3. Results3.1. Production of the re

3. Results
3.1. Production of the recombinant S-layer protein of A.
hydrophila isolate
The amplification of the gene encoding the S-layer protein from
A. hydrophila isolate T4 was successfully achieved, indicated by the
production of the 1353 bp PCR product on a 1% agarose gel as shown
in Fig. 1 (lanes 2 and 3), while successful ligation of the digested Slayer
protein gene into the pQE60 vector was confirmed by the band
obtained at around 4.8 kb (Fig. 1 (lane 4)). Expression of an abundant
S-layer protein (45.5 kDa) was confirmed in the IPTG induced
E. coli, transformed with the pQE60 vector containing the S-layer
gene insert, by SDS-PAGE analysis (Fig. 2a). The protein also gave
a strong positive reaction in Western blot with the anti-histidine
antibody (Fig. 2b). A final yield of 15mg of purified protein was
recovered from a 1 litre E. coli culture, and it was confirmed as Slayer
protein by SDS-PAGE analysis (Fig. 3a) and Western blotting
using serum produced against aWC preparation of A. hydrophila T4
isolate (raised in common carp) (Fig. 3b).
3.2. Efficacy of recombinant S-layer protein as a vaccine against A. hydrophila in common carp
3.2.1. Standardisation of the challenge dose of A. hydrophila
All six strains of A. hydrophila, T4, 98140, 98141, Hh, B2/12 and
Vds, were passaged two times through common carp and the bacteria
were successfully recovered on each passage. During the first
passage, no mortalities occurred in any of the fish, while most fish
died when passaging bacteria were used with the exception of fish
passed with isolate T4. The LD50 values obtained for each strain are
presented in Table 1. The highestLD50 value obtainedwasfor isolate
T4 with a dose of 1×108 bacteria ml−1, while the lowest dose was obtained with isolate B2/12 with a value of 7.5×106 bacteria ml−1.
An LD50 value of 2×107 bacteria ml−1 was obtained for isolates
98140, 98141 and Vds, while an LD 50 value of 5×107 bacteria ml−1
was obtained for Hh.
3.2.2. Vaccination of common carp with the recombinant S-layer
protein of A. hydrophila
The cumulative mortality that occurred in the control fish after
challenging with the different isolates of A. hydrophila ranged from
40 to 75%, while the mortalities of vaccinated fish ranged between
10 and 20% (Table 1). The mortalities ceased in the control groups
by Day 8 post-challenge, whereas no mortality was found after
Day 5 post-challenge in the vaccinated groups (Fig. 4). A higher
percentage of mortalities were recorded in control fish challenged with isolate T4 than in fish challenged with the other isolates of A.
hydrophila (Fig. 4a). The relative percentage survival (RPS) value of
fish challenged with isolate T4 was found to be the highest compared
with the fish challenged with other A. hydrophila isolates,
while the lowest RPS value was obtained in fish challenged with
isolate B2/12 (Table 1). Statistically, survival after challenging with
isolates T4, 98140, 98141 and Hh was significantly higher in vaccinated
fish compared to control fish, while levels of survival were
not statistically different between vaccinated and control fish challenged
with isolates B2/12 and Vds (Table 1).
A. hydrophila was recovered from all kidney swabs taken from
dead fish over the course of the trial. In contrast, no A. hydrophila
was cultured from kidney swabs taken from fish surviving at the
end of experimental challenge except swabs of one fish in the vaccinated
group challenged with isolate 98140, and another fish in the
control group challenged with isolate 98141, with a few colonies
obtained from both fish.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

3. ผลลัพธ์3.1 การผลิต recombinant โปรตีนชั้น S ของแยก hydrophilaขยายของยีนโปรตีนชั้น S จากการเข้ารหัสA. hydrophila แยกสำเร็จสำเร็จ T4 ตามผลิตผลิตภัณฑ์ PCR bp 1353 ใน agarose 1% เจมากใน 1 Fig. (ถนนหนทาง 2 และ 3), ในขณะที่ไข่ของสเลเยอร์ digested ประสบความสำเร็จยีนเป็นเวกเตอร์ pQE60 ได้รับการยืนยัน โดยวงได้ที่ประมาณ 4.8 kb (Fig. 1 (4 เลน)) ของความอุดมสมบูรณ์โปรตีนชั้น S (45.5 kDa) ได้รับการยืนยันใน IPTG ที่เกิดE. coli เวกเตอร์ pQE60 ที่ประกอบด้วย S-ชั้นที่แตกต่างแทรกยีน โดย SDS หน้าวิเคราะห์ (Fig. 2a) นอกจากนี้ยังให้โปรตีนปฏิกิริยาเชิงบวกที่เข้มแข็งในตะวันตกทำลายกับ histidine ป้องกันแอนติบอดี (Fig. 2b) มีผลผลิตขั้นสุดท้ายของ 15 มิลลิกรัมโปรตีนบริสุทธิ์กู้จากวัฒนธรรม E. coli 1 ลิตร และมันได้รับการยืนยันเป็นผู้สังหารโปรตีนทาง SDS หน้าวิเคราะห์ (Fig. 3a) blotting วิธีตะวันตกใช้เซรั่มผลิตจากเตรียม aWC ของ A. hydrophila T4แยก (อ่านไน) (Fig. 3b) 3.2. ประสิทธิภาพของวททช S ชั้นโปรตีนเป็นวัคซีนต่อ A. hydrophila เหน็บกัน3.2.1. มาตรฐานของพื้นที่ซึ่งมีทั้งความท้าทายของ A. hydrophilaสายพันธุ์ที่ 6 ทั้งหมดของ A. hydrophila, T4, 98140, 98141 ชช B2/12 และVds มี passaged สองครั้งผ่านไนและแบคทีเรียเรียบร้อยถูกกู้คืนในคัมภีร์ ในช่วงแรกเส้นทาง mortalities ไม่เกิดขึ้นในปลา ในขณะที่ปลาส่วนใหญ่เสียชีวิตเมื่อมีใช้แบคทีเรีย passaging ยกเว้นปลาผ่านไป ด้วย T4 แยก ค่า LD50 ที่ได้ต้องใช้แต่ละแสดงในตารางที่ 1 Obtainedwasfor ค่า highestLD50 แยกT4 ด้วยปริมาณของ 1 × 108 แบคทีเรีย ml−1 ในขณะที่ปริมาณรังสีต่ำสุดได้รับกับแยก B2/12 มีค่า 7.5 × 106 แบคทีเรีย ml−1ค่า LD50 ของ 2 × 107 แบคทีเรีย ml−1 ไม่ได้แยก98140, 98141 และ Vds ในขณะที่ค่า LD 50 ของ 5 × 107 แบคทีเรีย ml−1กล่าวสำหรับชช3.2.2 การฉีดวัคซีนของไนกับ recombinant S ชั้นโปรตีนของ A. hydrophilaการตายสะสมที่เกิดขึ้นในปลาตัวควบคุมหลังจากท้าทายกับการแตกแยกของ A. hydrophila ที่มา40-75% ในขณะที่ mortalities ปลาที่ฉีดอยู่ในช่วงระหว่าง10 และ 20% (ตาราง 1) Mortalities เพิ่มในกลุ่มควบคุมโดยความท้าทายหลัง 8 วัน ในขณะที่การตายไม่พบหลังจากความท้าทายหลัง 5 วันในกลุ่ม vaccinated (Fig. 4) สูงขึ้นบันทึกเปอร์เซ็นต์ของ mortalities ในปลาควบคุมท้าทายกับ T4 แยกกว่าในปลาที่ท้าทายกับการอื่น ๆ แยกของhydrophila (Fig. 4a) ค่าสัมพัทธ์เปอร์เซ็นต์รอด (RPS) ของท้าทายกับ T4 แยกปลาพบจะ สูงสุดเมื่อเทียบปลาที่ท้าทายกับอื่น ๆ A. hydrophila ที่แยกได้ในขณะที่ค่า RPS ราคาถูกรับในปลาที่ท้าทายด้วยแยก 12 B2 (ตาราง 1) ทางสถิติ การอยู่รอดหลังจากการท้าทายด้วยแยก T4, 98140, 98141 และชชถูกฉีดสูงกว่าอย่างมีนัยสำคัญในเปรียบเทียบการควบคุมปลา ขณะที่ระดับของการอยู่รอดของปลาไม่แตกต่างทางสถิติระหว่างฉีด และควบคุมปลาท้าทายมีแยก B2/12 และ Vds (ตาราง 1)A. hydrophila ได้กู้คืนจาก swabs ไตทั้งหมดที่นำมาจากปลาตายในช่วงการทดลอง ในทางตรงข้าม hydrophila ไม่อ.มีอ่างจาก swabs ไตที่นำมาจากปลาที่รอดที่นี้จุดสิ้นสุดของความท้าทายทดลองยกเว้น swabs ปลาหนึ่งในการฉีดท้าทายกับปลาแยก 98140 และอื่นในกลุ่มกลุ่มควบคุมท้าทายกับ 98141 แยก มีกี่อาณานิคมได้รับจากปลาทั้งสอง

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

3. ผล
3.1 การผลิต recombinant โปรตีน S-ชั้นของ A.
hydrophila
แยกขยายของยีนโปรตีน
S-ชั้นจากเอ hydrophila แยก T4
ก็ประสบความสำเร็จที่ประสบความสำเร็จระบุโดยการผลิตของสินค้า1,353 bp PCR ในเจล agarose 1%
ดังแสดงในรูปที่ 1 (2 เลนและ 3) ในขณะที่ประสบความสำเร็จของ ligation
ฆ่าย่อยยีนโปรตีนเข้าไปในเวกเตอร์pQE60
รับการยืนยันจากวงดนตรีที่ได้รับอยู่ที่ประมาณ4.8 กิโลไบต์ (รูปที่ 1. (ช่อง 4)) การแสดงออกของความอุดมสมบูรณ์โปรตีน S-ชั้น (45.5 กิโลดาลตัน) ได้รับการยืนยันใน IPTG เหนี่ยวนำให้เกิดอี coli เปลี่ยนกับเวกเตอร์ pQE60 มี S-ชั้นแทรกยีนโดยการวิเคราะห์ระบบSDS-PAGE (รูป. 2a) โปรตีนยังให้ปฏิกิริยาบวกที่แข็งแกร่งในดวงตะวันกับการต่อต้านฮิสติดีนแอนติบอดี้(รูป. 2b) ผลผลิตสุดท้ายของ 15mg ของโปรตีนบริสุทธิ์ได้รับการกู้คืนจาก1 ลิตรอีโคไลวัฒนธรรมและมันก็ยืนยันว่าเป็นฆ่าโปรตีนโดยการวิเคราะห์ระบบSDS-PAGE (รูป. 3a) และซับตะวันตกโดยใช้ซีรั่มที่ผลิตกับการเตรียมความพร้อมของAWC A. hydrophila T4 แยกได้ (เติบโตในปลาคาร์พที่พบบ่อย) (รูป. 3b). 3.2 ประสิทธิภาพของ recombinant โปรตีน S-ชั้นเป็นวัคซีนป้องกัน hydrophila ในปลาคาร์พ A. ทั่วไป3.2.1 เป็นมาตรฐานของปริมาณความท้าทายของ A. hydrophila ทั้งหกสายพันธุ์ของ hydrophila A. , T4, 98140, 98141, Hh, B2 / 12 และVds ถูก passaged สองครั้งที่ผ่านปลาคาร์พที่พบบ่อยและเชื้อแบคทีเรียที่หายประสบความสำเร็จในการผ่านแต่ละ ในช่วงแรกทาง, ไม่มีการตายเกิดขึ้นในใด ๆ ของปลาในขณะที่ปลาส่วนใหญ่เสียชีวิตเมื่อแบคทีเรียpassaging ถูกนำมาใช้มีข้อยกเว้นของปลาผ่านไปแยกT4 ค่า LD50 ได้รับสำหรับแต่ละสายพันธุ์จะถูกนำเสนอในตารางที่1 มูลค่า highestLD50 obtainedwasfor แยกT4 มีขนาด 1 × 108 มล. แบคทีเรีย-1 ในขณะที่ปริมาณต่ำสุดที่ได้รับกับแยก B2 / 12 มีมูลค่า 7.5 × 106 แบคทีเรีย มล. 1. ค่า LD50 ของ 2 × 107 มล. แบคทีเรีย-1 ที่ได้รับสำหรับแยก98,140, ​​98,141 และ Vds ในขณะที่ค่า LD 50 5 × 107 มล. แบคทีเรีย-1 ที่ได้รับสำหรับ Hh. 3.2.2 การฉีดวัคซีนของปลาคาร์พกันกับ recombinant S-ชั้นโปรตีนA. hydrophila อัตราการตายสะสมที่เกิดขึ้นในการควบคุมปลาหลังจากที่ท้าทายกับสายพันธุ์ที่แตกต่างกันของ A. hydrophila ตั้งแต่ 40 ถึง 75% ในขณะที่อัตราการตายของปลาฉีดวัคซีนอยู่ระหว่าง10 และ 20% (ตารางที่ 1) ตายหยุดกลุ่มควบคุมโดยวันที่ 8 โพสต์ความท้าทายในขณะที่อัตราการตายไม่พบหลังจากวันที่5 โพสต์ความท้าทายในการฉีดวัคซีนในกลุ่ม (รูปที่. 4) สูงขึ้นร้อยละของการตายที่ถูกบันทึกไว้ในปลาควบคุมท้าทายกับ T4 แยกกว่าในปลาท้าทายกับสายพันธุ์อื่น ๆ ของ A. hydrophila (รูป. 4a) อยู่รอดร้อยละญาติ (RPS) มูลค่าของปลาท้าทายกับแยกT4 ถูกพบว่าเป็นที่สูงที่สุดเมื่อเทียบกับปลาท้าทายกับแยกhydrophila A. อื่น ๆในขณะที่ค่า RPS ต่ำสุดที่ได้รับในปลาท้าทายกับแยกB2 / 12 (ตารางที่ 1 ) สถิติการอยู่รอดหลังจากที่ท้าทายกับแยก T4, 98140, 98141 และ Hh อย่างมีนัยสำคัญที่สูงขึ้นในการฉีดวัคซีนปลาเมื่อเทียบกับการควบคุมปลาในขณะที่ระดับของการอยู่รอดได้ไม่แตกต่างระหว่างปลาการฉีดวัคซีนและการควบคุมท้าทายกับแยกB2 / 12 และ Vds (ตารางที่ 1) . เอ hydrophila หายจาก swabs ไตทั้งหมดนำมาจากปลาตายในช่วงเวลาของการพิจารณาคดี ในทางตรงกันข้าม A. hydrophila ไม่ได้รับการเพาะเลี้ยงจากswabs ไตที่นำมาจากปลาที่รอดตายในตอนท้ายของการทดลองที่ท้าทายยกเว้นswabs ของปลาในการฉีดวัคซีนกลุ่มท้าทายกับ98,140 แยกและปลาอื่นในกลุ่มควบคุมท้าทายกับ98,141 แยกด้วย อาณานิคมไม่กี่ที่ได้จากปลาทั้งสอง

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

3 . ผลลัพธ์
3.1 . การผลิตรีคอมบิแนนท์โปรตีนของ s-layer A . hydrophila แยก

แบบการเข้ารหัสโปรตีนจากยีน s-layer
A . hydrophila แยก T4 มีเรียบร้อยแล้ว พบโดย
การผลิตของแต่ BP ดีเอ็นเอผลิตภัณฑ์บน 1% เจล ดังแสดงในรูปที่ 1
( ช่อง 2 และ 3 ) ในขณะที่ Ligation ที่ประสบความสำเร็จ ของ Slayer
ย่อยโปรตีนยีนเข้าไปใน pqe60 เวกเตอร์ได้รับการยืนยัน โดยวงดนตรี
ได้ประมาณ 4.8 กิโล ( รูปที่ 1 ( ซอย 4 ) การแสดงออกของโปรตีน s-layer มากมาย
( ร้อยละ 45.5 ) ) ได้รับการยืนยันในการเข้า
E . coli , เปลี่ยนกับ pqe60 เวกเตอร์ที่มี s-layer
ยีนแทรก โดยการวิเคราะห์เอนไซม์ ( รูปที่ 2A ) โปรตีนยังให้
ปฏิกิริยาเป็นบวกที่แข็งแกร่งใน Western blot กับแอนตี้ฮิสติดีน
แอนติบอดี ( รูปที่ 2B ) ผลผลิตสุดท้ายของฝรั่งเศสของโปรตีนคือ
หายจากวัฒนธรรม 1 ลิตร E . coli , และยืนยันว่าเป็นผู้ฆ่า
โดยการวิเคราะห์เอนไซม์โปรตีน ( รูปที่ 3 ) และ Western blotting
ใช้ซีรั่มที่ผลิตกับการเตรียมการของ A . hydrophila AWC T4
แยก ( เลี้ยงปลาไน ) ( รูปที่ 3B )
2 . ประสิทธิภาพของโปรตีนรีคอมบิแนนท์ s-layer เป็นวัคซีน .การทดสอบในปลาไน
ดำเนินงาน . ให้ได้มาตรฐานของความท้าทาย ( A . hydrophila
6 A . hydrophila สายพันธุ์ , 98140 98141 T4 , , , HH , B2 / 12
VDS , passaged 2 ครั้งผ่านปลาไนและแบคทีเรีย
ถูกเรียบร้อยแล้วหายในแต่ละช่อง ในระหว่างทางก่อน
, ไม่ mortalities เกิดขึ้นในใด ๆของปลา เมื่อปลาส่วนใหญ่
เสียชีวิตเมื่อ passaging แบคทีเรียใช้ยกเว้นปลา
ผ่านแยก T4 . การ ld50 ได้สำหรับแต่ละสายพันธุ์มี
นำเสนอในตารางที่ 1 การ highestld50 ค่า obtainedwasfor แยก
t4 กับปริมาณของแบคทีเรีย 1 × 108 + − 1 ในขณะที่ปริมาณต่ำสุดที่แยก 2 / 12 มีมูลค่า 7.5 × 106 แบคทีเรีย ml
− 1การ ld50 ค่า− 1 + 2 × 107 แบคทีเรียได้ สำหรับสายพันธุ์
98140 98141 VDS , และ , ในขณะที่ LD 50 มูลค่า 5 × 107 แบคทีเรีย ml − 1
) สำหรับ HH .
3.2.2 . วัคซีนของปลาไนที่มีรีคอมบิแนนท์โปรตีน A . hydrophila s-layer

การตายที่เกิดขึ้นสะสมในปลาควบคุมหลังจากที่
ท้าทายด้วยเชื้อ A . hydrophila มีค่าแตกต่างจาก
40 ถึง 75% ,ในขณะที่ mortalities ของปลาได้รับวัคซีนอยู่ระหว่าง
10 และ 20 % ( ตารางที่ 1 ) การ mortalities หยุดในการควบคุมกลุ่ม
โดยวันที่ 8 โพสต์ความท้าทาย ในขณะที่ไม่พบการตายหลังจากวัน
5 โพสต์ความท้าทายในการฉีดวัคซีนกลุ่ม ( รูปที่ 4 ) เปอร์เซ็นต์สูงของ mortalities
ถูกบันทึกไว้ในการควบคุมปลาท้าทายกับแยก T4 กว่าปลาในการท้าทายกับอื่น ๆ A .
ไอโซเลทใน ( รูปที่ 4 ) เปอร์เซ็นต์การอยู่รอดญาติ ( RPS ) มูลค่าของปลาที่ท้าทายกับ T4
แยกได้สูงสุดเมื่อเทียบกับปลาอื่น ๆท้าทายด้วย
A . hydrophila สายพันธุ์
ในขณะที่ค่าต่ำสุดโดยได้ในปลาที่ท้าทายกับ
แยก 2 / 12 ( ตารางที่ 1 ) สถิติการอยู่รอดหลังจากที่แยก 98140 T4
, ,98141 HH และสูงกว่าในวัคซีน
ปลาเมื่อเทียบกับการควบคุมปลา ในขณะที่ระดับของการอยู่รอดที่แตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญระหว่างวัคซีน

กับการควบคุมท้าทายและปลาสายพันธุ์ 2 / 12 และ VDS ( ตารางที่ 1 ) .
A . hydrophila ก็หายจากโรคไตจากมาจาก
ปลาตายมากกว่าหลักสูตรของการทดลอง ในทางตรงกันข้าม ไม่ A . hydrophila
เลี้ยงปลาที่รอดตายจากไตจากถ่ายจากที่สิ้นสุดการทดลองยกเว้น swabs
ท้าทายของปลาในกลุ่มท้าทายกับแยก 98140 วัคซีน

และอีกปลาในกลุ่มท้าทายกับแยก 98141 กับบางอาณานิคม
ที่ได้รับจากทั้งปลา