Identification of three new P450 ge

Identification of three new P450 genes
Using DDRT-PCR, the cDNA bands which were over-represented
in the resistant strain BJD than in susceptible strain TJS were recovered
and sequenced. Three of the isolated 52 cDNA fragments were
identified to be partial sequences of new P450 cDNA. To obtain
more information about the three putative P450 genes, the full
cDNAs and 50-flanking regions were isolated. 50-RACE was applied
to clone the 50 ends of the three genes. The full length cDNAs of the
three genes were verified by PCR using the primer pairs designed
based on the spliced sequences.The three newly identified P450 genes were named CYP6A40,
CYP6D8 and CYP6G4 (P450 nomenclature committee, accession
number: FJ911555, FJ911557 and FJ911556), encoding proteins of
515, 514 and 519 amino acids respectively. The putative protein
sequence of each gene had a highly hydrophobic N- terminus
which is a characteristic of membrane-bound P450 proteins. The
five conserved motifs (FXXGXRXCXG/A,WXXXR, GXE/DTT/S, EXXR,
PXXF) of P450 protein, which retain the conservation of structure
and function during evolution [26], were identified in the deduced
protein sequences of CYP6A40, CYP6D8 and CYP6G4 (Figs. 1–3).
The motif FXXGXRXCXG/A in the heme-binding region is the signature
of P450 proteins, and the cysteine residue in this motif is
known as the ligand for heme iron. The motif WXXXR is located
in a C-helix, which is conserved in most eukaryotic P450s. The oxygen-
binding motif (GXE/DTT/S) is known to participate proton
transfer. The EXXR motif located in K-helix, and the PXXF motif
found to be part of the meander before the heme thiolate ligand,
are considered to form salt-bridge to stabilize P450 protein
structure.
The promoter regions of three genes from the TJS strain were
obtained using the method of DNA Walking. The 1500 bp sequences
before the initiation codon were analyzed by TFSEARCH.
The transcription initiation sites were predicted according to conserved
arthropod promoter initiators (Inrs) which were suggested
to play an important role in transcription initiation [27]. The TATA
box was found near the upstream of the presumed Inr in CYP6D8
and CYP6G4, but was absent in CYP6A40. Several important transcription
factor binding sites (e.g. CRE, GATA, HSF, CdxA, Dfd,
Oct-1, C/EBP) were predicted (Figs. 1–3).
Comparing the deduced protein sequences between TJS and
BJD, four amino acid differences (346Q/T, 353V/E, 399G/D and
480K/N) were found in CYP6A40, five amino acid changes (204F/
L, 225F/I, 295T/K, 329I/L, and 447E/D) were found in CYP6D8, and
two amino acid differences (330D/E and 360N/S) were found in
CYP6G4. Whether these amino acid substitutions affect the activity
of these P450s is worthy of further investigation.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

รหัสของยีน P450 ใหม่ 3ใช้ DDRT-PCR วง cDNA ที่ได้แสดงมากเกินไปในการป้องกันสายพันธุ์ BJD มากกว่าในต้องใช้ไวต่อ ทีเจเอสถูกกู้คืนและตามลำดับ สามแยกชิ้นส่วน cDNA 52 ได้ระบุเป็น ลำดับบางส่วนของ cDNA P450 ใหม่ จะได้รับข้อมูลเพิ่มเติมเกี่ยวกับสาม putative P450 ยีน เต็มcDNAs และ 50 flanking ภูมิภาคถูกแยก ใช้แข่งขัน 50การโคลน 50 การสิ้นสุดของยีนสาม CDNAs ความยาวเต็มรูปแบบของการยีน 3 ถูกตรวจสอบ โดย PCR ใช้คู่รองพื้นมาตามลำดับ spliced P450 ยีนใหม่ระบุสามมีชื่อว่า CYP6A40CYP6D8 และ CYP6G4 (P450 ระบบการตั้งชื่อกรรมการ ทะเบียนหมายเลข: FJ911555, FJ911557 และ FJ911556), การเข้ารหัสโปรตีนของ515, 514 ซอย และ 519 กรดอะมิโนตามลำดับ โปรตีน putativeลำดับของแต่ละยีนมีนัส N hydrophobic สูงซึ่งเป็นลักษณะของโปรตีนเมมเบรนแบบผูก P450 ที่ห้าอยู่โดดเด่น (FXXGXRXCXG/A, WXXXR, GXE DTT/S, EXXRPXXF) ของโปรตีน P450 ซึ่งรักษาอนุรักษ์ของโครงสร้างและระบุฟังก์ชันระหว่างวิวัฒนาการ [26], ในการ deducedลำดับโปรตีนของ CYP6A40, CYP6D8 และ CYP6G4 (Figs. 1-3)แปลน FXXGXRXCXG/ใน ภูมิภาค heme ผูกเป็นลายเซ็นP450 โปรตีน และ cysteine จะ เป็นสารตกค้างในแปลนนี้หรือที่เรียกว่าลิแกนด์สำหรับ heme เหล็ก แปลน WXXXR อยู่ในแบบ C-เกลียว ที่อยู่อาศัยใน eukaryotic สุด P450s ออกซิเจน-รวมแปลน (GXE/DTT/S) เรียกว่าโปรตอนมีส่วนร่วมการโอนย้าย สาระสำคัญ EXXR ที่อยู่ในเกลียว K และแปลน PXXFพบเป็น ส่วนหนึ่งของคดเคี้ยวก่อนลิแกนด์ heme thiolateถือว่าฟอร์มเกลือสะพานเพื่อรักษาเสถียรภาพ P450 โปรตีนโครงสร้างการภูมิภาคโปรโมเตอร์ของยีนสายพันธุ์ทีเจเอสสามได้ได้ใช้วิธีการเดินดีเอ็นเอ ลำดับที่ bp 1500ก่อนรหัสพันธุกรรมเริ่มต้นถูกวิเคราะห์ โดย TFSEARCHเริ่มต้น transcription ที่อเมริกามีการคาดการณ์ตามอยู่สัตว์ขาปล่องโปรโมเตอร์ initiators (Inrs) ซึ่งได้แนะนำการเล่นมีบทบาทสำคัญในการเริ่มต้น transcription [27] ทาทายังกล่องพบใกล้ขั้นต้นน้ำของ inr. presumed ใน CYP6D8CYP6G4 แต่ไม่ขาดใน CYP6A40 Transcription สำคัญหลายปัจจัยรวมไซต์ (เช่น CRE, GATA, HSF, CdxA, DfdOct-1, C/EBP) ได้ทำนาย (Figs. 1-3)เปรียบเทียบลำดับโปรตีน deduced ระหว่างทีเจเอส และBJD ความแตกต่างของกรดอะมิโน 4 (346Q/T, 353V/E, 399G/D และ480K/N) พบใน CYP6A40 กรดอะมิโนเปลี่ยนแปลงที่ห้า (204F /L, 225F / ฉัน 295T/K, 329I/L และ 447E/D) พบใน CYP6D8 และกรดอะมิโนแตกต่างสอง (330D/E และ 360N/S) พบในCYP6G4 ว่าแทนกรดอะมิโนเหล่านี้ส่งผลกระทบต่อกิจกรรมของ P450s เหล่านี้น่าจะตรวจสอบเพิ่มเติม

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

บัตรประจำตัวของสามยีน P450
ใหม่ใช้DDRT-PCR,
วงยีนซึ่งเป็นมากกว่าตัวแทนในBJD สายพันธุ์ที่ทนกว่าในสายพันธุ์ที่อ่อนแอต่อ TJS
หายและติดใจ สามแยก 52 ชิ้น cDNA
ถูกระบุให้เป็นส่วนหนึ่งของลำดับยีนP450 ใหม่ ที่จะได้รับข้อมูลเพิ่มเติมเกี่ยวกับสามยีน P450 สมมุติเต็ม cDNAs และ 50-ขนาบภูมิภาคถูกแยก 50 การแข่งขันถูกนำมาใช้ในการโคลน50 ปลายของยีนที่สาม cDNAs ยาวเต็มรูปแบบของสามยีนถูกตรวจสอบโดยวิธีPCR โดยใช้คู่ไพรเมอร์ได้รับการออกแบบบนพื้นฐานของการแต่งงานsequences.The สามระบุยีนใหม่ P450 ชื่อ CYP6A40, CYP6D8 และ CYP6G4 (P450 คณะกรรมการเรียกชื่อเข้าจำนวน: FJ911555, FJ911557 และ FJ911556) , การเข้ารหัสโปรตีนของ515, 514 และ 519 ตามลำดับกรดอะมิโน โปรตีนสมมุติลำดับยีนของแต่ละสถานีมี N- น้ำสูงซึ่งเป็นลักษณะของเมมเบรนที่ถูกผูกไว้โปรตีนP450 ห้าลวดลายอนุรักษ์ (FXXGXRXCXG / A, WXXXR, GXE / DTT / S, EXXR, PXXF) ของโปรตีน P450 ซึ่งยังคงมีการอนุรักษ์ของโครงสร้างและการทำงานระหว่างการวิวัฒนาการ[26] ถูกระบุไว้ในอนุมานลำดับโปรตีนCYP6A40, CYP6D8 และ CYP6G4 (มะเดื่อ. 1-3). แม่ลาย FXXGXRXCXG / A ในภูมิภาค heme ผูกพันที่มีลายเซ็นของโปรตีนP450 และสารตกค้าง cysteine ​​ในมาตรฐานนี้เป็นที่รู้จักกันเป็นแกนด์สำหรับheme เหล็ก WXXXR บรรทัดฐานตั้งอยู่ในC-เกลียวซึ่งเป็นป่าสงวน eukaryotic ที่สุด P450s ออกซิเจนบรรทัดฐานผูกพัน (GXE / DTT / S) เป็นที่รู้จักกันที่จะเข้าร่วมโปรตอนโอน บรรทัดฐาน EXXR ตั้งอยู่ใน K-เกลียวและบรรทัดฐาน PXXF พบว่าเป็นส่วนหนึ่งของคดเคี้ยวก่อน heme แกนด์ thiolate ที่ได้รับการพิจารณาในรูปแบบเกลือสะพานเพื่อรักษาเสถียรภาพของโปรตีนP450 โครงสร้าง. ภูมิภาคก่อการสามยีนจากความเครียด TJS อยู่ได้ใช้วิธีการเดินดีเอ็นเอ ลำดับ bp 1500 ก่อนที่จะมีการเริ่มต้น codon วิเคราะห์ TFSEARCH. เว็บไซต์ที่เริ่มต้นการถอดรหัสถูกคาดการณ์ตามป่าสงวนริเริ่มก่อการ arthropod (Inrs) ซึ่งเป็นข้อเสนอแนะที่จะมีบทบาทสำคัญในการเริ่มต้นการถอดความ[27] ทาทากล่องถูกพบใกล้ต้นน้ำของ Inr สันนิษฐานใน CYP6D8 และ CYP6G4 แต่ก็ไม่อยู่ใน CYP6A40 ถอดความสำคัญหลายปัจจัยที่มีผลผูกพันเว็บไซต์ (เช่น CRE, GATA, HSF, CDXA, DFD, ต.ค. 1, C / EBP) ได้รับการคาดการณ์ (มะเดื่อ. 1-3). การเปรียบเทียบลำดับโปรตีนอนุมานระหว่าง TJS และBJD สี่แตกต่างกรดอะมิโน (346Q / T, 353V / E, 399G / D และ480k / N) ที่พบใน CYP6A40 ห้าการเปลี่ยนแปลงกรดอะมิโน (204F / L, 225F / I, 295T / K, 329I / L และ 447E / D) พบ ใน CYP6D8 และสองความแตกต่างกรดอะมิโน(330D / E และ 360N / S) ที่พบในCYP6G4 ไม่ว่าจะเป็นแทนกรดอะมิโนเหล่านี้ส่งผลกระทบต่อกิจกรรมเหล่านี้ P450s มีคุณค่าของการตรวจสอบต่อไป

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ตัวใหม่สามพีของยีนโดยใช้วิธีที่มากกว่า , วงแทน
ในบีเจดี สายพันธุ์ทนกว่าเสี่ยงความเครียด . หาย
แล้วนี้ สามแยก 52 cDNA ชิ้นส่วนถูก
ระบุเป็นลำดับบางส่วนของยีนพีใหม่ ที่จะได้รับข้อมูลเพิ่มเติมเกี่ยวกับสาม

เต็มซึ่งพียีนcdnas 50 flanking ภูมิภาคถูกแยก 50-race ประยุกต์
ลอกแบบ 50 ปลาย 3 ยีน เต็มความยาว cdnas ของ
3 ยีนได้ถูกตรวจสอบโดยวิธี PCR โดยใช้ไพรเมอร์คู่ออกแบบ
ตามไม ลำดับ สามพี ระบุยีนใหม่ชื่อ cyp6a40
cyp6d8 cyp6g4 ( พี , และระบบการตั้งชื่อกรรมการภาคยานุวัติ
เลขที่ : fj911555 fj911557 , และ fj911556 )การเข้ารหัสโปรตีนของ
514 515 519 , และกรดอะมิโน ตามลำดับ กรดอะมิโนโปรตีน
ลำดับของแต่ละยีนมีสูง ) - ปลายทาง
ซึ่งเป็นลักษณะของพีมีโปรตีน
5 การอนุรักษ์ลวดลาย ( fxxgxrxcxg wxxxr gxe , / , / 20 / s exxr
, pxxf ) ของโปรตีนพีซึ่งรักษาโครงสร้างและหน้าที่ในการอนุรักษ์
วิวัฒนาการ [ 26 ]ถูกระบุไว้ในลำดับของโปรตีนได้
cyp6a40 cyp6d8 , และ cyp6g4 ( Figs 1 - 3 )
แม่ลาย fxxgxrxcxg / ในเขตท่านผูกเป็นลายเซ็น
ของโปรตีนพี และซิสเตอีนตกค้างในแม่ลายนี้
เรียกว่าลิแกนด์สำหรับธาตุเหล็กที่อยู่ในรูป แม่ลาย wxxxr ตั้งอยู่
ใน c-helix ซึ่งเป็นป่าสงวนใน p450s ออกซิเจน -
เข้ามามากที่สุดผูกแม่ลาย ( gxe / 20 / s ) เป็นที่รู้จักกันเพื่อเข้าร่วมการถ่ายโอนโปรตอน

การ exxr แม่ลายตั้งอยู่ใน k-helix และ pxxf แม่ลาย
พบเป็นส่วนหนึ่งของการเดินเล่นก่อนนี่ thiolate แกนด์ ,
ถือว่ารูปแบบสะพานเกลือเพื่อรักษาเสถียรภาพของโครงสร้างโปรตีนพี
.
โปรโมเตอร์ของยีนจากภูมิภาค 3 . เมื่อยอยู่
ได้มาโดยวิธีการของดีเอ็นเอที่เดินได้ 1 , 500 BP ลำดับ
ก่อนที่จะเริ่มต้น codon มาวิเคราะห์โดย tfsearch .
บัณฑิตยสถานเริ่มต้นเว็บไซต์เป็นทำนายตามป่าสงวน
ไข่เจียวการริเริ่ม ( inrs ) ซึ่งแนะนำ
มีบทบาทสําคัญในการถอดความ [ 27 ] กล่องทาทา
ถูกพบใกล้ต้นน้ำของสันนิษฐานว่าเกิดใน cyp6d8
และ cyp6g4 แต่ไม่อยู่ใน cyp6a40 .
ถอดความสำคัญหลายปัจจัยที่มีผลผูกพันเว็บไซต์ ( เช่น CRE GATA hsf cdxa DFD , , , ,
oct-1 , C / ebp ) ทำนาย ( Figs 1 - 3 )
เปรียบเทียบได้ระหว่างโปรตีนและลำดับ .
บีเจดี สี่ความแตกต่างของกรดอะมิโน ( 346q / T 353v / e / D และ 399g
480 K / n ) พบใน cyp6a40 5 การเปลี่ยนแปลงกรดอะมิโน ( 204f /
L , 225f / ผม 295t / K 329i / ผมและ 447e / D ) พบใน cyp6d8 และ
สองความแตกต่างของกรดอะมิโน ( 330d / E และ 360n / s ) พบใน
cyp6g4 . ไม่ว่าเหล่านี้กรดอะมิโนเปลี่ยนมีผลต่อกิจกรรม
เหล่านี้ p450s มีคุณค่าของการสอบสวนเพิ่มเติม