2.2. Polymerase chain reaction (PCR

2.2. Polymerase chain reaction (PCR)
Fish were anaesthetized with MS222 (Sigma Co., St
Louis, MO, USA) and peripheral blood was collected
from the tail vein with heparinized syringes. Leucocytes
were isolated from the blood by Percoll (Sigma) gradient
centrifugation. Spleen, kidney, liver, heart, stomach,
intestine, brain, muscle, eye and gill were removed from
the fish. In fingerling, each organ of 2 fish was pooled.
Genomic DNA was isolated from approximately 50mg
of each organ using Accuprep® Genomic DNA Extraction
Kit (Bioneer Co., Daejeon, Korea).
Two oligonucleotide primers, PF (5′-ATGTCTGCAATCTCAGGTG-
3′) and PR (5′-TTACAGGATAGGGAAGCCTGC-
3′), were designed to amplify
the major capsid protein (MCP) ORF of an iridovirus
isolated from rock bream (GenBank accession number,
AY532612), and the expected size of amplification
product was 1362-bp. The PCR amplification procedure
was carried out in a 20μl reaction mixture containing
10μl of PCR premix taq (Takara, Japan), 1μl
(10pM) of each primer, 2μl DNA template, and 6μl of
distilled water. The reaction was performed for 1 cycle
of 3 min at 95°C, 30 cycles of 30s at 95°C, 30 s at
65°C, 30 s at 72°C, with a final extension step of 7min
at 72°C using an automated thermal cycler (iCycler,
BioRad Inc., USA). Oligonucleotide primers, NF (5′-
CACCGCAACGTGCAAAGCAA-3′) and NR (5′-
TTGACTGCAATAACGACCAGTTCAAAC-3′), were
used for nested-PCR, and the expected size of amplification
c was 369-bp. DNA template of the nested-
PCR was 1/100 dilution of the first PCR products, and
the reaction condition was as described above. The amplified
PCR product was cloned into a PCR 2.1-TOPO
plasmid using the TOPO TA Cloning® Kit (Invitrogen,
CA, USA), and the recombinant plasmid was purified
using an Accuprep® Plasmid Extraction Kit (Bioneer)
for sequencing.
2.3. Effects of water temperature elevation on transition
of RSIV into acute phase

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.2. ปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรส (PCR)ปลาถูก anaesthetized กับ MS222 (บริษัท Sigma เซนต์หลุยส์ MO สหรัฐอเมริกา) และเก็บเลือดจากหลอดเลือดดำหางกับ heparinized เข็มฉีดยา เม็ดเลือดขาวถูกแยกจากเลือด โดยการไล่ระดับสี Percoll (Sigma)หมุนเหวี่ยง หัวใจ ตับ ม้าม ไต กระเพาะ อาหารลำไส้ สมอง กล้ามเนื้อ ตา และเหงือกถูกเอาออกจากปลา ใน fingerling เป็นพูแต่ละอวัยวะของปลา 2ออกดีเอ็นเอที่ถูกแยกจากประมาณ 50 มิลลิกรัมของแต่ละอวัยวะโดยใช้ Accuprep®ออกสกัดดีเอ็นเอชุด (บริษัท Bioneer แทจอน เกาหลี)สอง oligonucleotide ไพรเมอร์ PF (5 ′ - ATGTCTGCAATCTCAGGTG-3′) และการประชาสัมพันธ์ (5 ′ - TTACAGGATAGGGAAGCCTGC -3′), ออกแบบมาเพื่อทำให้โปรตีนสำคัญ capsid (MCP) ORF ของ iridovirus การแยกออกจากหินทรายแดง (เลขทะเบียน GenBankAY532612), และขยายขนาดที่คาดไว้สินค้าถูก 1362-bp ขั้นตอนการขยาย PCRดำเนินการในส่วนผสมประกอบด้วย 20μl ปฏิกิริยา10μl ของ taq ผสม PCR (Takara ญี่ปุ่น), 1μl(น. 10) ไพรเมอร์ แม่แบบดีเอ็นเอ 2μl และ 6μl ของน้ำกลั่น ทำปฏิกิริยาสำหรับ 1 รอบ3 นาทีที่ 95° C, 30 รอบ 30s 95° c, 30 s ที่65° C, 30 s ที่ 72° C พร้อมขั้นสุดท้ายส่วนขยายของ 7 นาที72° c ใช้อัตโนมัติร้อน cycler (iCyclerBioRad อิงค์ สหรัฐอเมริกา) ไพรเมอร์ oligonucleotide, NF (5 ′-CACCGCAACGTGCAAAGCAA-3′) และยางพารา (5 ′-TTGACTGCAATAACGACCAGTTCAAAC-3′), ถูกใช้สำหรับ PCR ซ้อน และการขยายขนาดที่คาดไว้c 369 bp. ดีเอ็นเอแม่แบบของซ้อนกันได้PCR ถูกเจือจาง 1/100 ของผลิตภัณฑ์ PCR ครั้งแรก และสภาพปฏิกิริยาได้อธิบายข้างต้น การขยายผลิตภัณฑ์ PCR ถูกโคลนเป็น 2.1 PCR-ภูมิประเทศได้plasmid ใช้ภูมิประเทศ TA Cloning®ชุด (InvitrogenCA, USA), และบริสุทธิ์ recombinant plasmidใช้เป็นชุดสกัด Plasmid ของ® Accuprep (Bioneer)สำหรับลำดับ2.3. ผลของระดับความสูงอุณหภูมิน้ำในช่วงการเปลี่ยนภาพของ RSIV ในระยะเฉียบพลัน

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.2 วิธี Polymerase chain reaction (PCR)
ปลาถูกอสัญญีกับ MS222 (Sigma Co. , St
Louis, มิสซูรี, สหรัฐอเมริกา) และเลือดที่ถูกเก็บรวบรวม
จากหลอดเลือดดำหางกับเข็มฉีดยา heparinized เม็ดเลือดขาว
ที่แยกได้จากเลือดโดย Percoll (ซิกม่า) ลาด
หมุนเหวี่ยง ม้ามไตตับหัวใจกระเพาะอาหาร
ลำไส้, สมอง, กล้ามเนื้อตาและเหงือกที่ถูกถอดออกจาก
ปลา ในลูกปลาออร์แกน 2 ปลาแต่ละ pooled.
DNA ของยีนที่แยกได้จากประมาณ 50mg
ของแต่ละอวัยวะใช้Accuprep®จีโนมสกัดดีเอ็นเอ
Kit (Bioneer Co. , Daejeon เกาหลี).
สองไพรเมอร์ oligonucleotide, PF (5'-ATGTCTGCAATCTCAGGTG-
3 ') และการประชาสัมพันธ์ (5'-TTACAGGATAGGGAAGCCTGC-
3') ถูกออกแบบมาเพื่อขยาย
โปรตีน capsid สำคัญ (MCP) ORF ของ iridovirus
ที่แยกได้จากหินทรายแดง (GenBank หมายเลขภาคยานุวัติ
AY532612) และขนาดที่คาดหวังของการขยาย
สินค้าถูก 1362 -BP ขั้นตอนการขยาย PCR
ได้ดำเนินการในส่วนผสมปฏิกิริยา20μlมี
10μlของ PCR พรีมิกซ์ Taq (Takara ประเทศญี่ปุ่น) 1μl
(10:00) ของแต่ละไพรเมอร์, แม่แบบดีเอ็นเอ2μlและ6μlของ
น้ำกลั่น ปฏิกิริยาที่ได้ดำเนินการสำหรับ 1 รอบ
3 นาทีที่ 95 ° C, 30 รอบของยุค 30 ที่ 95 ° C, 30 วินาทีที่
65 ° C, 30 วินาทีที่ 72 องศาเซลเซียสด้วยขั้นตอนการขยายสุดท้ายของ 7 นาที
ที่ 72 องศาเซลเซียสโดยใช้ Cycler ความร้อนอัตโนมัติ (iCycler,
BioRad อิงค์สหรัฐอเมริกา) ไพรเมอร์ oligonucleotide, NF (5'-
CACCGCAACGTGCAAAGCAA-3) และ NR (5'-
TTGACTGCAATAACGACCAGTTCAAAC-3 ') ถูก
ใช้สำหรับการซ้อนกัน-PCR และขนาดที่คาดหวังของการขยาย
C-369 เป็นความดันโลหิต แม่แบบดีเอ็นเอของ nested-
PCR เป็น 1/100 ลดสัดส่วนของผลิตภัณฑ์ PCR แรกและ
เงื่อนไขของปฏิกิริยาที่ถูกอธิบายไว้ข้างต้น ขยาย
ผลิตภัณฑ์ PCR เป็นโคลนเป็น PCR 2.1 TOPO
พลาสมิดโดยใช้ชุด TOPO TA Cloning® (Invitrogen,
CA, USA) และพลาสมิด recombinant บริสุทธิ์
โดยใช้ชุดAccuprep®พลาสมิดสกัด (Bioneer)
สำหรับลำดับ.
2.3 ผลกระทบของการยกระดับอุณหภูมิของน้ำที่เกี่ยวกับการเปลี่ยนแปลง
ของ RSIV ลงในระยะเฉียบพลัน

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.2 . ปฏิกิริยาลูกโซ่ ( PCR )ปลาถูกให้ยาสลบโดยกับ ms222 ( Sigma Co . , เซนต์หลุยส์ , โม , USA ) และกระแสเลือดถูกรวบรวมจากกลุ่มหลอดเลือดดำหางเข็มฉีดยา ลิวโคไซต์ที่แยกได้จากเลือดที่ผ่าน ( Sigma ) ลาดการปั่นเหวี่ยง ม้าม ไต ตับ หัวใจ กระเพาะไส้ สมอง กล้ามเนื้อ และตาข่ายถูกเอาออกจากปลา ในเด็กแต่ละอวัยวะ 2 ปลารวม .ดีเอ็นเอที่แยกได้จากประมาณ 50ของแต่ละอวัยวะที่ใช้ accuprep ®การสกัดดีเอ็นเอจีโนมชุด ( bioneer Co . , Daejeon , เกาหลีใต้ )สอง ซึ่งไพรเมอร์ , PF ( 5 ’ - atgtctgcaatctcaggtg -3 ดูแล ) และประชาสัมพันธ์ ( 5 ’ - ttacaggatagggaagcctgc -3 ได้รับ ) ถูกออกแบบมาเพื่อขยายโปรตีนแคปซิดสาขา ( MCP ) ORF ของอิริโดไวรัสที่แยกได้จากหินแดง ( ขนาดเปลี่ยนหมายเลขay532612 ) และคาดว่าการขยายขนาดของสินค้าตอนนี้บีพี การตรวจแบบขั้นตอนดำเนินการใน 20 μ L ปฏิกิริยาผสมที่มี10 μ L สามารถใช้แท็ก ( Takara , ญี่ปุ่น ) , 1 μ l( 22 : 00 ) ของแต่ละคู่ , 2 μ L ดีเอ็นเอแม่แบบ และ 6 μล.น้ำกลั่น ปฏิกิริยาที่ถูกดำเนินการใน 1 รอบ3 นาทีที่ 95 องศา C 30 รอบ 30 ที่ 95 องศา C 30 S ที่65 ° C 30 s 72 ° C มีขั้นตอนสุดท้ายของ 7min นามสกุล72 องศา C โดยใช้แบบอัตโนมัติ ( icycler Thermal cycler ,biorad Inc . , USA ) ซึ่งไพรเมอร์ , NF ( 5 ’ -caccgcaacgtgcaaagcaa-3 School ) และยางธรรมชาติ ( 5 ’ -ttgactgcaataacgaccagttcaaac-3 School ) ,ใช้วิธีซ้อนกัน และคาดว่าจะขยายขนาดของC คุณบีพี ดีเอ็นเอแม่แบบซ้อนกัน - ของPCR คือ 1 / 100 เจือจางผลิตภัณฑ์ PCR ก่อนปฏิกิริยาอาการตามที่อธิบายไว้ข้างต้น ไพรผลิตภัณฑ์ PCR ถูกโคลนเข้าดีเอ็นเอ 2.1-topoพลาสมิดที่ใช้สถานที่® Kit ( Invitrogen ทาโคลน ,CA , USA ) และรีคอมบิแนนท์พลาสมิดบริสุทธิ์ใช้ accuprep ® Kit ( bioneer ) การสกัดพลาสมิดสำหรับการติดตาม .2.3 ผลของอุณหภูมิของน้ำที่ระดับความสูงบนที่เปลี่ยนของ rsiv ออกเป็นระยะเฉียบพลัน