% Triton X-100 detergent solution to inactivate HIV. If harvesting can not be done immediately after the six-hour pulse, plates may be stored at –20°C until harvesting. Do not store plates at –20°C for more than a few days. Do not add Triton X-100 to plates prior to freezing because it causes bubbles during thawing.
7.3. After harvesting, filters are allowed to dry at room temperature on the bench top, punched-out into scintillation vials, or the filter sheets are processed for counting in a betaplate counter. Add scintillation fluid to vials/filters and leave filters in scintillation fluid according to the manufacturer’s directions prior to counting. Count vials/filters on a beta scintillation counter at laboratory-determined settings to measure counts per minute (cpm).
8. CALCULATIONS AND REPORTING OF RESULTS
8.1. LPA data can be expressed and calculated in two different ways following determination of mean values (e.g. from triplicates, quadruplicates); both methods make biological sense. Because the stimulation index (SI) is a ratio, it is greatly influenced by biologically insignificant variations in the low cpm levels of background, unstimulated wells.
8.2. SI = (cpm experimental/ cpm background unstimulated)
8.3. Net counts or cpm = (cpm experimental - cpm background unstimulated)
8.4. For multicenter trials, agreement is slightly better if the SI calculation is used, since the efficiency of counting of different scintillation counters varies. Raw data (cpm) from each culture well shall be entered electronically onto Excel®-based

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

PBMCs จะมาแขวนลอยใน RPMI -10% (หรือ RPMI -0 ถ้า RPMI% -20 ถูกนำมาใช้เพื่อเตรียมความพร้อมแผ่นแอนติเจน) และไม่ควรนั่งเป็นเวลานานกว่าหนึ่งชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง อย่าวางเซลล์บนน้ำแข็ง.
5.22.6 นับ≥ 300 เซลล์เม็ดเลือดขาวและ≥ 100 เซลล์มีชีวิต ปรับความเข้มข้น PBMC เพื่อ 1x106 เซลล์ที่มีชีวิต / ml สำหรับจ่ายเข้ากับวัฒนธรรมหลุม สำหรับโปรโตคอลเด็ก,หลุมบางคนอาจจะมองข้ามถ้าไม่ PBMCs พอที่จะได้รับ; ปฏิบัติตามแนวทางในโปรโตคอลหรือ piis
6. การติดตั้งทดสอบ
6.1.1 แอนติเจนที่ละลาย / แผ่นวัฒนธรรม mitogen ที่ 37 ° C ในศูนย์บ่มเพาะ ป้ายจานเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อที่มีการระบุผู้ป่วย (PID), วันที่, วันที่ชุบจะชีพจรกับไอโซโทปและเก็บเกี่ยว.
6.1.2 แจกจ่าย100μlระงับ PBMC (106 เซลล์ / มล. หรือ 100,000 เซลล์ต่อกัน) เข้ากับวัฒนธรรมหลุม จะมีบางอย่างที่จะทำให้เซลล์ที่ถูกระงับโดยอ่อนโยนผสมในขณะที่เซลล์มีการจ่าย เซลล์ที่ควรจะจ่ายเร็วที่สุดเท่าที่เป็นไปได้เพื่อหลีกเลี่ยงการขนาดกลางกลายเป็นอัลคาไลน์ นี้เป็นวันที่ 0 มันอาจจะเป็นสิ่งที่จำเป็นในการจัดเก็บแผ่น LPA ในถุงภายในศูนย์บ่มเพาะถ้าขาดความชื้นเป็นปัญหา.
7 การเก็บเกี่ยวและการนับ
7.1 ในตอนเช้าของวันที่ 6,แผ่นชีพจรกับ25μl/well (1μci/well) ของ [h3] TDR.
7.2 หกชั่วโมงหลังจากการเก็บเกี่ยวบนตัวกรองใยแก้วโดยใช้เซลล์เก็บเกี่ยว ถ้าเซลล์เก็บเกี่ยวไม่ได้อยู่ในเครื่องดูดควันปลอดเชื้อหรือกระเด็นระหว่างการเก็บเกี่ยวเป็นกังวลแล้วเพิ่ม25μl/wellจาก 5% Triton X-100 สารละลายผงซักฟอกเพื่อยับยั้งเอชไอวี ถ้าเก็บเกี่ยวไม่สามารถทำได้ทันทีหลังจากที่ชีพจรหกชั่วโมง,แผ่นอาจถูกเก็บไว้ที่อุณหภูมิ -20 ° C จนถึงการเก็บเกี่ยว จะไม่เก็บจานที่อุณหภูมิ -20 ° C นานกว่าไม่กี่วัน ไม่ได้เพิ่ม Triton X-100 แผ่นก่อนที่จะแช่แข็งเพราะมันทำให้เกิดฟองอากาศในระหว่างการละลาย.
7.3 หลังจากการเก็บเกี่ยวตัวกรองจะได้รับอนุญาตให้แห้งที่อุณหภูมิห้องบนม้านั่งเจาะออกไปในขวดประกายหรือแผ่นกรองมีการประมวลผลสำหรับการนับในเคาน์เตอร์ betaplateเพิ่มประกายให้กับของเหลวขวด / ตัวกรองและตัวกรองออกจากของเหลวในประกายไปตามทิศทางของผู้ผลิตก่อนที่จะมีการนับ นับขวด / ตัวกรองบน​​เคาน์เตอร์ประกายเบต้าที่การตั้งค่าห้องปฏิบัติการมุ่งมั่นที่จะวัดการนับต่อนาที (CPM).
8 การคำนวณและการรายงานผลการ
8.1ข้อมูล LPA สามารถแสดงและคำนวณในสองวิธีที่แตกต่างกันไปตามความมุ่งมั่นของค่าเฉลี่ย (เช่นจาก triplicates, quadruplicates); ทั้งสองวิธีให้ความรู้สึกทางชีวภาพ เนื่องจากดัชนีการกระตุ้น (Si) คืออัตราส่วนมันได้รับอิทธิพลอย่างมากโดยการเปลี่ยนแปลงที่ไม่มีนัยสำคัญทางชีวภาพในระดับ CPM ต่ำของพื้นหลังหลุม unstimulated.
8.2si = (CPM พื้นหลังการทดลอง / CPM unstimulated)
8.3 นับสุทธิหรือ CPM = (CPM ทดลอง - พื้นหลังแผ่น unstimulated)
8.4 สำหรับการทดลองแบบ multicenter ข้อตกลงเล็กน้อยดีกว่าถ้าคำนวณ si ถูกนำมาใช้เนื่องจากประสิทธิภาพของการนับเคาน์เตอร์ประกายที่แตกต่างกันแตกต่างกันไป ข้อมูลดิบ (CPM) จากการเพาะเลี้ยงกันเป็นอย่างดีจะถูกป้อนเข้าสู่ระบบอิเล็กทรอนิกส์ Excel ®ตาม

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

PBMCs เลื่อนออกไปอีกใน RPMI -10% (หรือ RPMI-0 ถ้า RPMI -20% ใช้ในการเตรียมแผ่นตรวจหา) และไม่ควรนั่งมากกว่าหนึ่งชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง วางเซลล์บน ice.
5.22.6 นับจำนวนเซลล์ ≥300 สำหรับตรวจนับเม็ดเลือดขาวและเซลล์ ≥100 ชีวิต ปรับปรุงเข้มข้น PBMC กับ 1 x 106 ได้ เซลล์/mL สำหรับมหาศาลเป็นวัฒนธรรมบ่อ สำหรับโพรโทคอเด็ก อาจละเว้นบางบ่อถ้า ไม่ PBMCs พอจะได้ รับ ทำตามคำแนะนำในโพรโทคอลหรือ PIIS.
6 ติดตั้งทดสอบ
6.1.1 ทรานตรวจ หา/mitogen วัฒนธรรมแผ่นที่ 37° C ในการบ่มเพาะวิสาหกิจ ป้ายชื่อแผ่นเนื้อเยื่อที่ มีรหัสผู้ป่วย (PID), วันชุบ วันสูง ด้วยไอโซโทป และเก็บเกี่ยว
6.1.2 ป้ายสินค้า 100μL ระงับ PBMC (106 เซลล์/มล.หรือ 100เซลล์ 000 ต่อดี) เป็นวัฒนธรรมบ่อ ได้กำหนดให้เซลล์หยุดชั่วคราว โดยผสมอ่อนโยน ในขณะที่เซลล์มีการคำ เซลล์ควรคำโดยเร็วที่สุดเพื่อหลีกเลี่ยงสื่อที่เป็นด่าง นี่คือวัน 0 อาจจำเป็นต้องเก็บแผ่น LPA ในถุงในการบ่มเพาะวิสาหกิจถ้าขาดความชื้นนั้นเป็นปัญหา
7 เก็บเกี่ยวและการนับ
7.1 ในเช้าของวันที่ 6 หมุนแผ่น ด้วย 25μL/ดี (ดี 1μCi) ของ [H3] TdR
7.2 หลังจาก 6 ชั่วโมง เก็บเกี่ยวบนตัวกรองใยแก้วที่ใช้เก็บเกี่ยวเซลล์ที่ ถ้าเก็บเกี่ยวเซลล์ไม่ฮูด biohazard หรือเล่นในระหว่างการเก็บเกี่ยวเป็นกังวล เพิ่ม 25μL/ดี ของโซลูชันผงซักฟอกไตรตั้น X 100 5% จะยกเอชไอวี ถ้าเก็บเกี่ยวไม่สามารถทำได้ทันทีหลังจากหกชั่วโมงชีพจร อาจจัดเก็บแผ่นที่ทนต่อ° C จนถึงเก็บเกี่ยว เก็บแผ่นที่ทนต่อ° C มากกว่าไม่กี่วัน อย่าเพิ่มไตรตั้น X 100 แผ่นก่อนแช่แข็ง เพราะจะเกิดฟองอากาศระหว่าง thawing.
7.3 หลังจากการเก็บเกี่ยว ตัวกรองได้รับอนุญาตให้แห้งที่อุณหภูมิห้องอยู่ด้านบนม้านั่ง เจาะรูออกเป็น scintillation vials หรือแผ่นกรองประมวลผลสำหรับการตรวจนับในเคาน์เตอร์ betaplate เพิ่มน้ำมัน scintillation vials/กรอง และปล่อยให้ตัวกรองใน scintillation น้ำมันตามคำแนะนำของผู้ผลิตก่อนนับ นับ vials/กรอง บนเคาน์เตอร์ scintillation เบต้าที่ห้องปฏิบัติกำหนดค่าการวัดนับต่อนาที (cpm) .
8 การคำนวณและการรายงานผล
8.1 LPA ข้อมูลสามารถแสดง และคำนวณสองวิธีต่อไปนี้กำหนดค่าเฉลี่ย (จาก triplicates, quadruplicates); ทั้งสองวิธีทำให้ความรู้สึกทางชีวภาพ เพราะกระตุ้นดัชนี (SI) เป็นอัตราส่วน มันได้รับอิทธิพลมากจากรูปชิ้นสำคัญของพื้นหลังระดับต่ำ cpm, unstimulated บ่อ
8.2 SI = (cpm ทดลอง / cpm พื้นหลัง unstimulated)
8.3 จำนวนสุทธิหรือ cpm (cpm ทดลอง - unstimulated พื้นหลังหน้า/นาที) =
8.4 สำหรับทดลอง multicenter ตกลงจะดีกว่าเล็กน้อยถ้าคำนวณ SI ใช้ เนื่องจากประสิทธิภาพของการนับเคาน์เตอร์ scintillation ต่าง ๆ แตกต่างกันไป ข้อมูลดิบ (cpm) จากแต่ละวัฒนธรรมด้วยจะเป็นอิเล็กทรอนิกส์ไปใช้ Excel

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

pbmcs อีกครั้งมี - ถูกระงับชั่วคราวใน rpmi 10% (หรือ rpmi -0 หาก rpmi 20% ใช้ในการเตรียมแผ่นความร้อน, Antigen for )และไม่ควรนั่งมากกว่าหนึ่งชั่วโมงที่ อุณหภูมิ ห้อง ไม่ควรวางเซลล์ที่อยู่บนน้ำแข็ง.
5.22.6 นับถอยหลัง≥ 300 เซลล์สำหรับจำนวนเลือดสีขาวและกำหนด≥ 100 เซลล์เพื่อความอยู่รอด การปรับความเข้มข้น pbmc ถึง 1 x 106 เซลล์ได้/ ML สำหรับให้ความชุ่มชื้นในบ่อวัฒนธรรม สำหรับโปรโตคอลสำหรับเด็กบ่อบางอย่างอาจต้องถูกตัดออกไปหากไม่ pbmcs มากพอได้รับทำตามคำแนะนำในโปรโตคอลหรือ piis ที่. N 6 พยายามตั้งค่า
6.1.1 . แผ่นทำความร้อนวัฒนธรรม mitogen , Antigen for /ละลายน้ำแข็งใน C 37 °ในกระบวนการบ่มเพาะได้. ป้ายกำกับแผ่นวัฒนธรรมเนื้อเยื่อที่มีการระบุผู้ป่วย(โพรเซส)วันที่เคลือบทองวันที่จะเสียทีเดียวด้วยไอโซโทปและเก็บเกี่ยว.
6.1.2 . ทำน้ำบริสุทธิ์ 100 มล. pbmc μl ของระบบกันสะเทือนแบบ( 106 เซลล์/หรือ 100000 เซลล์ต่อได้ดี)เข้าไปในบ่อวัฒนธรรม. ให้แน่ใจว่าได้ทำให้เซลล์ถูกระงับไว้โดยการผสมแบบนุ่มนวลในขณะที่เซลล์ที่มีการทำน้ำบริสุทธิ์ เซลล์จะทำน้ำบริสุทธิ์ในทันทีเป็นไปได้ในการสั่งซื้อเพื่อหลีกเลี่ยงการอัลตราอัลคาไลน์จะกลายเป็นขนาดกลาง โรงแรมแห่งนี้คือวัน 0 คุณอาจจำเป็นต้องจัดเก็บแผ่นความร้อน lpa ในกระเป๋าด้านในเครื่องฟักไข่หากขาดความชื้นเป็นปัญหาที่. N 7 การเก็บเกี่ยวผลผลิตการนับและ
7.1 . ในช่วงเช้าของวันที่ 6แผ่นทำความร้อนระดับพร้อมปุ่ม Pulse (ปั่นชั่วขณะ)พร้อมด้วย 25 μl /ได้ดี( 1 μci /ดี)ของ[ H 3 ] tdr .
7.2 . หลังจากหกชั่วโมงการเก็บเกี่ยวในไฟเบอร์แบบแก้วฟิลเตอร์ที่ใช้ Harvester เซลล์ที่ หาก Harvester เซลล์ที่ไม่ได้อยู่ในฝาครอบ biohazard หรือเปียกปอนในระหว่างการเก็บเกี่ยวผลผลิตเป็นสิ่งสำคัญแล้วเพิ่ม 25 μl /ดีของโซลูชัน X - 100 ทำความสะอาด Triton 5% เพื่อ inactivate ผู้ติดเชื้อเอชไอวี หากการเก็บเกี่ยวผลผลิตจะไม่สามารถทำได้ในทันทีหลังจาก 6 ระดับพร้อมปุ่ม Pulse (ปั่นชั่วขณะ) - ชั่วโมงแผ่นทำความร้อนอาจได้รับการจัดเก็บที่ 20 °จนกว่าการเก็บเกี่ยวผลผลิต ไม่จัดเก็บแผ่นความร้อนที่ 20 ° C สำหรับมากกว่าสองถึงสามวันที่ ไม่ต้องเพิ่ม Triton X - 100 แผ่นความร้อนก่อนที่จะแช่แข็งเพราะมันจะทำให้ฟองอากาศในระหว่างละลาย.
7.3 หลังจากการเก็บเกี่ยวผลผลิตแผ่นกรองจะได้รับอนุญาตให้แห้งที่ อุณหภูมิ ห้องที่ด้านบนม้านั่งยาวที่ชก - ออกไปใน vials scintillation หรือแผ่นกรองจะได้รับการประมวลผลสำหรับการนับคะแนนในเคาน์เตอร์ betaplate ที่เพิ่มฟิลเตอร์น้ำยา vials / scintillation และปล่อยให้แผ่นกรองใน scintillation น้ำยาตามไปในทิศทางของผู้ผลิตก่อนที่จะทำการนับคะแนน นับถอยหลัง vials /แผ่นกรองบนเคาน์เตอร์ scintillation Beta ที่การตั้งค่าตรวจทางห้องปฏิบัติการ - กำหนดในการวัดนับถอยหลังต่อนาที(นำ). N 8 การคำนวณขนาดของแหล่งจ่ายไฟและการรายงานผลการ
8.1 .ข้อมูล lpa สามารถได้รับการแสดงออกและคำนวณได้ในสองลักษณะที่ต่างกันต่อไปนี้:การกำหนดค่าหมายถึง(เช่นจาก quadruplicates triplicates )ทั้งสองวิธีทำให้เกิดความรู้สึกทางชีววิทยา เพราะดัชนีกระตุ้น(ศรี)เป็นอัตราที่จะได้รับอิทธิพลจากความแตกต่างของไม่มีความหมายทางชีววิทยาในระดับต่ำที่นำของบ่อ unstimulated พื้นหลัง.
8.2 เป็นอย่างมากศรี=( unstimulated พื้นหลังนำ/ทดลองนำ)
8.3 นำหรือนับถอยหลังสุทธิ=( unstimulated พื้นหลังทดลองนำ - นำ)
8.4 สำหรับผลการทดลองใช้งานข้อตกลงเป็นดีกว่าเล็กน้อยหากคำนวณศรีที่มี ประสิทธิภาพ ที่ใช้มาตั้งแต่การนับของเคาน์เตอร์ scintillation แตกต่างกันจะแตกต่างกันไป ข้อมูลดิบ(นำ)จากวัฒนธรรมแต่ละรายรวมถึงจะต้องเข้าไปด้วยวิธีการทางอิเล็กทรอนิกส์ลงบน Excel ®