3. MATERIAL AND METHODS3.1. DNA ext

3. MATERIAL AND METHODS3.1. DNA extractionOne tissue culture flask was washed three timeswith sterile saline, 25 mM EDTA, pH 7.5. Thecells were scraped in the last washing solution.After centrifugation the pellet was suspended in1 ml 75 mM NaCI, 25 mM EDTA, pH 7.5. 1%SDS final concentration and 100 ixg/ml finalconcentration proteinase K were added. The suspension was incubated for 2 h at 56°C. Hereafterthe tubes were cooled on ice and ethanol (100%)was added to 70% final concentration. The DNAstring was isolated and washed two times in 70%ethanol. After precipitation of the DNA, the pellet was dissolved in 1 ml TE buffer (10 mM Tris,0.i mM EDTA, pH 7.5). The residual proteinaseK was inactivated by 5 min heating at 95°C. TheDNA extracts were stored at -20°C. 1.5 txl ofthis extract was used for PCR.3.2. PCR amplificationPCR amplification was performed on a Pharmacia LKB (Gene ATAQ controller) thermal cycler. For the universal primers as well as for themycoplasma primers, 25 cycles with denaturationat 94 °C (1 rain), annealing at 60°C (1 rain) andextension at 60°C (1 rain) followed by an elongation step at 60°C (10 rain). Exception was madefor the mycoplasma primer 1P'3 where an annealing temperature of 56°C was taken. The assay wasperformed in a 50 #1 volume with 1.25 U TaqDNA polymerase (Perkin Elmer Cetus), gelatinbuffer (50 mM KC1, 10 mM Tris pH 8.3, 1.5 mMMgC12, 0.01% gelatin), 62.5 IzM dNTP and 25pmol of each primer. In the double amplificationtests, the annealing temperature of the first amplification was adjusted at 65°C. 1 tzl of the PCRproduct of the first reaction was used for thesecond amplification. 10 txl of the PCR productwas separated by polyacrylamide (8%) gel electrophoresis (Midget, Pharmacia LKB) and visualised by ethidium bromide staining.4. RESULTS AND DISCUSSIONPrimers (5'P1 3'P2, 5'P3 3'P4), listed in Table1, were selected from the conserved regions ofthe prokaryotic 16S rRNA gene flanking the variable regions, respectively V4 and V8 (Fig. 1). Therespective fragments, 190 and 120 bp, were amplified by PCR. Because P1/P2 and P3/P4 weredesigned to detect any prokaryotic DNA, theywere called universal primers. In preliminary testspurified DNA of E. coli, Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas hydrophila, Staphylococcus

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

3. อุปกรณ์และวิธีการ
3.1 ดีเอ็นเอสกัด
หนึ่งขวดเนื้อเยื่อวัฒนธรรมถูกล้างสามครั้ง
ด้วยน้ำเกลือฆ่าเชื้อ 25 มม EDTA, ค่า pH 7.5
เซลล์ถูกคัดลอกในการแก้ปัญหาการซักผ้าที่ผ่านมา
หลังจากการหมุนเหวี่ยงเม็ดถูกระงับใน
1 มิลลิลิตร 75 มิลลิเมตร NaCI, 25 มม EDTA, ค่า pH 7.5 1%
SDS เข้มข้นสุดท้ายและ 100 ixg / ml สุดท้าย
เข้มข้น Proteinase K ถูกเพิ่ม ระงับถูกบ่มเป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่ 56 ° C ปรโลก
หลอดที่ถูกระบายความร้อนบนน้ำแข็งและเอทานอล (100%)
ถูกบันทึกอยู่ในความเข้มข้นสุดท้าย 70% ดีเอ็นเอ
สตริงถูกแยกออกและล้างสองครั้งใน 70%
เอทานอล หลังจากการตกตะกอนของดีเอ็นเอเม็ดก็เลือนหายไปใน 1 มิลลิลิตร TE บัฟเฟอร์ (10 mM Tris,
0.i mM EDTA, ค่า pH 7.5) โปรเหลือ
K ถูกยกเลิกโดย 5 นาทีความร้อนที่ 95 องศาเซลเซียส
สารสกัดดีเอ็นเอถูกเก็บไว้ที่อุณหภูมิ -20 องศาเซลเซียส 1.5 TXL ของ
สารสกัดนี้ถูกใช้สำหรับการ PCR
3.2 ขยาย PCR
ขยาย PCR ที่ได้ดำเนินการใน Pharmacia LKB (ยีนควบคุม Ataq) Cycler ความร้อน สำหรับไพรเมอร์สากลเช่นเดียวกับสำหรับ
ไพรเมอร์ Mycoplasma 25 รอบกับ denaturation
ที่ 94 ° C (1 ฝน), การอบที่อุณหภูมิ 60 ° C (1 ฝน) และ
ส่วนขยายที่ 60 ° C (1 ฝน) ตามด้วยขั้นตอนการยืดตัวที่ 60 ° C (10 ฝน) ยกเว้นถูกสร้างขึ้นมา
สำหรับ Mycoplasma ไพรเมอร์ 1P'3 ที่อุณหภูมิการอบ 56 องศาเซลเซียสถูกนำตัว การทดสอบได้รับการ
ดำเนินการในปริมาณ 50 # 1 1.25 U Taq
DNA Polymerase (Perkin Elmer Cetus), เจลาติน
บัฟเฟอร์ (50 มิลลิ KC1 10 มิลลิทริสพีเอช 8.3, 1.5 มิลลิ
MgC12 0.01% เจลาติน) 62.5 izm dNTP และ 25
pmol ของแต่ละไพรเมอร์ ในการขยายคู่
ทดสอบอุณหภูมิการหลอมของเครื่องขยายเสียงแรกที่ได้รับการปรับเปลี่ยนที่ 65 ° C 1 TZL ของ PCR
ผลิตภัณฑ์ของปฏิกิริยาแรกถูกนำมาใช้สำหรับ
การขยายสอง 10 TXL ของผลิตภัณฑ์ PCR
ถูกแยกออกจากอะคริเลต (8%) gel electrophoresis (คนแคระ, Pharmacia LKB) และมองเห็นโดย ethidium bromide การย้อมสี
4. ผลลัพธ์และการอภิปราย
ไพรเมอร์ (5'P1 3'P2, 5'P3 3'P4) แสดงในตารางที่
1 ได้รับการคัดเลือกจากภูมิภาคอนุรักษ์ของ
นิวเคลียสยีน 16S rRNA ขนาบภูมิภาคตัวแปรตามลำดับ V4 และ V8 (รูปที่ 1).
ชิ้นส่วนแต่ละ, 190 และ 120 bp ถูกขยายโดยวิธี PCR เพราะ P1 / P2 และ P3 / P4 ถูก
ออกแบบมาเพื่อตรวจสอบดีเอ็นเอนิวเคลียสใด ๆ พวกเขา
ถูกเรียกว่าไพรเมอร์สากล ในการทดสอบเบื้องต้น
บริสุทธิ์ดีเอ็นเอของเชื้อ E. coli, aeruginosa พเชื้อ Aeromonas, Staphylococcus

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

3. วัสดุและวิธีการ
๓.๑การสกัดดีเอ็นเอ
ขวดเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อหนึ่งถูกล้างสามครั้ง
ด้วยน้ำเกลือที่มีการฆ่าเชื้อ25มม. EDTA, pH ๗.๕ การ
เซลล์ถูกขูดออกไปในน้ำยาล้างหลังสุด
หลังจากการหมุนของเม็ดถูกแขวนไว้ใน
1 ml ๗๕ mM NaCI, 25 มม. EDTA, pH ๗.๕ 1
ความเข้มข้นสุดท้าย SDS และ๑๐๐ ixg/ml สุดท้าย
เพิ่มความเข้มข้นของ proteinase K การระงับถูก incubated สำหรับ 2 h ที่56° c. ภายหน้า
หลอดถูกระบายความร้อนบนน้ำแข็งและเอทานอล (๑๐๐%)
ถูกเพิ่มเข้าไป๗๐% ความเข้มข้นสุดท้าย ดีเอ็นเอ
สตริงถูกแยกและล้างสองครั้งใน๗๐%
เอทานอ . หลังจากการตกตะกอนของดีเอ็นเอเม็ดถูกละลายใน 1 ml (Tris 10 มม.,
0. i mM EDTA, pH ๗.๕) โปรตีนที่เหลือ
K ถูกพักเครื่องทำความร้อน5นาทีที่95° c การ
สารสกัดดีเอ็นเอถูกเก็บไว้ที่-20 ° c. ๑.๕ txl
สารสกัดนี้ถูกใช้สำหรับ PCR.
๓.๒การขยาย PCR
การขยาย PCR ได้ดำเนินการบนวงจรความร้อนของเภสัช (ยีน ATAQ) สำหรับไพรเมอร์สากลเช่นเดียวกับการ
mycoplasma primers, 25 รอบกับ denaturation
ที่๙๔° c (1 ฝน), การอบที่60° c (1 ฝน) และ
ส่วนขยายที่60° c (1 ฝน) ตามด้วยขั้นตอนการยืดที่60° c (10 ฝน) เกิดข้อยกเว้น
สำหรับ mycoplasma ไพรเมอร์ 1P ' 3 ที่อุณหภูมิการอบ56° c ถูกถ่าย การทดสอบถูก
ดำเนินการในปริมาณ #1 ๕๐กับ๑.๒๕ U Taq
ดีเอ็นเออเรส (เพอร์คินเอลเมอร์เซตตา), วุ้น
บัฟเฟอร์ (๕๐ mM KC1, 10 mM Tris pH ๘.๓, ๑.๕ mM
MgC12, ๐.๐๑% วุ้น), ๖๒.๕ IzM dNTP และ25
pmol ของแต่ละไพรเมอร์ ในการขยายคู่
การทดสอบอุณหภูมิการหลอมของการขยายตัวครั้งแรกที่มีการปรับที่65° c 1 tzl ของ PCR
ผลิตภัณฑ์ของปฏิกิริยาแรกที่ใช้ในการ
การขยายเสียงที่สอง 10 txl ของผลิตภัณฑ์ PCR
ถูกแยกออกจากกันโดย polyacrylamide (8%) เจ electrophoresis (คนแคระ, เภสัชตำรับ LKB) และการออกมาโดย ethidium โบรไมด์
4. ผลและการสนทนา
(5 ' P1 3 ' P2, 5 ' P3 3 ' P4), แสดงในตาราง
1ถูกเลือกจากพื้นที่ที่สงวนไว้ของ
ยีน prokaryotic 16S rRNA flanking ภูมิภาคตัวแปรตามลำดับ V4 และ V8 (รูปที่ 1) การ
ชิ้นส่วนที่เกี่ยวข้อง, ๑๙๐และ๑๒๐ bp ถูกขยายโดย PCR เพราะ P1/P2 และ P3/P4 เป็น
ออกแบบมาเพื่อตรวจหา DNA ของเรา
เรียกว่า primers สากล ในการทดสอบเบื้องต้น
ดีเอ็นเอที่บริสุทธิ์ของ. coli, ชีโมนิส, Aeromonas hydrophila, Staphylococcus

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

สาม วัสดุและวิธีการ
แถบ 3.1 การสกัดดีเอ็นเอ
ล้างขวดเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อสามครั้ง
การใช้น้ำเกลือปราศจากเชื้อ นี่
เซลล์ถูกขูดออกในของเหลวล้างสุดท้าย
หลังจากแรงเหวี่ยงอนุภาคแขวนลอยใน
มิลลิลิตร 75 มิลลิเมตรเกลือโซเดียมคลอไรด์ 25mm EDTA pH 7.5 จำนวน
ความเข้มข้นสุดท้ายของ SDS และความเข้มข้นสุดท้ายของ 100 ixg ตัวอย่าง
เพิ่มความเข้มข้นของโปรตีน K ระงับฟักออกเป็นสองชั่วโมงภายใต้อุณหภูมิ 56
ท่อเย็นลงบนน้ำแข็งและเอทานอล
เพิ่มความเข้มข้นสุดท้ายของ 70 เปอร์เซ็นต์ ดีเอ็นเอ
เชือกที่ถูกแยกและล้างสองครั้งในกรณีของ 70 เปอร์เซ็นต์
แอลกอฮอล์ หลังจากการตกตะกอนของดีเอ็นเออนุภาคจะถูกละลายใน 1-มลิตรเต้บัฟเฟอร์
0.1 มิลลิเมตร EDTA ค่า pH 7.5 โปรตีนตกค้าง
ความร้อนห้านาทีด้านล่าง 95 องศาซี
การสกัดดีเอ็นเอพบว่า
สารสกัดนี้จะใช้ใน PCR
แถบ 3.2 ขยายดีเอ็นเอ
วิธี PCR ที่ถูกใช้เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพการไหลเวียนความร้อนของ farmacia-lkb เครื่องมือ สำหรับไพรเมอร์ทั่วไปเช่นกัน
ไพรเมอร์ไมโคพลาสม่า 25periodic เสื่อม
การอบแห้งฝนด้วยเครื่องอบแห้ง
ยืดภายใต้ 600-c-1 ฝนแล้วขยายใน 600 ∶ C ฝน ข้อยกเว้น
对于支原体引物1P'3，其退火温度为56°C。 ผลการทดสอบคือ
มันถูกออกแบบมาสำหรับ
ดีเอ็นเอพอลิเมอเรสเพอร์คินเอลเมอร์ซีตัสเจลาติน
บัฟเฟอร์น้ำมันกันชนชนิด 5m-kc1-10-m-trys พีเอช 8.3
mgc12 0.01 เปอร์เซ็นต์เจลาติน 62.5 อิซม์ DNTP และ 25
PMOL สำหรับแต่ละสีรองพื้น ในการขยายคู่
อุณหภูมิการอบอ่อนที่เพิ่มขึ้นเป็นครั้งแรกในการทดลอง
ผลิตภัณฑ์ปฏิกิริยาแรกที่ใช้
ขยายมันอีกครั้ง ผลิตภัณฑ์ดีเอ็นเอของ 10-txl
การแยกและการย้อมด้วยเมทิลโบรไมด์โดยวิธีการย้อมด้วยไมโครเจล
สี่ ผลและการอภิปราย
底漆（5'P1 3'P2，5'P3'P4），列于表中
เลือกจาก
ยีน 16srrna โพรคาริโอติกตั้งอยู่บนทั้งสองด้านของตัวแปรภูมิภาคตามลำดับ v4 และ V8 นี่
เพิ่ม 190 และ 120bp ส่วนตามลำดับ สำหรับ P1 และ P2 P3 P4
พวกเขาถูกออกแบบมาเพื่อตรวจหาโพรคาริโอติกดีเอ็นเอ
เรียกว่าไพรเมอร์ทั่วไป ในการทดลองเบื้องต้น
การทำให้บริสุทธิ์ของดีเอ็นเอของ Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa hydrophila และ Staphylococcus