- ข้อความ
- ประวัติศาสตร์
Plant materialThe late blight-susce
Plant material
The late blight-susceptible diploid Solanum tuberosum clone DG
81-68 (2n = 2x = 24) is a potato breeding line obtained in IHARPIB, Młochów Research Center, Poland. Seeds of the tetraploid wild species Solanum villosum Mill. (2n = 4x = 48), highly resistant to Phytophthora infestans, were provided by Warsaw Botanical Garden,Poland. The species origin is Birmingham, UK, and its accession no.is 4.
Axenic shoots of the parental species (received from IHAR-PIB, Młochów Research Center, Poland) and the generated interspecific somatic hybrids expressing differen t levels of resistance to the oomycete pathogen P. infestans were cultured in vitro as described previously (Polkowska-Kowalczyk et al., 2004). The plants grew under controlled conditions: day/light fluorescent lamp 150 mol m−2 s−1 for 16 h, day/nighttemperature of 22/18 ◦C.
The protoplasts isolated from leaves of the parental species were fused in the presence of polyethylene glycol according to Szczerbakowa et al. (2003a,b). The regenerated somatic hybrids were propagated and grown in vitro on MS/2 hormone-free medium (Murashige and Skoog, 1962) supplemented with 2% sucrose and 0.6% agar.
Random amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis
For verification ofthe hybridity,the RAPD analysis was used. The total genomic DNA was isolated from leaves of 3-week-old in vitro grown plants, following the modified cetyltrimethylammonium bromide protocol, as described by Szczerbakowa et al. (2003a). The molecular markers generated in the presence of decamer primer OPH-04 (5GGAAGTCGCC3) were used to confirmthe hybrid nature of the regenerated plants. The polymerase chain reaction (PCR) was carried out in an MJ Mini-Personal Thermal Cycler (Bio-Rad) in a total volume of 25 L of reaction mixture containing: 0.5 U Taq DNA polymerase (Perkin Elmer), 1× buffer (10 mM Tris–HCl, pH 8.3) and 1.5 mM MgCl2, 0.4 M primer, 0.25 mM of each dNTP (Roche Diagnostic), and the DNA template (15 ng). The reaction mixture was supplemented with sterile deionized water to total volume of 25 L. The PCR parameters were established according to Naess et al. (2001). The amplification products (12 L) were separated using electrophoresis in 1.5% agarose gel in 0.5× TBE buffer for 2 h at 90V at room temperature, stained with ethidium bromide (4 g/mL) and evaluated under UV (254 nm). A molecular size marker, 100-bp (Fermentas), was used.
Ploidy level determination
The ploidy level was determined first by counting the chloroplasts in guard cells on the leaf’s lower surface of soil-grown plants. The mean of at least 20 measurements was indicative of the ploidy of plants, as shown for potato by Jakuczun et al. (1997).
The chromosome number was determined directly by chromosome counting in metaphase spreads
Chromosome preparations
Young roots (2 cm long) were detached 7–10 days after the last passage and used for chromosome counting. The root tips were treated with 0.05% aqueous colchicine solution for 3 h to accumulate metaphases and then fixed with Carnoy solution (ethanol:acetic acid, v:v, 3:1) for at least 48 h at 4 ◦C. The fixed tissue was washed in 10 mM citric acid–sodium citrate buffer (pH4.8) for 15 min prior to digestion in an enzyme mixture of 1% cellulase Onozuka R-10 (Kinki Yakult MFG CO., Japan), 1% celulase from Aspergillus niger (0.32 U/mg, Serva), 20% pectolyase (0.70 U/mg, Serva) for 50 min at 37 ◦C. After incubation, the root tips were transferred to the citrate buffer for 15 min at 4 ◦C. Meristems were dissected out from root tips, squashed in drops of 45% acetic acid and frozen. The cover slips were removed and the preparations were dehydrated in a graded series of 70%, 80% and absoluteethanol and air dried. The slides were stained with 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; Sigma) andscreenedunder an Olympus IX70 fluorescent microscope with a CCD camera. Pictures were analyzed using the Analysis 3.0 program.
Genomic in situ hybridization (GISH) analysis
For hybrid genome composition analysis, GISH with total genomic DNAs from S. tuberosum and S. villosum as probes was used. DNA was isolated from leaves harvested from 3-week-old in vitro grown plants according to Doyle and Doyle (1987). Genomic DNA was sheared to a length of 1–10 kb and then labeled with digoxigenin-11-2-deoxy-uridine-5-triphosphate (Amersham) or biotin-16-2-deoxy-uridine-5-triphosphate (Roche) by nick translation.
GISH was performed according to the protocols of Schwarzacher and Heslop-Harrison (2000), with minor modifications. Briefly, the hybridization mixture, consisting of 100 ng of labeled DNA probe, 50% formamide, 10% dextran sulfate and 0.1 g/L of sheared salmon sperm DNA, was denatured for 10 min at 85 ◦C, then chilled on ice and applied to the chromosome preparation. The slides and hybridization mixture were denatured together at 72 ◦C for 5 min in an in situ Thermal Cycler (Thermo Hybrid, Franklin, MA, USA) and then allowed to hybridize for 48–72 h in a humid chamber at 37 ◦C. Stringent washes (10% formamide in 0.1× SSC at37 ◦C) were followed by immunodetection of labeled DNA probes with primary and secondary antibodies. Digoxigenin-labeled DNA probe was detected using fluorescein-conjugated anti-digoxigenin antibodies (Roche, Switzerland) and signals were amplified with fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjugated anti-sheep secondary antibodies (Jackson ImmunoResearch, UK). Biotin-labeled DNA probe was detected with Texas Red-conjugated anti-biotin antibodies (Jackson ImmunoResearch, UK) and signals were amplified with TexasRed-conjugated anti-mouse secondary antibodies (Jackson ImmunoResearch, UK). The preparations were mounted in Vectashield (Vector Laboratories, UK) containing 2 g/mL DAPI. At least 30 metaphase and interphase cells were examined foreach genotype. Selected spreads and interphase nuclei were photographed with a CCD camera attached to an Eclipse 800 Olympus epifluorescence microscope using UV excitation for DAPI visualization, blue light excitation for FITC-conjugated antibodies and green excitation for Texas Red labeled probes. Pictures were analyzed using the Lucia Orca program.
Assessment of late blight resistance
The resistance ofthe genotypes studied to oomycete pathogen P.infestans was evaluated using a detached leaflet assay as described by Zarzycka (2001). One of the most aggressive and virulent isolates of P. infestans (isolate MP324 from 1997, complex race:1.2.3.4.5.6.7.8.10.11, defined using Black’s differential set, A1 mating type and resistant to metalaxyl) received from IHAR-PIB,Młochów Research Center, Poland, was used as inoculum. Sporangia were collected in deionized water and adjusted to a standard concentration of 50 sporangia mm−3. Five to ten leaves from each genotype were tested on two different dates. The leaflets were placed upside-down on a plastic tray on the wet wood wool, and a drop of inoculum was placed near the midrib on each leaflet. Inoculated leaves were incubated at 16 ◦C under constant illumination of about 30 mol m−2 s−1. After six days of incubation, the resistance was evaluated using a 9-grade scale, where 9 indicated the highest resistance. Cultivars (cvs) Tarpan (susceptible) and Bzura (mid-resistant), as well as a diploid clone DG 94-15 (resistant), were used as standards.
The virulence of inoculum (on leaflets of Black’s differentials) and its aggressiveness (on cvs Bintje and Tarpan carrying no Rgenes) were examined in each test.
Pathogen elicitor
The pathogen P. infestans (isolate MP618 from 2005, of following race: 1.2.3.4.(5).6.7.10.11, A1 mating type and resistant to metalaxyl) received from IHAR-PIB, Młochów Research Center, Poland, was maintained on rye agar medium at 15 ◦C in the dark. A cuture filtrate (CF), which served as an elicitor, was prepared from the pathogen grown in liquid medium. After 6 weeks of growth, the medium was separated from the oomycete, dialyzed against water for 48 h, and lyophilized. The CF residue dissolved in distilled water was quantified as g glucose equivalents mL−1, as described in detail by Polkowska-Kowalczyk et al. (2004).
Elicitor treatment of leaves
Leaves harvested from 4-week-old in vitro plants were placed on moist filter paper in Petri dishes. The CF was applied in droplets on the surface of each leaf at a concentration of 0.67 g glucose equivalents g−1 FW. An appropriate volume of the elicitor was applied with a micropipette, in small droplets onto the abaxial leaf surface. In parallel, dishes with control leaves with an equal volume of distilled water in droplets were set up. Leaves were incubated at 25 ◦C under continuous light 150 150 mol m−2 s−1 supplied by fluorescent tubes (Pila, Poland) and kept for 6, 18, 30 h at 25 ◦C under continuous light (Polkowska-Kowalczyk et al., 2004). At given time intervals, the leaves were collected for analysis
Assay for reactive oxygen species (ROS) production
ROS production was evaluated by determining the reduction of nitroblue tetrazolium (NBT) in the medium by O•−2 released from leaf tissues (Doke, 1983). The leaves treated with CF and the control leaves treated with water were incubated for 1 h in a mixture containing NBT (2,2-di-p-nitrophenyl-5,5-diphenyl-[3,3-dimethoxy-4,4diphenylene]-ditetrazolium chloride, Sigma). The mixture was then heated at 85 ◦C for 15 min, cooled, and the absorbance at 580 nm was measured (Polkowska-Kowalczyk et al.,2004).
The late blight-susceptible diploid Solanum tuberosum clone DG
81-68 (2n = 2x = 24) is a potato breeding line obtained in IHARPIB, Młochów Research Center, Poland. Seeds of the tetraploid wild species Solanum villosum Mill. (2n = 4x = 48), highly resistant to Phytophthora infestans, were provided by Warsaw Botanical Garden,Poland. The species origin is Birmingham, UK, and its accession no.is 4.
Axenic shoots of the parental species (received from IHAR-PIB, Młochów Research Center, Poland) and the generated interspecific somatic hybrids expressing differen t levels of resistance to the oomycete pathogen P. infestans were cultured in vitro as described previously (Polkowska-Kowalczyk et al., 2004). The plants grew under controlled conditions: day/light fluorescent lamp 150 mol m−2 s−1 for 16 h, day/nighttemperature of 22/18 ◦C.
The protoplasts isolated from leaves of the parental species were fused in the presence of polyethylene glycol according to Szczerbakowa et al. (2003a,b). The regenerated somatic hybrids were propagated and grown in vitro on MS/2 hormone-free medium (Murashige and Skoog, 1962) supplemented with 2% sucrose and 0.6% agar.
Random amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis
For verification ofthe hybridity,the RAPD analysis was used. The total genomic DNA was isolated from leaves of 3-week-old in vitro grown plants, following the modified cetyltrimethylammonium bromide protocol, as described by Szczerbakowa et al. (2003a). The molecular markers generated in the presence of decamer primer OPH-04 (5GGAAGTCGCC3) were used to confirmthe hybrid nature of the regenerated plants. The polymerase chain reaction (PCR) was carried out in an MJ Mini-Personal Thermal Cycler (Bio-Rad) in a total volume of 25 L of reaction mixture containing: 0.5 U Taq DNA polymerase (Perkin Elmer), 1× buffer (10 mM Tris–HCl, pH 8.3) and 1.5 mM MgCl2, 0.4 M primer, 0.25 mM of each dNTP (Roche Diagnostic), and the DNA template (15 ng). The reaction mixture was supplemented with sterile deionized water to total volume of 25 L. The PCR parameters were established according to Naess et al. (2001). The amplification products (12 L) were separated using electrophoresis in 1.5% agarose gel in 0.5× TBE buffer for 2 h at 90V at room temperature, stained with ethidium bromide (4 g/mL) and evaluated under UV (254 nm). A molecular size marker, 100-bp (Fermentas), was used.
Ploidy level determination
The ploidy level was determined first by counting the chloroplasts in guard cells on the leaf’s lower surface of soil-grown plants. The mean of at least 20 measurements was indicative of the ploidy of plants, as shown for potato by Jakuczun et al. (1997).
The chromosome number was determined directly by chromosome counting in metaphase spreads
Chromosome preparations
Young roots (2 cm long) were detached 7–10 days after the last passage and used for chromosome counting. The root tips were treated with 0.05% aqueous colchicine solution for 3 h to accumulate metaphases and then fixed with Carnoy solution (ethanol:acetic acid, v:v, 3:1) for at least 48 h at 4 ◦C. The fixed tissue was washed in 10 mM citric acid–sodium citrate buffer (pH4.8) for 15 min prior to digestion in an enzyme mixture of 1% cellulase Onozuka R-10 (Kinki Yakult MFG CO., Japan), 1% celulase from Aspergillus niger (0.32 U/mg, Serva), 20% pectolyase (0.70 U/mg, Serva) for 50 min at 37 ◦C. After incubation, the root tips were transferred to the citrate buffer for 15 min at 4 ◦C. Meristems were dissected out from root tips, squashed in drops of 45% acetic acid and frozen. The cover slips were removed and the preparations were dehydrated in a graded series of 70%, 80% and absoluteethanol and air dried. The slides were stained with 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; Sigma) andscreenedunder an Olympus IX70 fluorescent microscope with a CCD camera. Pictures were analyzed using the Analysis 3.0 program.
Genomic in situ hybridization (GISH) analysis
For hybrid genome composition analysis, GISH with total genomic DNAs from S. tuberosum and S. villosum as probes was used. DNA was isolated from leaves harvested from 3-week-old in vitro grown plants according to Doyle and Doyle (1987). Genomic DNA was sheared to a length of 1–10 kb and then labeled with digoxigenin-11-2-deoxy-uridine-5-triphosphate (Amersham) or biotin-16-2-deoxy-uridine-5-triphosphate (Roche) by nick translation.
GISH was performed according to the protocols of Schwarzacher and Heslop-Harrison (2000), with minor modifications. Briefly, the hybridization mixture, consisting of 100 ng of labeled DNA probe, 50% formamide, 10% dextran sulfate and 0.1 g/L of sheared salmon sperm DNA, was denatured for 10 min at 85 ◦C, then chilled on ice and applied to the chromosome preparation. The slides and hybridization mixture were denatured together at 72 ◦C for 5 min in an in situ Thermal Cycler (Thermo Hybrid, Franklin, MA, USA) and then allowed to hybridize for 48–72 h in a humid chamber at 37 ◦C. Stringent washes (10% formamide in 0.1× SSC at37 ◦C) were followed by immunodetection of labeled DNA probes with primary and secondary antibodies. Digoxigenin-labeled DNA probe was detected using fluorescein-conjugated anti-digoxigenin antibodies (Roche, Switzerland) and signals were amplified with fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjugated anti-sheep secondary antibodies (Jackson ImmunoResearch, UK). Biotin-labeled DNA probe was detected with Texas Red-conjugated anti-biotin antibodies (Jackson ImmunoResearch, UK) and signals were amplified with TexasRed-conjugated anti-mouse secondary antibodies (Jackson ImmunoResearch, UK). The preparations were mounted in Vectashield (Vector Laboratories, UK) containing 2 g/mL DAPI. At least 30 metaphase and interphase cells were examined foreach genotype. Selected spreads and interphase nuclei were photographed with a CCD camera attached to an Eclipse 800 Olympus epifluorescence microscope using UV excitation for DAPI visualization, blue light excitation for FITC-conjugated antibodies and green excitation for Texas Red labeled probes. Pictures were analyzed using the Lucia Orca program.
Assessment of late blight resistance
The resistance ofthe genotypes studied to oomycete pathogen P.infestans was evaluated using a detached leaflet assay as described by Zarzycka (2001). One of the most aggressive and virulent isolates of P. infestans (isolate MP324 from 1997, complex race:1.2.3.4.5.6.7.8.10.11, defined using Black’s differential set, A1 mating type and resistant to metalaxyl) received from IHAR-PIB,Młochów Research Center, Poland, was used as inoculum. Sporangia were collected in deionized water and adjusted to a standard concentration of 50 sporangia mm−3. Five to ten leaves from each genotype were tested on two different dates. The leaflets were placed upside-down on a plastic tray on the wet wood wool, and a drop of inoculum was placed near the midrib on each leaflet. Inoculated leaves were incubated at 16 ◦C under constant illumination of about 30 mol m−2 s−1. After six days of incubation, the resistance was evaluated using a 9-grade scale, where 9 indicated the highest resistance. Cultivars (cvs) Tarpan (susceptible) and Bzura (mid-resistant), as well as a diploid clone DG 94-15 (resistant), were used as standards.
The virulence of inoculum (on leaflets of Black’s differentials) and its aggressiveness (on cvs Bintje and Tarpan carrying no Rgenes) were examined in each test.
Pathogen elicitor
The pathogen P. infestans (isolate MP618 from 2005, of following race: 1.2.3.4.(5).6.7.10.11, A1 mating type and resistant to metalaxyl) received from IHAR-PIB, Młochów Research Center, Poland, was maintained on rye agar medium at 15 ◦C in the dark. A cuture filtrate (CF), which served as an elicitor, was prepared from the pathogen grown in liquid medium. After 6 weeks of growth, the medium was separated from the oomycete, dialyzed against water for 48 h, and lyophilized. The CF residue dissolved in distilled water was quantified as g glucose equivalents mL−1, as described in detail by Polkowska-Kowalczyk et al. (2004).
Elicitor treatment of leaves
Leaves harvested from 4-week-old in vitro plants were placed on moist filter paper in Petri dishes. The CF was applied in droplets on the surface of each leaf at a concentration of 0.67 g glucose equivalents g−1 FW. An appropriate volume of the elicitor was applied with a micropipette, in small droplets onto the abaxial leaf surface. In parallel, dishes with control leaves with an equal volume of distilled water in droplets were set up. Leaves were incubated at 25 ◦C under continuous light 150 150 mol m−2 s−1 supplied by fluorescent tubes (Pila, Poland) and kept for 6, 18, 30 h at 25 ◦C under continuous light (Polkowska-Kowalczyk et al., 2004). At given time intervals, the leaves were collected for analysis
Assay for reactive oxygen species (ROS) production
ROS production was evaluated by determining the reduction of nitroblue tetrazolium (NBT) in the medium by O•−2 released from leaf tissues (Doke, 1983). The leaves treated with CF and the control leaves treated with water were incubated for 1 h in a mixture containing NBT (2,2-di-p-nitrophenyl-5,5-diphenyl-[3,3-dimethoxy-4,4diphenylene]-ditetrazolium chloride, Sigma). The mixture was then heated at 85 ◦C for 15 min, cooled, and the absorbance at 580 nm was measured (Polkowska-Kowalczyk et al.,2004).
0/5000
วัสดุโรงงานไวต่อโรคนตอน diploid Solanum tuberosum โคลนกิจ81-68 (2n = 2 x = 24) เป็นมันฝรั่งที่ผสมพันธุ์ได้ใน IHARPIB ประเทศโปแลนด์ ศูนย์วิจัย Młochów บรรทัด เมล็ดพันธุ์ป่า tetraploid Solanum นารีอินทนนท์โรงสี (2n = 4 x = 48), สูงทนต่อไฟทอฟธอรา ได้จากสวนพฤกษศาสตร์วอร์ซอ โปแลนด์ กำเนิดสปีชีส์เป็นเบอร์มิงแฮม UK และ no.is ของทะเบียน 4ยอด axenic พันธุ์โดยผู้ปกครอง (ที่ได้รับจาก IHAR PIB ศูนย์วิจัย Młochów โปแลนด์) และการสร้าง interspecific somatic ลูกผสมแสดงระดับความต้านทานการศึกษา oomycete ทอฟธอรา P. differen t มีอ่างในหลอดอธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (Polkowska Kowalczyk et al., 2004) พืชเติบโตภายใต้สภาพควบคุม: หลอดฟลูออเรสเซนต์แสงวัน 150 s−1 m−2 โมลสำหรับ 16 h, วัน/nighttemperature ของ ◦C 22/18 โปที่แยกต่างหากจากใบของสายพันธุ์โดยผู้ปกครองถูก fused ในต่อหน้าของ polyethylene glycol ตาม Szczerbakowa et al. (2003a, b) ลูกผสม somatic regenerated ได้เผยแพร่ และเติบโตในการเพาะเลี้ยงบน MS/2 ฮอร์โมนฟรีขนาดกลาง (Murashige และ Skoog, 1962) เสริม ด้วย 2% ซูโครสและ 0.6% agarวิเคราะห์ดีเอ็นเอ (อาร์เอพีดี) การ polymorphic เอาต์ที่สุ่มสำหรับการตรวจสอบ hybridity มีใช้การวิเคราะห์การอาร์เอพีดี DNA genomic รวมถูกแยกต่างหากจากใบอายุ 3 สัปดาห์การเพาะเลี้ยงปลูก ตามโพรโทโบรไมด์ cetyltrimethylammonium แก้ไขตามที่อธิบายไว้โดย Szczerbakowa et al. (2003a) เครื่องหมายโมเลกุลที่สร้างขึ้นในต่อหน้าของพื้น decamer OPH-04 (5GGAAGTCGCC3) ถูกใช้เพื่อลักษณะพืช regenerated ไฮบริ confirmthe ปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรส (PCR) ได้ดำเนินการเป็น MJ ส่วนบุคคลมินิร้อน Cycler (ไบ-Rad) ในปริมาณรวมของ L 25 ประกอบด้วยส่วนผสมของปฏิกิริยา: 0.5 U Taq DNA พอลิเมอเรส (เพอร์เอลเมอ), (10 mM ตรี – HCl, pH 8.3) บัฟเฟอร์ 1 × และ 1.5 มม. MgCl2, 0.4 M พื้น 0.25 มม.แต่ละ dNTP (Roche วินิจฉัย), และดีเอ็นเอแม่แบบ (15 ng) ผสมปฏิกิริยาถูกเสริม ด้วยน้ำ deionized กอซปริมาตรรวมของ 25 L. พารามิเตอร์ PCR ได้ก่อตั้งตาม Naess et al. (2001) ผลิตภัณฑ์ขยาย (12 L) ได้แบ่งการใช้ electrophoresis ใน 1.5% agarose เจลในบัฟเฟอร์ TBE × 0.5 h 2 ที่ 90V ที่อุณหภูมิห้อง สีกับโบรไมด์ ethidium (4 g/mL) และประเมินภายใต้ UV (254 nm) ใช้กับขนาดโมเลกุลเครื่องหมาย 100 bp (Fermentas), พล็อยดีระดับกำหนดพล็อยดีระดับถูกกำหนดก่อน โดยนับ chloroplasts รักษาเซลล์บนพื้นผิวด้านล่างของใบของดินปลูกพืช ค่าเฉลี่ยของการวัดอย่างน้อย 20 ถูกส่อพล็อยดีของพืช แสดงสำหรับมันฝรั่งโดย Jakuczun et al. (1997)กำหนดจำนวนโครโมโซม โดยโครโมโซม metaphase แพร่กระจายการตรวจนับโดยตรงเตรียมโครโมโซมหนุ่มราก (2 ซมยาว) ถูกเดี่ยว 7 – 10 วันหลังจากเส้นทางสุดท้าย และใช้สำหรับการตรวจนับโครโมโซม เคล็ดลับรากรับแก้โคลชิซีนอควี 0.05% h 3 พอก metaphases และถาวรแล้ว ด้วย Carnoy โซลูชั่น (เอทานอล: กรดอะซิติก v: v, 3:1) สำหรับน้อย 48 h ที่ 4 ◦C เนื้อเยื่อถาวรถูกล้างใน 10 มม. – กรดซิตริกโซเดียมซิเตรตบัฟเฟอร์ (pH4.8) สำหรับ 15 นาทีก่อนที่จะย่อยอาหารในการผสมผสานระหว่างเอนไซม์ cellulase 1% Onozuka R-10 (คินกิยาคูลท์ MFG CO. ญี่ปุ่น), celulase 1% จากไนเจอร์ Aspergillus (U 0.32 มิลลิกรัม Serva), pectolyase 20% (U 0.70 มิลลิกรัม Serva) สำหรับ 50 นาทีที่ 37 ◦C หลังจากบ่ม เคล็ดลับรากถูกโอนย้ายไปซิเตรตบัฟเฟอร์สำหรับ 15 นาทีที่ 4 ◦C Meristems dissected ออกจากคำแนะนำราก squashed ในหยดกรดน้ำส้ม 45% และแช่แข็ง ครอบคลุมการจัดส่งถูกเอาออก และเตรียมจะถูกอบแห้งในชุดมีการจัดระดับ 70%, 80% และ absoluteethanol และอากาศแห้ง ภาพนิ่งถูกสี ด้วย 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI ซิกมา) andscreenedunder IX70 โอลิมปัสมีกล้องจุลทรรศน์เรืองแสงกับกล้อง CCD รูปภาพถูกวิเคราะห์โดยใช้โปรแกรมวิเคราะห์ 3.0Genomic ในซิ hybridization (GISH) วิเคราะห์สำหรับไฮบริกลุ่มองค์ประกอบการวิเคราะห์ มีใช้ GISH มีรวม genomic DNAs จาก S. tuberosum S. นารีอินทนนท์เป็นคลิปปากตะเข้ ดีเอ็นเอแยกต่างหากจากใบที่เก็บเกี่ยวจาก 3 สัปดาห์อายุในการปลูกพืชตามดอยล์และดอยล์ (1987) Genomic DNA ถูกตัดให้ความยาวของฐาน 1-10 และชื่อ digoxigenin-11-2-deoxy-uridine-5-triphosphate (Amersham) หรือ biotin-16-2-deoxy-uridine-5-triphosphate (Roche) โดยแปลนิคGISH ถูกปฏิบัติตามโพรโทคอล Schwarzacher และ Heslop-Harrison (2000), มีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย สั้น ๆ hybridization ผสม ประกอบด้วย 100 ng ของดีเอ็นเอโพรบที่ป้าย formamide 50%, 10% เดกซ์แทรนซัลเฟต และ 0.1 g/L ของตัดปลาแซลมอนสเปิร์ม DNA, denatured ใน 10 นาทีที่ 85 ◦C แล้วแช่ในน้ำแข็ง และนำไปใช้กับการเตรียมโครโมโซม ภาพนิ่งและส่วนผสม hybridization ถูก denatured กันที่ ◦C 72 สำหรับ 5 นาทีในการใน situ ร้อน Cycler (ผสมเทอร์โม แฟรงคลิน MA สหรัฐอเมริกา) และสามารถคือใน 48 – 72 h ในห้องชื้นที่ 37 ◦C เข้มข้น washes (10% formamide ใน 0.1 × SSC at37 ◦C) ได้ตาม immunodetection ของดีเอ็นเอคลิปปากตะเข้ป้ายกับแอนตี้หลัก และรอง ชื่อ Digoxigenin ดีเอ็นเอโพรบพบใช้แอนตี้ต่อต้าน-digoxigenin fluorescein กลวง (Roche สวิตเซอร์แลนด์) และมีขยายสัญญาณ ด้วย fluorescein isothiocyanate (FITC) -กลวงแกะป้องกันรองแอนตี้ (ImmunoResearch Jackson, UK) ชื่อไบโอตินดีเอ็นเอโพรบพบกับแอนตี้ไบโอตินป้องกันเท็กซัสแดงกลวง (Jackson ImmunoResearch, UK) และมีขยายสัญญาณ ด้วย TexasRed กลวงเมาส์ป้องกันรองแอนตี้ (Jackson ImmunoResearch, UK) เตรียมตัวถูกติดตั้งใน Vectashield (ห้องปฏิบัติการเวกเตอร์ UK) ประกอบด้วย 2 g/mL DAPI น้อย 30 เซลล์ metaphase และ interphase foreach กล่าวถึงลักษณะทางพันธุกรรมได้ เลือกแพร่กระจายและแอลฟา interphase ถูกถ่าย ด้วยกล้อง CCD กับกล้องจุลทรรศน์ epifluorescence คราส 800 โอลิมปัสใช้ในการกระตุ้น UV DAPI แสดงภาพประกอบเพลง บลูในการกระตุ้นไฟสำหรับแอนตี้ FITC กลวงและในการกระตุ้นสีเขียวสำหรับเท็กซัสแดงชื่อคลิปปากตะเข้ รูปภาพถูกวิเคราะห์โดยใช้โปรแกรม Orca ลูเซีย วัดความต้านทานโรคไหม้นตอนความต้านทานของการศึกษาการศึกษา oomycete P.infestans ถูกประเมินโดยใช้แบบทดสอบอุปกรณ์เดี่ยวตามที่อธิบายไว้ โดย Zarzycka (2001) One of the most aggressive and virulent isolates of P. infestans (isolate MP324 from 1997, complex race:1.2.3.4.5.6.7.8.10.11, defined using Black’s differential set, A1 mating type and resistant to metalaxyl) received from IHAR-PIB,Młochów Research Center, Poland, was used as inoculum. Sporangia ถูกรวบรวมไว้ในน้ำ deionized และปรับความเข้มข้นมาตรฐานของ 50 sporangia mm−3 5-10 ใบจากแต่ละลักษณะทางพันธุกรรมถูกทดสอบในวันที่แตกต่างกันสอง แผ่นพับถูกวางคว่ำลงในถาดพลาสติกบนขนไม้เปียก และหยด inoculum ถูกวางไว้ใกล้ midrib บนแต่ละอุปกรณ์ ใบ inoculated ที่ incubated ที่ 16 ◦C ภายใต้แสงสว่างคงที่ของประมาณ 30 โมล m−2 s−1 หลังจากวันที่หกของคณะทันตแพทยศาสตร์ ต่อต้านถูกประเมินโดยใช้สเกลแบบ 9 ชั้น ที่ 9 แสดงความต้านทานสูงสุด พันธุ์ (cvs) Tarpan (ไวต่อ) และ Bzura (กลางทน), เป็น diploid มีโคลน (ทน) กิจ 94-15 ถูกใช้เป็นมาตรฐานVirulence ของ inoculum (ตามแผ่นพับของดำของ differentials) และของ aggressiveness (ใน cvs Bintje และ Tarpan โดยไม่ Rgenes) ถูกตรวจสอบในการทดสอบแต่ละ Elicitor ศึกษาทอฟธอราศึกษา P. (แยก MP618 ตั้งแต่ปี 2548 การแข่งขันดังต่อไปนี้: 1.2.3.4. (5) .6.7.10.11, A1 ชนิดติดสัด และทนต่อ metalaxyl) รับจาก IHAR PIB ศูนย์วิจัย Młochów โปแลนด์ มีอยู่ในข้าวไรย์ agar กลางที่ 15 ◦C ในมืด เป็น cuture สารกรอง (CF), จะเป็น elicitor ผิด ถูกเตรียมจากศึกษาเติบโตขึ้นในของเหลว หลังจาก 6 สัปดาห์ของการเจริญเติบโต สื่อถูกแยกจาก oomycete, dialyzed กับน้ำ 48 h และ lyophilized สารตกค้าง CF ที่ละลายในน้ำกลั่นมี quantified เป็น g กลูโคสเทียบเท่า mL−1 ตามที่อธิบายไว้ในรายละเอียดโดย Polkowska Kowalczyk et al. (2004)รักษา elicitor ใบไม้ใบที่เก็บเกี่ยวจากพืชในการเพาะเลี้ยงอายุ 4 สัปดาห์ถูกวางไว้บนกระดาษกรองชุ่มชื่นในจาน Petri CF ถูกใช้ในหยดบนพื้นผิวของแต่ละใบที่ความเข้มข้นของเทียบเท่าน้ำตาลกลูโคส 0.67 g g−1 FW เป็น elicitor ในปริมาณที่เหมาะสมนำมาใช้กับ micropipette การ ในหยดเล็ก ๆ ลงบนผิวใบไม้ abaxial ขนาน อาหารพร้อมใบควบคุมการหยดน้ำกลั่นปริมาตรเท่ากับถูกตั้งค่า ใบไม้มี incubated ที่ 25 ◦C ภายใต้แสงต่อเนื่อง 150 150 โมล m−2 s−1 จากหลอดเรืองแสง (Pila โปแลนด์) และเก็บไว้สำหรับ 6, 18, 30 h ที่ 25 ◦C ภายใต้ไฟต่อเนื่อง (Polkowska Kowalczyk et al., 2004) ที่ให้ช่วงเวลา ใบไม้ถูกเก็บรวบรวมวิเคราะห์ทดสอบปฏิกิริยาออกซิเจน (ROS) ชนิดผลิตROS ผลิตถูกประเมิน โดยกำหนดลด tetrazolium nitroblue (เอ็นบีที) ในสื่อโดย O•−2 ออกจากเนื้อเยื่อใบ (Doke, 1983) ใบรับ CF และใบควบคุมที่รับน้ำได้ incubated สำหรับ h 1 ในส่วนผสมที่ประกอบด้วยเอ็นบีที (2,2-di-p-nitrophenyl-5,5-diphenyl-[3,3-dimethoxy-4,4diphenylene]-ditetrazolium คลอไรด์ ซิก) ส่วนผสมที่ร้อนแล้ว ◦C 85 สำหรับ 15 นาที ระบายความร้อนด้วย และ absorbance ที่ 580 nm มีวัด (Polkowska Kowalczyk et al., 2004)
การแปล กรุณารอสักครู่..
Plant material
The late blight-susceptible diploid Solanum tuberosum clone DG
81-68 (2n = 2x = 24) is a potato breeding line obtained in IHARPIB, Młochów Research Center, Poland. Seeds of the tetraploid wild species Solanum villosum Mill. (2n = 4x = 48), highly resistant to Phytophthora infestans, were provided by Warsaw Botanical Garden,Poland. The species origin is Birmingham, UK, and its accession no.is 4.
Axenic shoots of the parental species (received from IHAR-PIB, Młochów Research Center, Poland) and the generated interspecific somatic hybrids expressing differen t levels of resistance to the oomycete pathogen P. infestans were cultured in vitro as described previously (Polkowska-Kowalczyk et al., 2004). The plants grew under controlled conditions: day/light fluorescent lamp 150 mol m−2 s−1 for 16 h, day/nighttemperature of 22/18 ◦C.
The protoplasts isolated from leaves of the parental species were fused in the presence of polyethylene glycol according to Szczerbakowa et al. (2003a,b). The regenerated somatic hybrids were propagated and grown in vitro on MS/2 hormone-free medium (Murashige and Skoog, 1962) supplemented with 2% sucrose and 0.6% agar.
Random amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis
For verification ofthe hybridity,the RAPD analysis was used. The total genomic DNA was isolated from leaves of 3-week-old in vitro grown plants, following the modified cetyltrimethylammonium bromide protocol, as described by Szczerbakowa et al. (2003a). The molecular markers generated in the presence of decamer primer OPH-04 (5GGAAGTCGCC3) were used to confirmthe hybrid nature of the regenerated plants. The polymerase chain reaction (PCR) was carried out in an MJ Mini-Personal Thermal Cycler (Bio-Rad) in a total volume of 25 L of reaction mixture containing: 0.5 U Taq DNA polymerase (Perkin Elmer), 1× buffer (10 mM Tris–HCl, pH 8.3) and 1.5 mM MgCl2, 0.4 M primer, 0.25 mM of each dNTP (Roche Diagnostic), and the DNA template (15 ng). The reaction mixture was supplemented with sterile deionized water to total volume of 25 L. The PCR parameters were established according to Naess et al. (2001). The amplification products (12 L) were separated using electrophoresis in 1.5% agarose gel in 0.5× TBE buffer for 2 h at 90V at room temperature, stained with ethidium bromide (4 g/mL) and evaluated under UV (254 nm). A molecular size marker, 100-bp (Fermentas), was used.
Ploidy level determination
The ploidy level was determined first by counting the chloroplasts in guard cells on the leaf’s lower surface of soil-grown plants. The mean of at least 20 measurements was indicative of the ploidy of plants, as shown for potato by Jakuczun et al. (1997).
The chromosome number was determined directly by chromosome counting in metaphase spreads
Chromosome preparations
Young roots (2 cm long) were detached 7–10 days after the last passage and used for chromosome counting. The root tips were treated with 0.05% aqueous colchicine solution for 3 h to accumulate metaphases and then fixed with Carnoy solution (ethanol:acetic acid, v:v, 3:1) for at least 48 h at 4 ◦C. The fixed tissue was washed in 10 mM citric acid–sodium citrate buffer (pH4.8) for 15 min prior to digestion in an enzyme mixture of 1% cellulase Onozuka R-10 (Kinki Yakult MFG CO., Japan), 1% celulase from Aspergillus niger (0.32 U/mg, Serva), 20% pectolyase (0.70 U/mg, Serva) for 50 min at 37 ◦C. After incubation, the root tips were transferred to the citrate buffer for 15 min at 4 ◦C. Meristems were dissected out from root tips, squashed in drops of 45% acetic acid and frozen. The cover slips were removed and the preparations were dehydrated in a graded series of 70%, 80% and absoluteethanol and air dried. The slides were stained with 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; Sigma) andscreenedunder an Olympus IX70 fluorescent microscope with a CCD camera. Pictures were analyzed using the Analysis 3.0 program.
Genomic in situ hybridization (GISH) analysis
For hybrid genome composition analysis, GISH with total genomic DNAs from S. tuberosum and S. villosum as probes was used. DNA was isolated from leaves harvested from 3-week-old in vitro grown plants according to Doyle and Doyle (1987). Genomic DNA was sheared to a length of 1–10 kb and then labeled with digoxigenin-11-2-deoxy-uridine-5-triphosphate (Amersham) or biotin-16-2-deoxy-uridine-5-triphosphate (Roche) by nick translation.
GISH was performed according to the protocols of Schwarzacher and Heslop-Harrison (2000), with minor modifications. Briefly, the hybridization mixture, consisting of 100 ng of labeled DNA probe, 50% formamide, 10% dextran sulfate and 0.1 g/L of sheared salmon sperm DNA, was denatured for 10 min at 85 ◦C, then chilled on ice and applied to the chromosome preparation. The slides and hybridization mixture were denatured together at 72 ◦C for 5 min in an in situ Thermal Cycler (Thermo Hybrid, Franklin, MA, USA) and then allowed to hybridize for 48–72 h in a humid chamber at 37 ◦C. Stringent washes (10% formamide in 0.1× SSC at37 ◦C) were followed by immunodetection of labeled DNA probes with primary and secondary antibodies. Digoxigenin-labeled DNA probe was detected using fluorescein-conjugated anti-digoxigenin antibodies (Roche, Switzerland) and signals were amplified with fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjugated anti-sheep secondary antibodies (Jackson ImmunoResearch, UK). Biotin-labeled DNA probe was detected with Texas Red-conjugated anti-biotin antibodies (Jackson ImmunoResearch, UK) and signals were amplified with TexasRed-conjugated anti-mouse secondary antibodies (Jackson ImmunoResearch, UK). The preparations were mounted in Vectashield (Vector Laboratories, UK) containing 2 g/mL DAPI. At least 30 metaphase and interphase cells were examined foreach genotype. Selected spreads and interphase nuclei were photographed with a CCD camera attached to an Eclipse 800 Olympus epifluorescence microscope using UV excitation for DAPI visualization, blue light excitation for FITC-conjugated antibodies and green excitation for Texas Red labeled probes. Pictures were analyzed using the Lucia Orca program.
Assessment of late blight resistance
The resistance ofthe genotypes studied to oomycete pathogen P.infestans was evaluated using a detached leaflet assay as described by Zarzycka (2001). One of the most aggressive and virulent isolates of P. infestans (isolate MP324 from 1997, complex race:1.2.3.4.5.6.7.8.10.11, defined using Black’s differential set, A1 mating type and resistant to metalaxyl) received from IHAR-PIB,Młochów Research Center, Poland, was used as inoculum. Sporangia were collected in deionized water and adjusted to a standard concentration of 50 sporangia mm−3. Five to ten leaves from each genotype were tested on two different dates. The leaflets were placed upside-down on a plastic tray on the wet wood wool, and a drop of inoculum was placed near the midrib on each leaflet. Inoculated leaves were incubated at 16 ◦C under constant illumination of about 30 mol m−2 s−1. After six days of incubation, the resistance was evaluated using a 9-grade scale, where 9 indicated the highest resistance. Cultivars (cvs) Tarpan (susceptible) and Bzura (mid-resistant), as well as a diploid clone DG 94-15 (resistant), were used as standards.
The virulence of inoculum (on leaflets of Black’s differentials) and its aggressiveness (on cvs Bintje and Tarpan carrying no Rgenes) were examined in each test.
Pathogen elicitor
The pathogen P. infestans (isolate MP618 from 2005, of following race: 1.2.3.4.(5).6.7.10.11, A1 mating type and resistant to metalaxyl) received from IHAR-PIB, Młochów Research Center, Poland, was maintained on rye agar medium at 15 ◦C in the dark. A cuture filtrate (CF), which served as an elicitor, was prepared from the pathogen grown in liquid medium. After 6 weeks of growth, the medium was separated from the oomycete, dialyzed against water for 48 h, and lyophilized. The CF residue dissolved in distilled water was quantified as g glucose equivalents mL−1, as described in detail by Polkowska-Kowalczyk et al. (2004).
Elicitor treatment of leaves
Leaves harvested from 4-week-old in vitro plants were placed on moist filter paper in Petri dishes. The CF was applied in droplets on the surface of each leaf at a concentration of 0.67 g glucose equivalents g−1 FW. An appropriate volume of the elicitor was applied with a micropipette, in small droplets onto the abaxial leaf surface. In parallel, dishes with control leaves with an equal volume of distilled water in droplets were set up. Leaves were incubated at 25 ◦C under continuous light 150 150 mol m−2 s−1 supplied by fluorescent tubes (Pila, Poland) and kept for 6, 18, 30 h at 25 ◦C under continuous light (Polkowska-Kowalczyk et al., 2004). At given time intervals, the leaves were collected for analysis
Assay for reactive oxygen species (ROS) production
ROS production was evaluated by determining the reduction of nitroblue tetrazolium (NBT) in the medium by O•−2 released from leaf tissues (Doke, 1983). The leaves treated with CF and the control leaves treated with water were incubated for 1 h in a mixture containing NBT (2,2-di-p-nitrophenyl-5,5-diphenyl-[3,3-dimethoxy-4,4diphenylene]-ditetrazolium chloride, Sigma). The mixture was then heated at 85 ◦C for 15 min, cooled, and the absorbance at 580 nm was measured (Polkowska-Kowalczyk et al.,2004).
The late blight-susceptible diploid Solanum tuberosum clone DG
81-68 (2n = 2x = 24) is a potato breeding line obtained in IHARPIB, Młochów Research Center, Poland. Seeds of the tetraploid wild species Solanum villosum Mill. (2n = 4x = 48), highly resistant to Phytophthora infestans, were provided by Warsaw Botanical Garden,Poland. The species origin is Birmingham, UK, and its accession no.is 4.
Axenic shoots of the parental species (received from IHAR-PIB, Młochów Research Center, Poland) and the generated interspecific somatic hybrids expressing differen t levels of resistance to the oomycete pathogen P. infestans were cultured in vitro as described previously (Polkowska-Kowalczyk et al., 2004). The plants grew under controlled conditions: day/light fluorescent lamp 150 mol m−2 s−1 for 16 h, day/nighttemperature of 22/18 ◦C.
The protoplasts isolated from leaves of the parental species were fused in the presence of polyethylene glycol according to Szczerbakowa et al. (2003a,b). The regenerated somatic hybrids were propagated and grown in vitro on MS/2 hormone-free medium (Murashige and Skoog, 1962) supplemented with 2% sucrose and 0.6% agar.
Random amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis
For verification ofthe hybridity,the RAPD analysis was used. The total genomic DNA was isolated from leaves of 3-week-old in vitro grown plants, following the modified cetyltrimethylammonium bromide protocol, as described by Szczerbakowa et al. (2003a). The molecular markers generated in the presence of decamer primer OPH-04 (5GGAAGTCGCC3) were used to confirmthe hybrid nature of the regenerated plants. The polymerase chain reaction (PCR) was carried out in an MJ Mini-Personal Thermal Cycler (Bio-Rad) in a total volume of 25 L of reaction mixture containing: 0.5 U Taq DNA polymerase (Perkin Elmer), 1× buffer (10 mM Tris–HCl, pH 8.3) and 1.5 mM MgCl2, 0.4 M primer, 0.25 mM of each dNTP (Roche Diagnostic), and the DNA template (15 ng). The reaction mixture was supplemented with sterile deionized water to total volume of 25 L. The PCR parameters were established according to Naess et al. (2001). The amplification products (12 L) were separated using electrophoresis in 1.5% agarose gel in 0.5× TBE buffer for 2 h at 90V at room temperature, stained with ethidium bromide (4 g/mL) and evaluated under UV (254 nm). A molecular size marker, 100-bp (Fermentas), was used.
Ploidy level determination
The ploidy level was determined first by counting the chloroplasts in guard cells on the leaf’s lower surface of soil-grown plants. The mean of at least 20 measurements was indicative of the ploidy of plants, as shown for potato by Jakuczun et al. (1997).
The chromosome number was determined directly by chromosome counting in metaphase spreads
Chromosome preparations
Young roots (2 cm long) were detached 7–10 days after the last passage and used for chromosome counting. The root tips were treated with 0.05% aqueous colchicine solution for 3 h to accumulate metaphases and then fixed with Carnoy solution (ethanol:acetic acid, v:v, 3:1) for at least 48 h at 4 ◦C. The fixed tissue was washed in 10 mM citric acid–sodium citrate buffer (pH4.8) for 15 min prior to digestion in an enzyme mixture of 1% cellulase Onozuka R-10 (Kinki Yakult MFG CO., Japan), 1% celulase from Aspergillus niger (0.32 U/mg, Serva), 20% pectolyase (0.70 U/mg, Serva) for 50 min at 37 ◦C. After incubation, the root tips were transferred to the citrate buffer for 15 min at 4 ◦C. Meristems were dissected out from root tips, squashed in drops of 45% acetic acid and frozen. The cover slips were removed and the preparations were dehydrated in a graded series of 70%, 80% and absoluteethanol and air dried. The slides were stained with 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; Sigma) andscreenedunder an Olympus IX70 fluorescent microscope with a CCD camera. Pictures were analyzed using the Analysis 3.0 program.
Genomic in situ hybridization (GISH) analysis
For hybrid genome composition analysis, GISH with total genomic DNAs from S. tuberosum and S. villosum as probes was used. DNA was isolated from leaves harvested from 3-week-old in vitro grown plants according to Doyle and Doyle (1987). Genomic DNA was sheared to a length of 1–10 kb and then labeled with digoxigenin-11-2-deoxy-uridine-5-triphosphate (Amersham) or biotin-16-2-deoxy-uridine-5-triphosphate (Roche) by nick translation.
GISH was performed according to the protocols of Schwarzacher and Heslop-Harrison (2000), with minor modifications. Briefly, the hybridization mixture, consisting of 100 ng of labeled DNA probe, 50% formamide, 10% dextran sulfate and 0.1 g/L of sheared salmon sperm DNA, was denatured for 10 min at 85 ◦C, then chilled on ice and applied to the chromosome preparation. The slides and hybridization mixture were denatured together at 72 ◦C for 5 min in an in situ Thermal Cycler (Thermo Hybrid, Franklin, MA, USA) and then allowed to hybridize for 48–72 h in a humid chamber at 37 ◦C. Stringent washes (10% formamide in 0.1× SSC at37 ◦C) were followed by immunodetection of labeled DNA probes with primary and secondary antibodies. Digoxigenin-labeled DNA probe was detected using fluorescein-conjugated anti-digoxigenin antibodies (Roche, Switzerland) and signals were amplified with fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjugated anti-sheep secondary antibodies (Jackson ImmunoResearch, UK). Biotin-labeled DNA probe was detected with Texas Red-conjugated anti-biotin antibodies (Jackson ImmunoResearch, UK) and signals were amplified with TexasRed-conjugated anti-mouse secondary antibodies (Jackson ImmunoResearch, UK). The preparations were mounted in Vectashield (Vector Laboratories, UK) containing 2 g/mL DAPI. At least 30 metaphase and interphase cells were examined foreach genotype. Selected spreads and interphase nuclei were photographed with a CCD camera attached to an Eclipse 800 Olympus epifluorescence microscope using UV excitation for DAPI visualization, blue light excitation for FITC-conjugated antibodies and green excitation for Texas Red labeled probes. Pictures were analyzed using the Lucia Orca program.
Assessment of late blight resistance
The resistance ofthe genotypes studied to oomycete pathogen P.infestans was evaluated using a detached leaflet assay as described by Zarzycka (2001). One of the most aggressive and virulent isolates of P. infestans (isolate MP324 from 1997, complex race:1.2.3.4.5.6.7.8.10.11, defined using Black’s differential set, A1 mating type and resistant to metalaxyl) received from IHAR-PIB,Młochów Research Center, Poland, was used as inoculum. Sporangia were collected in deionized water and adjusted to a standard concentration of 50 sporangia mm−3. Five to ten leaves from each genotype were tested on two different dates. The leaflets were placed upside-down on a plastic tray on the wet wood wool, and a drop of inoculum was placed near the midrib on each leaflet. Inoculated leaves were incubated at 16 ◦C under constant illumination of about 30 mol m−2 s−1. After six days of incubation, the resistance was evaluated using a 9-grade scale, where 9 indicated the highest resistance. Cultivars (cvs) Tarpan (susceptible) and Bzura (mid-resistant), as well as a diploid clone DG 94-15 (resistant), were used as standards.
The virulence of inoculum (on leaflets of Black’s differentials) and its aggressiveness (on cvs Bintje and Tarpan carrying no Rgenes) were examined in each test.
Pathogen elicitor
The pathogen P. infestans (isolate MP618 from 2005, of following race: 1.2.3.4.(5).6.7.10.11, A1 mating type and resistant to metalaxyl) received from IHAR-PIB, Młochów Research Center, Poland, was maintained on rye agar medium at 15 ◦C in the dark. A cuture filtrate (CF), which served as an elicitor, was prepared from the pathogen grown in liquid medium. After 6 weeks of growth, the medium was separated from the oomycete, dialyzed against water for 48 h, and lyophilized. The CF residue dissolved in distilled water was quantified as g glucose equivalents mL−1, as described in detail by Polkowska-Kowalczyk et al. (2004).
Elicitor treatment of leaves
Leaves harvested from 4-week-old in vitro plants were placed on moist filter paper in Petri dishes. The CF was applied in droplets on the surface of each leaf at a concentration of 0.67 g glucose equivalents g−1 FW. An appropriate volume of the elicitor was applied with a micropipette, in small droplets onto the abaxial leaf surface. In parallel, dishes with control leaves with an equal volume of distilled water in droplets were set up. Leaves were incubated at 25 ◦C under continuous light 150 150 mol m−2 s−1 supplied by fluorescent tubes (Pila, Poland) and kept for 6, 18, 30 h at 25 ◦C under continuous light (Polkowska-Kowalczyk et al., 2004). At given time intervals, the leaves were collected for analysis
Assay for reactive oxygen species (ROS) production
ROS production was evaluated by determining the reduction of nitroblue tetrazolium (NBT) in the medium by O•−2 released from leaf tissues (Doke, 1983). The leaves treated with CF and the control leaves treated with water were incubated for 1 h in a mixture containing NBT (2,2-di-p-nitrophenyl-5,5-diphenyl-[3,3-dimethoxy-4,4diphenylene]-ditetrazolium chloride, Sigma). The mixture was then heated at 85 ◦C for 15 min, cooled, and the absorbance at 580 nm was measured (Polkowska-Kowalczyk et al.,2004).
การแปล กรุณารอสักครู่..
วัสดุจากพืช
สายไหม้เสี่ยงเกิดโซลานัม tuberosum โคลน DG
81-68 ( 2n = 2x = 24 ) เป็นสายที่ได้รับใน iharpib มันฝรั่งพันธุ์ศูนย์วิจัยม. łและó W โปแลนด์ เมล็ดพันธุ์ไม้ป่าโซลานัม villosum เตตราพล ด์ โรงสี ( 2n = 4x = 48 ) สูงป้องกันโรคอินเฟสทันส , โดยสวนพฤกษศาสตร์วอร์ซอ , โปแลนด์ ชนิดที่มาคือ เบอร์มิงแฮม , สหราชอาณาจักรและการ no.is 4
axenic ยิงชนิดของผู้ปกครอง ( ที่ได้รับจาก ihar-pib ศูนย์วิจัย ม. łและó W โปแลนด์ ) และสร้างเซลล์ลูกผสม interspecific แสดงคิดทีระดับของความต้านทานต่อเชื้อ P . อินเฟสทันสโอไมซีตได้เพาะเลี้ยงในหลอดทดลองตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ( polkowska kowalczyk et al . , 2004 ) พืชที่เติบโตภายใต้สภาวะควบคุม :วัน / แสงฟลูออเรสเซนต์ 150 mol m − 2 s − 1 สำหรับ 16 ชั่วโมง / วัน nighttemperature 22 / 18 ◦ C .
เลสที่แยกได้จากใบของสายพันธุ์พ่อแม่ผสมในการแสดงตนของ polyethylene glycol ตาม szczerbakowa et al . ( 2003a , B ) สร้างใหม่ส่วนลูกผสมถูกขยายพันธุ์และเติบโตในหลอดทดลองบน MS / 2 ฮอร์โมนฟรี ( อาหารสูตร Murashige and Skoog medium ,1962 ) ที่เติมซูโครส 2% และ 1.5% วุ้น
Amplified Polymorphic DNA ( RAPD ) การวิเคราะห์
สำหรับการตรวจสอบของ Hybridity การวิเคราะห์โดยใช้ ดีเอ็นเอจีโนมทั้งหมดที่แยกได้จากใบ 3-week-old ในหลอดทดลองปลูกพืช ตามพิธีสารแก้ไข cetyltrimethylammonium โบรไมด์ , ตามที่อธิบายไว้โดย szczerbakowa et al . ( 2003a )เครื่องหมายโมเลกุลที่สร้างขึ้นในการแสดงตนของ decamer รองพื้น oph-04 ( 5ggaagtcgcc3 ) ถูกใช้เพื่อ confirmthe ลูกผสมธรรมชาติของต้นข้าว . ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอร์เรส ( พีซีอาร์ ) ได้ดำเนินการใน MJ Mini ส่วนตัวความร้อนรอบ ( ไบโอ ราด ) ในปริมาตร 25 ลิตรปฏิกิริยาผสมที่ประกอบด้วย : 0.5 วูทัค DNA polymerase ( เพอร์กินเอลเมอร์ ) 1 ×บัฟเฟอร์ ( 10 มม. นอกจากนี้ – HCl , pH 8.3 ) และ 1ชุด 5 มม. , 0.4 เมตร รองพื้น 0.25 มม. ของแต่ละ dntp ( โรชวินิจฉัย ) และดีเอ็นเอแม่แบบ ( 15 กรัม ) ปฏิกิริยาผสมเสริมด้วยเป็นหมันคล้ายเนื้อเยื่อประสานน้ำ 25 ลิตร และปริมาณรวมของตัวแปรตาม naess et al . ( 2001 ) ผลิตภัณฑ์เด็ก ( 12 ลิตร ) ถูกแยกจากกันโดยใช้ electrophoresis ใน 1.5 % เจลใน 05 ×ทีบีบัฟเฟอร์ 2 H ที่ 90v ที่อุณหภูมิห้อง เปื้อนทิเดียมโบรไมด์ ( 4 กรัม / มิลลิลิตร ) และประเมินภายใต้แสงยูวี 254 nm ) เครื่องหมายโมเลกุลขนาด 100 BP ( fermentas ) , ใช้
การกำหนดระดับการกำหนดระดับแรก โดยนับคลอโรพลาสต์ในเซลล์คุมบนใบล่างพื้นผิวของดินที่ใช้ปลูกพืชเฉลี่ยอย่างน้อย 20 วัดเป็นจํานวนของการของพืช แสดงเป็น มันฝรั่ง โดย jakuczun et al . ( 1997 )
โครโมโซมถูกกำหนดโดยตรง โดยโครโมโซมในโครโมโซมนับกระจาย
หนุ่มเตรียมโครโมโซมราก ( ยาว 2 ซม. ) เป็นบ้านเดี่ยว 7 – 10 วันหลังจากที่ทางสุดท้าย และใช้สำหรับการนับโครโมโซม รากเคล็ดลับรักษาด้วย 005 % สารละลายโคลชิซินโซลูชันสำหรับ 3 ชั่วโมงสะสม metaphases แล้วแก้ไขด้วย carnoy โซลูชั่น ( เอทานอล : กรด , V : V , 3 : 1 ) เป็นเวลาอย่างน้อย 48 ชั่วโมง ที่ 4 ◦ C ซ่อมเนื้อเยื่อล้าง 10 มม. กรดซิตริกและโซเดียมซิเตรตบัฟเฟอร์ ( ph4.8 ) เป็นเวลา 15 นาทีก่อนที่จะย่อยอาหารเอนไซม์ส่วนผสมของ 1% cellulase onozuka r-10 ( Kinki ยาคูลท์ Mfg Co . , Japan ) celulase 1% จาก Aspergillus niger ( 0.32 U / mg ,
สายไหม้เสี่ยงเกิดโซลานัม tuberosum โคลน DG
81-68 ( 2n = 2x = 24 ) เป็นสายที่ได้รับใน iharpib มันฝรั่งพันธุ์ศูนย์วิจัยม. łและó W โปแลนด์ เมล็ดพันธุ์ไม้ป่าโซลานัม villosum เตตราพล ด์ โรงสี ( 2n = 4x = 48 ) สูงป้องกันโรคอินเฟสทันส , โดยสวนพฤกษศาสตร์วอร์ซอ , โปแลนด์ ชนิดที่มาคือ เบอร์มิงแฮม , สหราชอาณาจักรและการ no.is 4
axenic ยิงชนิดของผู้ปกครอง ( ที่ได้รับจาก ihar-pib ศูนย์วิจัย ม. łและó W โปแลนด์ ) และสร้างเซลล์ลูกผสม interspecific แสดงคิดทีระดับของความต้านทานต่อเชื้อ P . อินเฟสทันสโอไมซีตได้เพาะเลี้ยงในหลอดทดลองตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ( polkowska kowalczyk et al . , 2004 ) พืชที่เติบโตภายใต้สภาวะควบคุม :วัน / แสงฟลูออเรสเซนต์ 150 mol m − 2 s − 1 สำหรับ 16 ชั่วโมง / วัน nighttemperature 22 / 18 ◦ C .
เลสที่แยกได้จากใบของสายพันธุ์พ่อแม่ผสมในการแสดงตนของ polyethylene glycol ตาม szczerbakowa et al . ( 2003a , B ) สร้างใหม่ส่วนลูกผสมถูกขยายพันธุ์และเติบโตในหลอดทดลองบน MS / 2 ฮอร์โมนฟรี ( อาหารสูตร Murashige and Skoog medium ,1962 ) ที่เติมซูโครส 2% และ 1.5% วุ้น
Amplified Polymorphic DNA ( RAPD ) การวิเคราะห์
สำหรับการตรวจสอบของ Hybridity การวิเคราะห์โดยใช้ ดีเอ็นเอจีโนมทั้งหมดที่แยกได้จากใบ 3-week-old ในหลอดทดลองปลูกพืช ตามพิธีสารแก้ไข cetyltrimethylammonium โบรไมด์ , ตามที่อธิบายไว้โดย szczerbakowa et al . ( 2003a )เครื่องหมายโมเลกุลที่สร้างขึ้นในการแสดงตนของ decamer รองพื้น oph-04 ( 5ggaagtcgcc3 ) ถูกใช้เพื่อ confirmthe ลูกผสมธรรมชาติของต้นข้าว . ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอร์เรส ( พีซีอาร์ ) ได้ดำเนินการใน MJ Mini ส่วนตัวความร้อนรอบ ( ไบโอ ราด ) ในปริมาตร 25 ลิตรปฏิกิริยาผสมที่ประกอบด้วย : 0.5 วูทัค DNA polymerase ( เพอร์กินเอลเมอร์ ) 1 ×บัฟเฟอร์ ( 10 มม. นอกจากนี้ – HCl , pH 8.3 ) และ 1ชุด 5 มม. , 0.4 เมตร รองพื้น 0.25 มม. ของแต่ละ dntp ( โรชวินิจฉัย ) และดีเอ็นเอแม่แบบ ( 15 กรัม ) ปฏิกิริยาผสมเสริมด้วยเป็นหมันคล้ายเนื้อเยื่อประสานน้ำ 25 ลิตร และปริมาณรวมของตัวแปรตาม naess et al . ( 2001 ) ผลิตภัณฑ์เด็ก ( 12 ลิตร ) ถูกแยกจากกันโดยใช้ electrophoresis ใน 1.5 % เจลใน 05 ×ทีบีบัฟเฟอร์ 2 H ที่ 90v ที่อุณหภูมิห้อง เปื้อนทิเดียมโบรไมด์ ( 4 กรัม / มิลลิลิตร ) และประเมินภายใต้แสงยูวี 254 nm ) เครื่องหมายโมเลกุลขนาด 100 BP ( fermentas ) , ใช้
การกำหนดระดับการกำหนดระดับแรก โดยนับคลอโรพลาสต์ในเซลล์คุมบนใบล่างพื้นผิวของดินที่ใช้ปลูกพืชเฉลี่ยอย่างน้อย 20 วัดเป็นจํานวนของการของพืช แสดงเป็น มันฝรั่ง โดย jakuczun et al . ( 1997 )
โครโมโซมถูกกำหนดโดยตรง โดยโครโมโซมในโครโมโซมนับกระจาย
หนุ่มเตรียมโครโมโซมราก ( ยาว 2 ซม. ) เป็นบ้านเดี่ยว 7 – 10 วันหลังจากที่ทางสุดท้าย และใช้สำหรับการนับโครโมโซม รากเคล็ดลับรักษาด้วย 005 % สารละลายโคลชิซินโซลูชันสำหรับ 3 ชั่วโมงสะสม metaphases แล้วแก้ไขด้วย carnoy โซลูชั่น ( เอทานอล : กรด , V : V , 3 : 1 ) เป็นเวลาอย่างน้อย 48 ชั่วโมง ที่ 4 ◦ C ซ่อมเนื้อเยื่อล้าง 10 มม. กรดซิตริกและโซเดียมซิเตรตบัฟเฟอร์ ( ph4.8 ) เป็นเวลา 15 นาทีก่อนที่จะย่อยอาหารเอนไซม์ส่วนผสมของ 1% cellulase onozuka r-10 ( Kinki ยาคูลท์ Mfg Co . , Japan ) celulase 1% จาก Aspergillus niger ( 0.32 U / mg ,
การแปล กรุณารอสักครู่..
ภาษาอื่น ๆ
การสนับสนุนเครื่องมือแปลภาษา: กรีก, กันนาดา, กาลิเชียน, คลิงออน, คอร์สิกา, คาซัค, คาตาลัน, คินยารวันดา, คีร์กิซ, คุชราต, จอร์เจีย, จีน, จีนดั้งเดิม, ชวา, ชิเชวา, ซามัว, ซีบัวโน, ซุนดา, ซูลู, ญี่ปุ่น, ดัตช์, ตรวจหาภาษา, ตุรกี, ทมิฬ, ทาจิก, ทาทาร์, นอร์เวย์, บอสเนีย, บัลแกเรีย, บาสก์, ปัญจาป, ฝรั่งเศส, พาชตู, ฟริเชียน, ฟินแลนด์, ฟิลิปปินส์, ภาษาอินโดนีเซี, มองโกเลีย, มัลทีส, มาซีโดเนีย, มาราฐี, มาลากาซี, มาลายาลัม, มาเลย์, ม้ง, ยิดดิช, ยูเครน, รัสเซีย, ละติน, ลักเซมเบิร์ก, ลัตเวีย, ลาว, ลิทัวเนีย, สวาฮิลี, สวีเดน, สิงหล, สินธี, สเปน, สโลวัก, สโลวีเนีย, อังกฤษ, อัมฮาริก, อาร์เซอร์ไบจัน, อาร์เมเนีย, อาหรับ, อิกโบ, อิตาลี, อุยกูร์, อุสเบกิสถาน, อูรดู, ฮังการี, ฮัวซา, ฮาวาย, ฮินดี, ฮีบรู, เกลิกสกอต, เกาหลี, เขมร, เคิร์ด, เช็ก, เซอร์เบียน, เซโซโท, เดนมาร์ก, เตลูกู, เติร์กเมน, เนปาล, เบงกอล, เบลารุส, เปอร์เซีย, เมารี, เมียนมา (พม่า), เยอรมัน, เวลส์, เวียดนาม, เอสเปอแรนโต, เอสโทเนีย, เฮติครีโอล, แอฟริกา, แอลเบเนีย, โคซา, โครเอเชีย, โชนา, โซมาลี, โปรตุเกส, โปแลนด์, โยรูบา, โรมาเนีย, โอเดีย (โอริยา), ไทย, ไอซ์แลนด์, ไอร์แลนด์, การแปลภาษา.
- medium may also be turned yellow
- Students have the patience to listen and
- เรื่องที่คุณร้องขอ ฉันอาจทำได้บางอย่าง อ
- ประชดฉันหรอ
- Overall visual quality was scored based
- สีไม่ได้มีความหมายที่ตายตัว
- 난 그녀를 너무 사랑해
- with to
- ขึ้นอยู่ที่เราจะให้ความหมายมันUp to us t
- Feel bad - but have to
- exploring
- ไปหาหมอก่อน
- if those are like this too, if everyone
- the corner room
- ฉันมีเรื่องราว และคำถามมากมาย อยากคุยกับ
- Participate in tree planting activity ar
- if those are like this too, if everyone
- 抱着枕头边
- other foreignmatter were then hand-picke
- พวกเราจะรณรงค์การใช้ห้องน้ำมหาวิทยาลัยเก
- Depends of you
- คุณทำดีแล้วช่วยกันประหยัด
- ฉันควรจะรักต่อไปไห
- Don't cut off
