take of the animals were monitored

take of the animals were monitored daily (Table 1). DM, Se and
vitamin E quantities ingested by adult rats were calculated respectively
from water and food consumed.
The animals of the different groups were killed, at the end of
treatments, by cervical decapitation to avoid stress. The brain tissue
was immediately removed and dissected over ice-cold glass
slides and cerebral cortex region was collected and homogenized
(10% w/v) separately with an Ultra Turrax homogeniser in ice-cold,
1.15% KCl–0.01 M sodium, potassium phosphate buffer
(1 M:K2HPO4; 1 M:KH2PO4, pH 7.4). Homogenates were centrifuged
at 10,000g for 20 min at 4 C. The resulting supernatants
were used for immediate lipid peroxidation and protein oxidation
assays. Homogenate aliquots were stored at 80 C for further biochemical
assays. Other cerebral cortex tissue, extracted from the
control and treated rats was fixed in 10% buffered formalin and
was processed for paraffin sectioning for histological studies.
2.3. Biochemical estimations
2.3.1. Protein quantification
Cerebral cortex protein contents were measured according to
the method of Lowry et al. [29] using bovine serum albumin as
standard.
2.3.2. Malondialdehyde (MDA) measurement
The cerebral cortex malondialdehyde concentrations, index of
lipid peroxidation, were determined spectrophotometrically
according to Draper and Hadley [30]. Briefly, an aliquot of cerebral
cortex extract supernatant was mixed with 1 ml of 5% trichloroacetic
acid and centrifuged at 2500g for 10 min. An amount of 1 ml of
thiobarbituric acid reagent (0.67%) was added to 500 ll of supernatant
and heated at 90 C for 15 min. The mixture was then cooled
and measured for absorbance at 532 nm using a spectrophotometer
(Jenway UV-6305, Essex, England). The malondialdehyde values
were calculated using 1,1,3,3-tetraethoxypropane as standard and
expressed as nmoles of malondialdehyde/g of tissue.
2.3.3. Determination of cerebral cortex advanced oxidation protein
products levels
Advanced oxidation protein products (AOPP) levels were determined
according to the method of Kayali et al. [31]. Briefly, 0.4 ml
of cerebral cortex extract was treated with 0.8 ml phosphate buffer
(0.1 M; pH 7.4). After 2 min, 0.1 ml of 1.16 M potassium iodide (KI)
was added to the tube followed by 0.2 ml of acetic acid. The absorbance
of the reaction mixture was immediately recorded at
340 nm. The concentration of AOPP for each sample was calculated
using the extinction coefficient of 261 cm1 mM1 and the results
were expressed as lmol/mg protein.
2.3.4. Determination of cerebral cortex protein carbonyl content
Protein carbonyls (PCO) were measured using the method of
Reznick and Packer [32]. Briefly, 100 ll of cerebral cortex extract
supernatant were placed in glass tubes. Then 500 ll of 10 mM
2,4-dinitrophenylhydrazine (DNPH) in 2 N HCl were added. Tubes
were incubated for 1 h at room temperature. Samples were vortexed
every 15 min. Then 500 ll TCA (20%) were added and the
tubes were left on ice for 5 min followed by centrifugation for
10 min. The protein precipitates were collected. The pellet was
then washed twice with ethanol–ethyl acetate (v/v). The final precipitate
was dissolved in 600 ll of 6 M guanidine hydrochloride
solution and incubated for 15 min at 37 C. The absorbance of the
sample was measured at 370 nm. The carbonyl content was calculated
based on the molar extinction coefficient of DNPH
(e = 2.2 104 cm1 M1
) and expressed as lmol/mg protein.
2.3.5. Na+
K+
-ATPase assay
Activity of Na+
K+
-ATPase in the cerebral cortex was determined
using the method of Kawamoto et al. [33]. Total ATPase activity
was determined by Pi assay released from hydrolyzed ATP forming
a complex with molybdate. The reaction was initiated by adding
40 ll of homogenate (suspended in Tris–HCl buffer, pH 7.4) to
200 ll ATPase buffer containing (in mM): 3 ATP, 120 NaCl, 2 KCl,
3 MgCl2, and 30 histidine (pH 7.2), with and without ouabain
(3 mM). ATPase activity was measured after 60 min of incubation
at 37 C. Reaction was achieved by the addition of a quenching
solution (0.6 ml) containing 1 N H2SO4 and 0.5% ammonium
molybdate. The formation of a phosphomolybdate complex was
determined spectrophotometrically at 700 nm. A standard curve
was run using H2PO4. Na+
,K+
-ATPase activity was measured as
the difference between ouabain-treated and ouabain-untreated
samples. Enzyme activity was expressed as lmol Pi liberated/h/g
tissue.
2.3.6. Determination of cerebral cortex antioxidant enzyme activities
Catalase (CAT) activity was assayed by the method of Aebi [34].
Enzymatic reaction was initiated by adding an aliquot of 20 ll of
the homogenized tissue and the substrate (H2O2) to a concentration
of 0.5 M in a medium containing 100 mM phosphate buffer
(pH 7.4). Changes in absorbance were recorded at 240 nm. CAT
activity was calculated in terms of lmol H2O2 consumed/min/mg
of protein.
Superoxide dismutase (SOD) activity was estimated according to
Beauchamp and Fridovich [35]. The reaction mixture contained
50 mM of tissue homogenates in potassium phosphate buffer (pH
7.8), 0.1 mM EDTA, 13 mM L-methionine, 2 lM riboflavin and
75 mM nitro blue tetrazolium (NBT). The developed blue colour
in the reaction was measured at 560 nm. Units of SOD activity
were expressed as the amount of enzyme required to inhibit the
reduction of NBT by 50% and the activity was expressed as units/
mg of protein.
Glutathione peroxidase (GPx) activity was measured according to
Flohe and Gunzler [36]. GPx catalyzes the oxidation of reduced glutathione
by cumene hydroperoxide. In the presence of reduced glutathione
reductase and nicotinamide adenine dinucleotide
phosphate reduced form (NADPH), the oxidized reduced glutathione
is immediately converted to the reduced form with a concomitant
oxidation of NADPH–NADP+
. The decrease in absorbance at
340 nm was measured. The enzyme activity was expressed as
nmole of GSH oxidized/min/mg protein.
2.3.7. Cerebral cortex glutathione levels
Glutathione (GSH) in the cerebral cortex was determined by the
method of Ellman [37] modified by Jollow et al. [38]. The method is
based on the development of a yellow colour when DTNB (5,5-
dithiobtis-2 nitro benzoic acid) is added to compounds containing
sulfhydryl groups. Five hundred microlitres of tissue homogenate
in phosphate buffer were added to 3 ml of 4% sulfosalicylic acid.
The mixture was centrifuged at 1600g for 15 min. Five hundred
millilitres of supernatants were taken and added to Ellman’s reagent.
The absorbance was measured at 412 nm after 10 min. Total
GSH content was expressed as lg/g of tissue.
2.3.8. Hydrophilic antioxidants
Ascorbic acid (vitamin C) determination was performed as described
by Jacques-Silva et al. [39]. Protein in cerebral cortex
homogenate extract was precipitated in 10 volumes of a cold 4%
trichloroacetic acid solution. An aliquot of sample (300 lL) was adjusted
with H2O to a final volume of 1 mL and incubated at 38 C
for 3 h, then 1 mL of H2SO4 65% (v/v) was added to the medium.
The reaction product was determined using color reagent containI.
Ben Amara et al. / Pesticide Biochemistry and Physiology 101 (2011) 165–174 167
ing 4.5 mg/Ml dinitrophenyl hydrazine and CuSO4 (0.075 mg/mL).
The data were expressed as lmol ascorbic acid/g tissue.
2.3.9. Cerebral cortex non-protein thiols levels
Cerebral cortex non-protein thiols (NPSH) levels were determined
by the method of Ellman [37]. A 500 ll aliquot of supernatant
was mixed with 10% trichloroacetic acid (1 V/1 V). After
centrifugation, the protein pellet was discarded and free-SH groups
were determined in a clear supernatant. A 100 ll aliquot of supernatant
was added to 850 ll of 1 M potassium phosphate buffer (pH
7.4) and to 50 ll of DTNB (10 mM) 5,5-dithio-bis (2-nitrobenzoic
acid). Absorbance of colorimetric reaction was measured at
412 nm. Total NPSH content was expressed as lmol/g of tissue.
2.3.10. Determination of acetylcholinesterase activity in cerebral
cortex
Acetylcholinesterase (AChE) activity was measured immediately
in homogenates according to the method of Ellman et al.
[40], using acetylthiocholine iodide as a substrate. The reaction
mixture was composed as follows: phosphate buffer (0.1 M; pH
8) and 0.01 M DTNB. The hydrolysis rate of acetylthiocholine iodide
is measured at 412 nm through the release of the thiol compound
which, when reacted with DTNB, produced the colourforming
compound TNB. The reaction was initiated by adding
0.075 M acetylthiocholine iodide. Activities were expressed as
micromole of substrate/min/mg protein.
2.3.11. Butyrylcholinesterase (BuChE) activity in cerebral cortex
Butyrylcholinesterase activity was determined by the method
of Ellman et al. [40] with some modifications. Hydrolysis rate
was measured at acetylthiocholine concentrations of 0.8 mM in
1 mL assay solutions with 100 mM phosphate buffer, pH 7.5, and
1.0 mM DTNB. Fifty microliters of cerebral cortex supernatant
was added to the reaction mixture and preincubated for 3 min.
The hydrolysis was monitored by formation of the thiolate dianion
of DTNB at 412 nm for 2–3 min (intervals of 30 s) at 25 C. All samples
were run in duplicate.
2.4. Histological studies
Some cerebral cortex samples, intended for histological examination
by light microscopy, were immediately fixed in 10% of formalin
and processed in a series of graded ethanol solutions. They
were then embedded in paraffin, serially sectioned at 3 lm and
stained with hematoxylin–eosin. Six slides were prepared from
each cerebral cortex. All sections were evaluated for the degree
of cerebral cortex injury.
2.5. Statistical analysis
The data were analyzed using the statistical package program
Stat view 5 Software for Windows (SAS Institute, Berkley, CA). Statistical
analysis was performed using one-way Analysis of Variance
(ANOVA) followed by Fisher’s Protected Least Significant Difference
(PLSD) test as a post hoc test for comparison between groups.
All values were expressed as means

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

นำสัตว์ถูกตรวจสอบทุกวัน (ตารางที่ 1) DM, Se และมีคำนวณปริมาณวิตามินที่กิน โดยหนูผู้ใหญ่ตามลำดับจากน้ำและอาหารการบริโภคสัตว์ในกลุ่มอื่นถูกฆ่าตาย จบรักษา โดย decapitation ปากมดลูกเพื่อหลีกเลี่ยงความเครียด เนื้อเยื่อสมองเอาออกทันที และ dissected ผ่านแก้วฉ่ำภาพนิ่งและคอร์เทกซ์ cerebral ภูมิภาคถูกรวบรวม และ homogenized เป็นกลุ่ม(10% w/v) แยกต่างหากกับการ homogeniser Ultra Turrax ในฉ่ำ1.15% kCl – 0.01 M โซเดียม โพแทสเซียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์(1 M:K2HPO4, M:KH2PO4 1, pH 7.4) Homogenates ถูก centrifugedที่ 10000 g สำหรับ 20 นาทีที่ 4 ค Supernatants ได้ใช้สำหรับการออกซิเดชัน peroxidation และโปรตีนไขมันทันทีassays Homogenate aliquots ถูกเก็บไว้ที่ 80 C สำหรับชีวเคมีเพิ่มเติมassays อื่น ๆ เนื้อเยื่อคอร์เทกซ์ cerebral สกัดจากการกำหนดควบคุมและบำบัดหนูใน 10% buffered formalin และมีการประมวลผลสำหรับพาราฟิน sectioning ศึกษาสรีรวิทยา2.3. ประมาณชีวเคมี2.3.1. โปรตีนนับเนื้อหาคอร์เทกซ์ cerebral โปรตีนได้วัดตามวิธีการของ Lowry et al. [29] โดยใช้วัว serum albumin เป็นมาตรฐาน2.3.2. Malondialdehyde (MDA) วัดในคอร์เทกซ์ cerebral malondialdehyde ความเข้มข้น ดัชนีของperoxidation ของไขมัน กำหนด spectrophotometricallyตาม Draper และ Hadley [30] สั้น ๆ เป็นส่วนลงตัวของสมองsupernatant แยกคอร์เทกซ์ถูกผสมกับ 1 มล.ของ 5% trichloroaceticกรด และ centrifuged ที่ 2500g สำหรับ 10 นาที จำนวน 1 ml ของรีเอเจนต์กรด thiobarbituric (0.67%) ถูกเพิ่ม 500 จะของ supernatantและอุ่นที่ 90 C สำหรับ 15 นาที มีการระบายความร้อนด้วยส่วนผสมจากนั้นและวัด absorbance ที่ 532 nm ใช้เป็นเครื่องทดสอบกรดด่าง(Jenway UV-6305 เอสเซ็กซ์ อังกฤษ) ค่า malondialdehydeคำนวณได้โดยใช้ 1,1,3,3 tetraethoxypropane เป็นมาตรฐาน และแสดงเป็น nmoles malondialdehyde/กรัม ของเนื้อเยื่อ2.3.3 การกำหนดของคอร์เทกซ์ cerebral ขั้นสูงโปรตีนเกิดออกซิเดชันผลิตภัณฑ์ระดับระดับผลิตภัณฑ์ (AOPP) ของโปรตีนเกิดออกซิเดชันขั้นสูงที่กำหนดตามวิธีของ Kayali et al. [31] สั้น ๆ 0.4 mlของคอร์เทกซ์ cerebral สารสกัดได้รับบัฟเฟอร์ฟอสเฟต 0.8 ml(0.1 M; pH 7.4) หลังจาก 2 นาที 0.1 ml ของ 1.16 M โพแทสเซียมไอโอไดด์ (KI)มีเพิ่มการท่อตาม 0.2 มิลลิลิตรของกรดน้ำส้ม Absorbance ที่ของปฏิกิริยา ผสมทันทีบันทึกที่340 nm คำนวณความเข้มข้นของ AOPP สำหรับแต่ละตัวอย่างโดยใช้ค่าสัมประสิทธิ์การสูญพันธุ์ของ mM1 261 cm1 และผลลัพธ์ถูกแสดงเป็น lmol/มิลลิกรัม โปรตีน2.3.4 การกำหนดของคอร์เทกซ์ cerebral carbonyl โปรตีนโปรตีน carbonyls (PCO) ถูกวัดโดยใช้วิธีการReznick และห่อของ [32] สั้น ๆ 100 แยกจะคอร์เทกซ์ cerebralsupernatant ถูกเก็บไว้ในหลอดแก้ว แล้ว 500 จะ 10 มม.มีเพิ่ม 2, 4-dinitrophenylhydrazine (DNPH) ใน 2 N HCl หลอดมี incubated สำหรับ h 1 ที่อุณหภูมิห้อง ตัวอย่าง vortexedทุก 15 นาที 500 แล้วเพิ่มจะ TCA (20%) และหลอดถูกทิ้งน้ำแข็ง 5 นาทีตาม ด้วย centrifugation สำหรับ10 นาที Precipitates โปรตีนถูกเก็บรวบรวม เม็ดถูกแล้ว ล้างสองครั้ง ด้วยเอทานอลเอทิล acetate (v/v) Precipitate ขั้นสุดท้ายถูกละลายใน 600 จะไฮโดรคลอไรด์ guanidine 6 Mโซลูชัน และ incubated สำหรับ 15 นาทีที่ 37 เซลเซียส Absorbance ของตัวอย่างที่วัดที่ 370 nm คำนวณเนื้อหา carbonylขึ้นอยู่กับค่าสัมประสิทธิ์สบดับของ DNPH(e = 2.2 104 cm1 M1) และแสดงเป็น lmol/มิลลิกรัม โปรตีน2.3.5. Na +K +-ทดสอบ ATPaseกิจกรรมของ Na +K +-กำหนด ATPase ในคอร์เทกซ์ cerebralโดยใช้วิธีของ Kawamoto et al. [33] รวมกิจกรรม ATPaseกำหนด โดยวิเคราะห์ปี่ออกจาก ATP hydrolyzed ขึ้นรูปซับซ้อน ด้วย molybdate เริ่มปฏิกิริยา โดยเพิ่ม40 จะ homogenate (หยุดชั่วคราวในบัฟเฟอร์ตรี – HCl, pH 7.4) เพื่อ200 จะ ATPase บัฟเฟอร์ที่ประกอบด้วย (ใน mM): 3 ATP, 120 NaCl, 2 KCl3 MgCl2 และ 30 histidine (pH 7.2), มี และไม่ มี ouabain(3 มม) กิจกรรม ATPase ที่วัดหลังจาก 60 นาทีของคณะทันตแพทยศาสตร์ที่ 37 เซลเซียสปฏิกิริยาสำเร็จ โดยการเพิ่มการชุบโซลูชัน (0.6 มิลลิลิตร) ประกอบด้วยแอมโมเนีย N กำมะถันและ 0.5% 1molybdate การก่อตัวของ phosphomolybdate ที่ซับซ้อนได้กำหนด spectrophotometrically ที่ 700 nm เส้นโค้งมาตรฐานถูกเรียกใช้ H2PO4 Na +, K +-กิจกรรม ATPase ที่วัดเป็นความแตกต่าง ระหว่าง ouabain ถือว่าไม่ถูก รักษา ouabainตัวอย่างการ เอนไซม์ถูกแสดงเป็น lmol ปี่ liberated/h/gเนื้อเยื่อ2.3.6 การกำหนดกิจกรรมของเอนไซม์สารต้านอนุมูลอิสระคอร์เทกซ์ cerebralกิจกรรม catalase (แมว) ถูก assayed โดยวิธีการ Aebi [34]เริ่มปฏิกิริยาเอนไซม์ในระบบ โดยการเพิ่มส่วนลงตัวที่ 20 จะของhomogenized เป็นกลุ่มเนื้อเยื่อและพื้นผิว (H2O2) ให้เข้มข้นของสื่อที่ประกอบด้วยบัฟเฟอร์ฟอสเฟต 100 มม. 0.5 M(pH 7.4) บันทึกการเปลี่ยนแปลง absorbance ที่ 240 nm แมวมีคำนวณกิจกรรมใน lmol H2O2 ใช้/นาที/มิลลิกรัมของโปรตีนซูเปอร์ออกไซด์ dismutase (SOD) กิจกรรมที่ประเมินตามBeauchamp และ Fridovich [35] ส่วนผสมของปฏิกิริยาที่มีอยู่50 มม.ของ homogenates เนื้อเยื่อในโพแทสเซียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (pH7.8), 0.1 mM EDTA, 13 mM L methionine, lM 2 วิตามิน และมม. 75 บลูไนโตร tetrazolium (เอ็นบีที) สีฟ้าพัฒนาในปฏิกิริยาที่ถูกวัดที่ 560 nm หน่วยของกิจกรรมสดถูกแสดงเป็นจำนวนของเอนไซม์ที่จำเป็นในการยับยั้งการลดลงของเอ็นบีที 50% และกิจกรรมที่ได้แสดงเป็นหน่วย /มก.โปรตีนกิจกรรม peroxidase (GPx) กลูตาไธโอนถูกวัดตามFlohe และ Gunzler [36] GPx catalyzes ออกซิเดชันของกลูตาไธโอนลดลงโดย cumene hydroperoxide หน้าลดกลูตาไธโอนreductase และ nicotinamide adenine dinucleotideฟอสเฟตลดลงแบบฟอร์ม (NADPH), กลูตาไธโอนลดลงการตกแต่งจะถูกแปลงเป็นฟอร์มที่ลดลงมีความมั่นใจทันทีออกซิเดชันของ NADPH – NADP +. Absorbance ที่ลดลง340 nm ที่วัด เอนไซม์จะถูกแสดงเป็นnmole GSH ออกซิไดซ์/นาที/มิลลิกรัมโปรตีน2.3.7 การคอร์เทกซ์ Cerebral ระดับกลูตาไธโอนกลูตาไธโอน (GSH) ในคอร์เทกซ์ cerebral ถูกกำหนดโดยการวิธีการ Ellman [37] แก้ไขโดย Jollow et al. [38] วิธีการคือตามการพัฒนาของสีเหลืองเมื่อ DTNB (5.5-ประกอบด้วยสารเพิ่มกรด benzoic nitro dithiobtis-2)กลุ่ม sulfhydryl Microlitres ห้าร้อยของเนื้อเยื่อ homogenateในฟอสเฟตบัฟเฟอร์ถูกเพิ่มไป 3 ml ของกรด sulfosalicylic 4%ส่วนผสมถูก centrifuged ที่ 1600g สำหรับ 15 นาทีห้าร้อยmillilitres supernatants ขึ้นมา และเพิ่มรีเอเจนต์ของ Ellmanมีที่วัด absorbance ที่ 412 nm หลังจาก 10 นาทีรวมGSH เนื้อหาถูกแสดงเป็น lg/กรัม ของเนื้อเยื่อ2.3.8 hydrophilic สารต้านอนุมูลอิสระกำหนดกรดแอสคอร์บิค (วิตามินซี) ถูกดำเนินการตามที่อธิบายไว้โดย Jacques Silva et al. [39] โปรตีนในคอร์เทกซ์ cerebralสารสกัดจาก homogenate ตกตะกอนในปริมาณ 10% 4 เย็นแก้ปัญหากรด trichloroacetic ส่วนลงตัวเป็นของตัวอย่าง (300 จะ) มีการปรับปรุงมี H2O กับเสียงสุดท้ายของ 1 mL และ incubated ที่ 38 Cสำหรับ 3 h แล้ว 1 mL ของกำมะถันเพิ่ม 65% (v/v) ลงในสื่อผลิตภัณฑ์ปฏิกิริยาที่ถูกกำหนดโดยใช้สีรีเอเจนต์ containIAl. Ben อมราร้อยเอ็ด / แมลงชีวเคมีและสรีรวิทยาของ 101 (2011) 165-174 167ing hydrazine dinitrophenyl 4.5 mg/Ml และ CuSO4 (0.075 mg/mL)ข้อมูลที่แสดงเป็นเนื้อเยื่อของกรดแอสคอร์บิ ค/g lmol2.3.9. ระดับโปรตีนไม่ใช่ thiols คอร์เทกซ์ Cerebralมีกำหนดระดับโปรตีนไม่ใช่ thiols (NPSH) คอร์เทกซ์ cerebralโดยวิธีการ Ellman [37] ส่วนลงตัวจะ 500 ของ supernatantถูกผสมกับกรด trichloroacetic 10% (1 V V/1) หลังจากcentrifugation เม็ดโปรตีนถูกละทิ้ง และฟรี-กลุ่ม SHมีกำหนดใน supernatant ชัดเจน ส่วนลงตัวจะ 100 ของ supernatantถูกเพิ่ม 850 จะ 1 M โพแทสเซียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (pH7.4) และ 50 จะ DTNB (10 mM) 5.5-dithio-bis (2-nitrobenzoicกรด) มีที่วัด absorbance ของปฏิกิริยาเทียบเคียง412 nm รวม NPSH เนื้อหาถูกแสดงเป็น lmol/g ของเนื้อเยื่อ2.3.10 กำหนด acetylcholinesterase กิจกรรมในสมองคอร์เทกซ์กิจกรรม acetylcholinesterase (AChE) ถูกวัดทันทีใน homogenates ตามวิธีของ Ellman et al[40], acetylthiocholine ไอโอไดด์โดยใช้กับพื้นผิว ปฏิกิริยาส่วนผสมประกอบด้วยดังนี้: ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (0.1 M; pH8) และ 0.01 M DTNB อัตราไฮโตรไลซ์ acetylthiocholine ไอโอไดด์วัดที่ 412 nm ผ่านของ thiol ผสมซึ่งเมื่อปฏิกิริยาที่เกิดขึ้นกับ DTNB, colourforming ที่ผลิตผสม TNB เริ่มปฏิกิริยา โดยเพิ่มไอโอไดด์ acetylthiocholine 0.075 M กิจกรรมที่แสดงเป็นmicromole ของพื้นผิว/นาที/มิลลิกรัมโปรตีน2.3.11. Butyrylcholinesterase (BuChE) กิจกรรมในคอร์เทกซ์ cerebralButyrylcholinesterase กิจกรรมถูกกำหนด โดยวิธีการของ Ellman et al. [40] ด้วยการปรับเปลี่ยนบางอย่าง ไฮโตรไลซ์อัตรามีที่วัดความเข้มข้น acetylthiocholine 0.8 มม.ในโซลูชั่นวิเคราะห์ 1 mL มีบัฟเฟอร์ฟอสเฟต 100 มม. pH 7.5 และ1.0 มม. DTNB Microliters 50 ของคอร์เทกซ์ของ supernatant cerebralเพิ่มส่วนผสมของปฏิกิริยา และ preincubated สำหรับ 3 นาทีไฮโตรไลซ์ถูกตรวจสอบ โดยการก่อตัวของ thiolate dianionของ DTNB ที่ 412 nm สำหรับ 2-3 นาที (ช่วงเวลา 30 s) ที่ 25 c ตัวอย่างทั้งหมดถูกเรียกใช้สำเนา2.4. สรีรวิทยาศึกษาตัวอย่างคอร์เทกซ์ cerebral วัตถุประสงค์การตรวจสรีรวิทยาโดยแสง microscopy ได้ทันทีคงใน 10% formalinและประมวลผลในชุดโซลูชั่นของเอทานอลที่มีการจัดระดับ พวกเขาแล้วถูกฝังในพาราฟิน serially จัดแบ่งเป็นส่วน ๆ 3 lm และสีกับ hematoxylin – eosin ภาพนิ่งหกถูกเตรียมจากแต่ละคอร์เทกซ์ cerebral ทุกส่วนได้ประเมินระดับของการบาดเจ็บของคอร์เทกซ์ cerebral2.5. สถิติวิเคราะห์ข้อมูลได้วิเคราะห์โดยใช้โปรแกรมแพคเกจทางสถิติStat ดู 5 ซอฟต์แวร์สำหรับ Windows (สถาบัน SAS, Berkley, CA) ทางสถิติทำการวิเคราะห์โดยใช้ผลต่างของการวิเคราะห์แบบทางเดียว(การวิเคราะห์ความแปรปรวน) ตาม ด้วยของ Fisher ได้รับการป้องกันอย่างน้อยรทดสอบ (PLSD) เป็นการทดสอบ post hoc สำหรับการเปรียบเทียบระหว่างกลุ่มค่าทั้งหมดถูกแสดงเป็น

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ใช้ของสัตว์ที่ถูกตรวจสอบทุกวัน (ตารางที่ 1) DM, Se และปริมาณวิตามินอีหนูกินโดยผู้ใหญ่จะถูกคำนวณตามลำดับจากการบริโภคน้ำและอาหาร. สัตว์ของกลุ่มต่าง ๆ ที่ถูกฆ่าตายในตอนท้ายของการรักษาโดยการตัดศีรษะปากมดลูกเพื่อหลีกเลี่ยงความเครียด เนื้อเยื่อสมองจะถูกลบออกทันทีและชำแหละแก้วเย็นภาพนิ่งและภูมิภาคเปลือกสมองถูกเก็บรวบรวมและหดหาย(10% w / v) แยกกับ homogeniser Turrax อัลตร้าในเย็น, 1.15% KCl-0.01 M โซเดียมฟอสเฟตโพแทสเซียม บัฟเฟอร์(1 M: K2HPO4 1 M: KH2PO4 ค่า pH 7.4) homogenates ถูกหมุนเหวี่ยงที่ 10,000g 20 นาทีที่ 4 องศาเซลเซียสส่งผลให้ supernatants ถูกนำมาใช้สำหรับการเกิด lipid peroxidation ทันทีและการเกิดออกซิเดชันโปรตีนการตรวจ aliquots homogenate ถูกเก็บไว้ที่ 80 องศาเซลเซียสเป็นเวลาชีวเคมีต่อการตรวจ เนื้อเยื่อสมองอื่น ๆ , สกัดจากการควบคุมและรับการรักษาหนูได้รับการแก้ไขในฟอร์มาลินบัฟเฟอร์10% และได้รับการประมวลผลสำหรับsectioning พาราฟินสำหรับการศึกษาเนื้อเยื่อ. 2.3 ประมาณการทางชีวเคมี2.3.1 ปริมาณโปรตีนโปรตีนเยื่อหุ้มสมองถูกวัดตามวิธีการของคอรีเอตอัล [29] โดยใช้ซีรั่มอัลบูมิวัวเป็นมาตรฐาน. 2.3.2 Malondialdehyde (MDA) การวัดความเข้มข้นMalondialdehyde เปลือกสมองดัชนีของการเกิดlipid peroxidation ถูกกำหนด spectrophotometrically ตามผักและแฮดลีย์ [30] สั้น ๆ การหารของสมองเยื่อหุ้มสมองใสสารสกัดผสมกับ1 มล. 5% ไตรคลอโรกรดและหมุนเหวี่ยงที่2500g เป็นเวลา 10 นาที จำนวน 1 มิลลิลิตรของสารกรดthiobarbituric (0.67%) ถูกบันทึกอยู่ใน 500 ของ LL ใสและให้ความร้อนที่90 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 15 นาที ระบายความร้อนด้วยส่วนผสมที่แล้วได้รับการวัดการดูดกลืนแสงสำหรับที่ 532 นาโนเมตรโดยใช้สเปก (Jenway UV-6305 เอสเซ็กซ์อังกฤษ) ค่า Malondialdehyde ถูกคำนวณโดยใช้ 1,1,3,3-tetraethoxypropane เป็นมาตรฐานและแสดงเป็นnmoles ของ Malondialdehyde / g ของเนื้อเยื่อ. 2.3.3 ความมุ่งมั่นของเปลือกสมองขั้นสูงการเกิดออกซิเดชันโปรตีนระดับผลิตภัณฑ์ซิเดชั่นขั้นสูงผลิตภัณฑ์โปรตีน(AOPP) ระดับได้รับการพิจารณาตามวิธีการของKayali et al, [31] สั้น ๆ , 0.4 มล. ของสารสกัดจากเปลือกสมองได้รับการรักษาด้วย 0.8 มล. ฟอสเฟตบัฟเฟอร์(0.1 M; pH 7.4) หลังจากนั้น 2 นาที 0.1 มล. 1.16 M โพแทสเซียมไอโอไดด์ (KI) ถูกบันทึกอยู่ในหลอดที่ใช้ 0.2 มล. กรดอะซิติก การดูดกลืนแสงของผสมปฏิกิริยาถูกบันทึกไว้ได้ทันทีที่340 นาโนเมตร ความเข้มข้นของ AOPP สำหรับแต่ละตัวอย่างที่คำนวณโดยใช้ค่าสัมประสิทธิ์การสูญเสียของ261 CM1 MM1 และผลที่ได้รับการแสดงเป็นlmol / มก. โปรตีน. 2.3.4 ความมุ่งมั่นของโปรตีนเปลือกสมองเนื้อหานิลสำเนาโปรตีน (PCO) ถูกวัดโดยใช้วิธีการของ Reznick และเกย์ [32] สั้น ๆ , 100 LL ของสารสกัดจากเปลือกสมองใสถูกวางไว้ในหลอดแก้ว แล้ว 500 LL 10 มิลลิ2,4-dinitrophenylhydrazine (DNPH) 2 ไม่มี HCl ถูกเพิ่ม ท่อถูกบ่มเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง ตัวอย่างการ vortex ทุก 15 นาที แล้ว 500 LL TCA (20%) มีการเพิ่มและหลอดถูกทิ้งไว้บนน้ำแข็งเป็นเวลา5 นาทีตามด้วยการหมุนเหวี่ยงสำหรับ10 นาที ตกตะกอนโปรตีนที่ถูกเก็บรวบรวม เม็ดที่ได้รับแล้วล้างครั้งที่สองกับเอทานอลอะซิเตทเอทิล (v / v) ตะกอนสุดท้ายถูกละลายใน 600 LL 6 M ไฮโดรคลอไร guanidine วิธีการแก้ปัญหาและการบ่มเป็นเวลา 15 นาทีที่ 37 องศาเซลเซียสการดูดกลืนแสงของที่ตัวอย่างวัดที่370 นาโนเมตร เนื้อหาคาร์บอนิลที่คำนวณได้ขึ้นอยู่กับค่าสัมประสิทธิ์การสูญเสียฟันกรามของ DNPH (จ = 2.2 104 CM1 M1) และแสดงความเป็น lmol / มก. โปรตีน. 2.3.5 นา + K + ATPase นาการวิเคราะห์กิจกรรมของนา+ K + ATPase นาในเยื่อหุ้มสมองสมองถูกกำหนดโดยใช้วิธีการของKawamoto et al, [33] กิจกรรม ATPase ทั้งหมดถูกกำหนดโดยการทดสอบการปล่อยออกมาจากพี่เอทีพีไฮโดรไลซ์สร้างที่ซับซ้อนที่มีโมลิบ ปฏิกิริยาได้ริเริ่มขึ้นโดยการเพิ่ม40 LL ของ homogenate (ลอยอยู่ในบัฟเฟอร์ Tris-HCl, pH 7.4) เพื่อ200 LL บัฟเฟอร์ ATPase ที่มีการ (mm): 3 เอทีพี 120 โซเดียมคลอไรด์ 2 KCl, 3 MgCl2 และ 30 ฮิสติดีน (pH 7.2 ) ที่มีและไม่มี ouabain (3 มิลลิเมตร) กิจกรรม ATPase วัดหลังจาก 60 นาทีของการบ่มที่อุณหภูมิ37 องศาเซลเซียสปฏิกิริยาก็ประสบความสำเร็จโดยนอกเหนือจากการดับเป็นวิธีการแก้ปัญหา(0.6 มล.) ที่มี 1 N H2SO4 และ 0.5% แอมโมเนียมโมลิบ การก่อตัวของความซับซ้อน phosphomolybdate ถูกกำหนดspectrophotometrically ที่ 700 นาโนเมตร เส้นโค้งมาตรฐานได้รับการทำงานโดยใช้ H2PO4 นา +, K + กิจกรรม ATPase นาวัดเป็นความแตกต่างระหว่างouabain รับการรักษาและ ouabain-ได้รับการรักษาตัวอย่าง กิจกรรมของเอนไซม์ถูกแสดงเป็น lmol พี่ไท / ชั่วโมง / g เนื้อเยื่อ. 2.3.6 ความมุ่งมั่นของเปลือกสมองเอนไซม์ต้านอนุมูลอิสระCatalase (กสท.) กิจกรรมได้รับการวิเคราะห์โดยวิธี Aebi เมื่อ [34]. ปฏิกิริยาเอนไซม์ได้ริเริ่มขึ้นโดยการเพิ่ม aliquot 20 LL ของเนื้อเยื่อปั่นและสารตั้งต้น(H2O2) เพื่อความเข้มข้น0.5 M ในสื่อที่มีฟอสเฟตบัฟเฟอร์ 100 มิลลิเมตร(pH 7.4) การเปลี่ยนแปลงในการดูดกลืนแสงที่ถูกบันทึกไว้ที่ 240 นาโนเมตร กสท. กิจกรรมที่คำนวณได้ในแง่ของการบริโภค lmol H2O2 / นาที / มก. โปรตีน. Superoxide dismutase (SOD) กิจกรรมเป็นที่คาดกันตามเตชและFridovich [35] ผสมปฏิกิริยาที่มีอยู่50 มิลลิ homogenates ของเนื้อเยื่อในบัฟเฟอร์ฟอสเฟตโพแทสเซียม (pH 7.8) 0.1 มิลลิ EDTA, 13 มิลลิ L-methionine 2 riboflavin LM และ75 มิลลิไนโตรฟ้า tetrazolium (NBT) ที่พัฒนาสีฟ้าในการทำปฏิกิริยาวัดที่ 560 นาโนเมตร หน่วยของกิจกรรม SOD ถูกแสดงเป็นปริมาณของเอนไซม์ที่จำเป็นในการยับยั้งการลดลงของ NBT 50% และกิจกรรมที่ได้รับการแสดงเป็นยูนิต / มิลลิกรัมโปรตีน. peroxidase กลูตาไธโอน (GPx) กิจกรรมวัดตามFlohe และ Gunzler [36] GPx เร่งปฏิกิริยาออกซิเดชันของกลูตาไธโอนที่ลดลงโดยไฮโดรคิวมีน ในการปรากฏตัวของกลูตาไธโอนที่ลดลงreductase และ Nicotinamide adenine dinucleotide ฟอสเฟตรูปแบบที่ลดลง (NADPH) ที่ออกซิไดซ์กลูตาไธโอนที่ลดลงจะถูกแปลงทันทีเพื่อรูปแบบที่ลดลงไปด้วยกันกับการเกิดออกซิเดชันของNADPH-NADP + การลดลงของการดูดกลืนแสงที่340 นาโนเมตรวัด กิจกรรมของเอนไซม์ที่ได้รับการแสดงเป็นnmole ของ GSH ออกซิไดซ์ / นาที / มก. โปรตีน. 2.3.7 ระดับกลูตาไธโอนเปลือกสมองกลูตาไธโอน (GSH) ในเปลือกสมองได้รับการกำหนดโดยวิธีการของEllman [37] แก้ไขโดย Jollow et al, [38] วิธีการที่จะอยู่บนพื้นฐานของการพัฒนาของสีเหลืองเมื่อ DTNB (5,5- dithiobtis-2 กรดเบนโซอิกไนโตร) จะถูกเพิ่มสารที่มีกลุ่มsulfhydryl ห้าร้อย microlitres homogenate ของเนื้อเยื่อในฟอสเฟตบัฟเฟอร์ถูกเพิ่มเข้าไปใน3 มล. 4% กรด sulfosalicylic. ส่วนผสมที่ถูกหมุนเหวี่ยงที่ 1600g เป็นเวลา 15 นาที ห้าร้อยมิลลิลิตร supernatants ถูกนำและเสริมสาร Ellman ของ. การดูดกลืนแสงที่ได้รับการวัดที่ 412 นาโนเมตรหลังจาก 10 นาที รวมเนื้อหา GSH ถูกแสดงเป็นแอลจี / g ของเนื้อเยื่อ. 2.3.8 สารต้านอนุมูลอิสระ Hydrophilic วิตามินซี (Vitamin C) ความมุ่งมั่นที่ได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้โดยฌาค-et al, ซิลวา [39] โปรตีนในเปลือกสมองhomogenate สารสกัดจากได้รับการตกตะกอนใน 10 เล่มที่มีอากาศเย็น 4% ไตรคลอโรสารละลายกรด aliquot ของกลุ่มตัวอย่าง (300 LL) ปรับกับH2O ปริมาณสุดท้ายของ 1 มิลลิลิตรและบ่มที่ 38 องศาเซลเซียสเป็นเวลา3 ชั่วโมงแล้ว 1 มิลลิลิตร H2SO4 65% (v / v) ถูกบันทึกอยู่ในสื่อ. ผลิตภัณฑ์ปฏิกิริยาตามมาก็คือ การพิจารณาโดยใช้น้ำยาสี containI. เบนอมรา et al, / สารกำจัดศัตรูพืชชีวเคมีและสรีรวิทยา 101 (2011) 165-174 167 ไอเอ็นจี 4.5 mg / ml ไฮดราซีน dinitrophenyl และ CuSO 4 (0.075 มิลลิกรัม / มิลลิลิตร). ข้อมูลแสดงว่าวิตามินซี lmol / g เนื้อเยื่อ. 2.3.9 เยื่อหุ้มสมองสมองระดับที่ไม่ใช่โปรตีน thiols สมองเยื่อหุ้มสมอง thiols ที่ไม่ใช่โปรตีน (NPSH) ระดับได้รับการพิจารณาโดยวิธีEllman เมื่อ [37] aliquot LL 500 ใสผสมกับ10% กรดไตรคลอโร (1 V / 1 V) หลังจากการหมุนเหวี่ยงที่เม็ดโปรตีนทิ้งและกลุ่มSH-ฟรีได้รับการพิจารณาในสารละลายที่ชัดเจน หาร 100 LL ของสารละลายถูกบันทึกอยู่ใน850 LL 1 M โพแทสเซียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (pH 7.4) และ 50 ของ LL DTNB (10 มิลลิเมตร) 5,5-dithio ทวิ (2 nitrobenzoic กรด) การดูดกลืนแสงของการเกิดปฏิกิริยาสีวัดที่412 นาโนเมตร เนื้อหาทั้งหมด NPSH ถูกแสดงเป็น lmol / g ของเนื้อเยื่อ. 2.3.10 การกำหนดกิจกรรมสารในสมองเยื่อหุ้มสมองปรุง(เจ็บ) กิจกรรมวัดทันทีในhomogenates ตามวิธีการของ Ellman และอัล. [40] โดยใช้ไอโอไดด์ acetylthiocholine เป็นสารตั้งต้น ปฏิกิริยาส่วนผสมประกอบด้วยดังนี้ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (0.1 M; pH 8) และ 0.01 M DTNB อัตราการย่อยสลายของไอโอไดด์ acetylthiocholine เป็นวัดที่ 412 นาโนเมตรผ่านการเปิดตัวของสารประกอบ thiol ซึ่งเมื่อทำปฏิกิริยากับ DTNB หยิบ colourforming สารประกอบ TNB ปฏิกิริยาที่ได้ริเริ่มขึ้นโดยการเพิ่ม0.075 M acetylthiocholine ไอโอไดด์ กิจกรรมที่ได้รับแสดงเป็นไมโครโมลของพื้นผิว / นาที / มก. โปรตีน. 2.3.11 Butyrylcholinesterase (Buche) กิจกรรมในเยื่อหุ้มสมองสมองกิจกรรมButyrylcholinesterase ถูกกำหนดโดยวิธีการของEllman et al, [40] มีการปรับเปลี่ยนบางอย่าง อัตราการย่อยสลายวัดที่ระดับความเข้มข้น acetylthiocholine 0.8 มิลลิใน 1 มิลลิลิตรโซลูชั่นการทดสอบด้วย 100 มิลลิฟอสเฟตบัฟเฟอร์ค่า pH 7.5 และ1.0 มิลลิ DTNB ห้าสิบ microliters ของเปลือกสมองใสได้ถูกเพิ่มเข้าไปผสมปฏิกิริยาและpreincubated เป็นเวลา 3 นาที. การย่อยสลายที่ได้รับการตรวจสอบโดยการก่อตัวของ dianion thiolate ของ DTNB ที่ 412 นาโนเมตรสำหรับ 2-3 นาที (ช่วงเวลา 30 วินาที) อยู่ที่ 25 องศาเซลเซียสตัวอย่างทั้งหมดได้รับการทำงานในที่ซ้ำกัน. 2.4 การศึกษาเนื้อเยื่อบางตัวอย่างเปลือกสมองมีไว้สำหรับการตรวจเนื้อเยื่อโดยใช้กล้องจุลทรรศน์แสงได้รับการแก้ไขทันทีใน10% ของฟอร์มาลินและประมวลผลในชุดของการแก้ปัญหาเอทานอลอย่างช้าๆ พวกเขาถูกฝังแล้วในพาราฟินแบ่งเป็นลำดับที่ 3 ไมครอนและย้อมด้วยสีhematoxylin-Eosin หกสไลด์ที่เตรียมจากแต่ละเปลือกสมอง ทุกส่วนได้รับการประเมินสำหรับระดับของการบาดเจ็บเยื่อหุ้มสมองสมอง. 2.5 การวิเคราะห์ทางสถิติวิเคราะห์ข้อมูลโดยใช้โปรแกรมสำเร็จรูปทางสถิติสถิติมุมมอง5 ซอฟต์แวร์สำหรับ Windows (SAS Institute, เบิร์กลีย์, แคลิฟอร์เนีย) สถิติการวิเคราะห์ถูกดำเนินการโดยใช้การวิเคราะห์ทางเดียวความแปรปรวน(ANOVA) ตามด้วยฟิชเชอร์น้อยที่มีการป้องกันความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญ(PLSD) การทดสอบการทดสอบนักเรียนโพสต์สำหรับการเปรียบเทียบระหว่างกลุ่ม. ค่าทั้งหมดถูกแสดงเป็นวิธีการ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ใช้ในสัตว์กลุ่มตรวจสอบทุกวัน ( ตารางที่ 1 ) เบาหวาน , เซ
วิตามินอีปริมาณกินหนูผู้ใหญ่ได้ตามลำดับ

จากน้ำและอาหารที่บริโภค สัตว์ในกลุ่มถูกสังหารในตอนท้ายของ
รักษาโดยตัดปากมดลูกเพื่อหลีกเลี่ยงความเครียด เนื้อเยื่อสมอง
รีบลบออก และผ่าเหนือเย็นแก้ว
ภาพนิ่งและซีรีบรัลคอร์เท็กซ์เขตรวบรวมและบด
( % w / v 10 ) แยกกับ Ultra turrax homogeniser ในเย็น ,
1.15 % . - 0.01 M โซเดียม , โพแทสเซียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์
1 M : k2hpo4 ; 1 M : kh2po4 pH 7.4 ) homogenates เป็นระดับ 10000g
ที่ 20 นาทีที่ 4 องศาเซลเซียส ส่งผลให้ supernatants
นำมา lipid peroxidation ได้ทันทีและวิธีออกซิเดชัน
โปรตีนกลุ่มที่ 3 ได้รับทั้งผิง
( 0.2 g l1
) และซีลีเนียม ( 0.5 มิลลิกรัมต่อกิโลกรัมของอาหาร ) ; กลุ่ม 4 ถือว่า
กับผิง ( 0.2 g l1
) และวิตามินอี ( 100 มิลลิกรัม / กิโลกรัมของอาหาร ) ;
v ได้รับกลุ่มไดเมทโธเอท ( 0.2 กรัม l1
) ซีลีเนียม ( 0.5 N -
seo3 มิลลิกรัมต่อกิโลกรัมของอาหาร ) วิตามินอี ( 100 มิลลิกรัม / กิโลกรัม ทั้งนี้อะซิ
อาหาร ) และกลุ่มที่ 6 กับ 7 ได้รับทั้งซีลีเนียม ( 0.5 N -
[ 29 ] ใช้อัลบูมินเป็นมาตรฐาน
.
2.3.2 . มาลอนไดอัลดีไฮด์ ( MDA ) การวัดความเข้มข้นของซีรีบรัลคอร์เท็กซ์
O
, ดัชนีของ lipid peroxidation โดยพิจารณาตามนี้
และ Draper แฮดลีย์ [ 30 ] สั้น ๆ , เป็นส่วนลงตัวของซีรีบรัลคอร์เท็กซ์สูงผสมกับสารสกัด
1 มิลลิลิตรของกรดไตรคลอโรอะซิติก 5 %
ไฟฟ้าที่ 2500g นาน 10 นาทีจำนวน 1 ml เท่ากับกรด ( 0.67 %
3 ) เพิ่ม 500 จะนำ
และอุ่นที่ 90 องศาเซลเซียส 15 นาที ส่วนผสมจะถูกวัดค่าการดูดกลืนแสงและเย็นแล้ว

ที่ 532 นาโนเมตรโดยใช้ Spectrophotometer ( jenway uv-6305 , Essex , อังกฤษ ) ที่คำนวณโดยใช้ค่า
O
1,1,3,3-tetraethoxypropane เป็นมาตรฐานและแสดงเป็น O / g ในเนื้อเยื่อ .
2.33 . ความมุ่งมั่นของซีรีบรัลคอร์เท็กซ์ขั้นสูงผลิตภัณฑ์ระดับโปรตีนออกซิเดชัน

ผลิตภัณฑ์โปรตีนออกซิเดชันขั้นสูง ( aopp ) ระดับวิเคราะห์
ตามวิธีการของ kayali et al . [ 31 ] สั้น , 0.4 มล.
ของซีรีบรัลคอร์เท็กซ์ได้รับ 0.8 ml สารสกัด ( 0.1 M phosphate buffer pH 7.4
; ) หลังจาก 2 นาที , 0.1 มล. 1.16 เมตร โพแทสเซียมไอโอไดด์ ( Ki )
คือเพิ่มหลอดตามด้วย 02 มิลลิลิตรของกรด . น
ของปฏิกิริยาผสมทันทีบันทึก
340 นาโนเมตร ความเข้มข้นของ aopp สำหรับแต่ละตัวอย่างถูกคำนวณโดยใช้ค่าสัมประสิทธิ์การสูญพันธุ์
0
mm1 CM1 และผลลัพธ์ที่ได้แสดงเป็น lmol / mg protein .
2.3.4 . การหาปริมาณโปรตีนโปรตีนคาร์บอนิลซีรีบรัล คอร์เท็กซ์ ( PCO )
carbonyls ถูกวัดโดยใช้วิธี
reznick บรรจุหีบห่อและ [ 32 ]สั้น 100 จะของซีรีบรัลคอร์เท็กซ์สกัด
น่านอยู่ในหลอดแก้ว แล้ว 500 จะ 2,4-dinitrophenylhydrazine 10 mm
( dnph ) 2 N HCl ถูกเพิ่ม หลอด
ถูกบ่มเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง จำนวน vortexed
ทุก 15 นาทีแล้ว 500 จะ TCA ( 20% ) เพิ่ม
หลอดซ้ายบนน้ำแข็งเป็นเวลา 5 นาทีตามด้วยการปั่นเหวี่ยงสำหรับ
10 นาทีปริมาณตะกอนที่ถูกบุกรุก เม็ดถูก
แล้วล้างสองครั้งด้วยเอทานอล - เอทิลอะซิเตท ( v / v )
และสุดท้ายละลายใน 600 จะ 6 M กัวนิดีนไฮโดรคลอไรด์
โซลูชั่นและบ่มที่ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 15 นาทีค่า
ตัวอย่างถูกวัดที่ 370 nm . คาร์บอนิลเนื้อหามีค่า
ตามกรามการสูญพันธุ์สัมประสิทธิ์ของ dnph
( E = 2.2 104 CM1 M1