Differential screening of the cDNA

Differential screening of the cDNA library with
a polymerase chain reaction (PCR)-amplified control
and subtracted probe was carried out. The
preparation of the probes was performed basically
according to Gamas et al. [23]. For preparation of
the subtracted probe, 3 mg poly(A)+ RNA from 24
h F. eumartii inoculated tubers were reversed-transcribed
using a mixture of oligodT12–18 and random
hexamers to prime the cDNA synthesis. The
poly(A)+ RNA (10 mg) obtained from control
tubers (tubers in which PDA sterile disks were
kept for 24 h) was photobiotinylated. Next, a
subtracted hybridization step between biotinylated
poly(A)+ RNA prepared from control tubers and
the single-stranded cDNA prepared from fungalinfected
tubers was performed. Finally, the subtracted
cDNA was converted to double strand
molecules, ligated to linkers [24] and amplified by
PCR. A control cDNA probe was also prepared
following the same procedure, starting from 3 mg
poly(A)+ RNA from 24 h PDA sterile diskstreated
tubers, and avoiding the subtractive step.
Both cDNA probes were labeled with [a-
32P]dCTP
by random priming [25], and used directly for the
screening of the potato tuber cDNA library.
About 500 000 plaques at a density of approximately
50 000 plaques/15 cm plate were screened.
Hybridizations were carried out according to
Gamas et al. [23]. Positive recombinant clones
were isolated by plaque purification using the
same hybridization conditions. In vivo excision
was carried out from the selected Uni-ZAP XR
cDNA clones, following the manufacturer’s instructions
(Stratagene) and recombinant pBluescript
SK(−) containing colonies were obtained
from phagemid infections of XL1-Blue strain
(Stratagene).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

คัดกรองที่แตกต่างกันของห้องสมุด cDNAปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรส (PCR) -ขยายควบคุมและหักออกสอบสวนดำเนินการ การทำการเตรียมการรบโดยทั่วไปตาม Gamas et al. [23] สำหรับเตรียมโพรบ subtracted, 3 mg poly(A) + RNA จาก 24ชม. F. eumartii inoculated มุดถูกย้อนกลับนั้นปรากฏใช้ส่วนผสมของ oligodT12 – 18 และสุ่มhexamers การสังเคราะห์ cDNA นายกรัฐมนตรี การpoly(A) + RNA (10 มิลลิกรัม) ที่ได้รับจากการควบคุมมุด (มุดใน PDA ซึ่งดิสก์เป็นหมันได้เก็บ 24 h) คือ photobiotinylated ถัดไป การลบขั้นตอนการ hybridization ระหว่าง biotinylatedpoly(A) + RNA จากมุดควบคุม และcDNA เดียวที่ควั่นที่เตรียมจาก fungalinfectedมุดได้ดำเนินการ ในที่สุด การหักออกcDNA ถูกแปลงเป็นสาระคู่โมเลกุล กเดี่ยวกับลิงก์ [24] และขยายโดยการPCR นอกจากนี้ยังจัดเตรียมการสอบสวน cDNA ที่ควบคุมวิธีการเดียว เริ่มต้น 3 มก.poly(A) + RNA จาก 24 h PDA ผ่านการฆ่าเชื้อ diskstreatedหัว และหลีกเลี่ยงขั้นตอนแบบลดทอนทั้งหัว cDNA ถูกกำกับด้วย [มี-DCTP P 32]โดยการสุ่มด้วย [25], และใช้โดยตรงสำหรับการตรวจสอบเอกสารของห้องสมุด cDNA หัวมันฝรั่ง500 000 เกี่ยวกับโล่ที่ความหนาแน่นของประมาณ50 000 โล่ 15 ซม.แผ่นคัดHybridizations ได้ดำเนินการตามGamas et al. [23] บวก recombinant โคลนถูกแยก โดยใช้ฟอกคราบจุลินทรีย์เงื่อนไขเดียวกัน hybridization ผ่าตัดเล็กในร่างกายดำเนินการจาก XR Uni-ZAP ที่เลือกcDNA โคลน ตามคำแนะนำของผู้ผลิต(Stratagene) และ recombinant pBluescriptSK(−) ที่มีอาณานิคมได้รับจาก phagemid ติดเชื้อสายพันธุ์บลู XL1(Stratagene)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การตรวจคัดกรองความแตกต่างของห้องสมุด cDNA ที่มี
ห่วงโซ่โพลิเมอร์ปฏิกิริยา (PCR) -amplified ควบคุม
และหักสอบสวนได้ดำเนินการ
เตรียมความพร้อมของยานสำรวจได้ดำเนินการโดยทั่วไป
ตาม Gamas et al, [23] สำหรับการเตรียม
การสอบสวนหัก 3 มกโพลี (A) + RNA จาก 24
ชั่วโมงที่ผ่านมาเอฟ eumartii หัวเชื้อเป็นตรงกันข้ามถอดความ
โดยใช้ส่วนผสมของ oligodT12-18 และสุ่ม
hexamers นายกสังเคราะห์ cDNA
โพลี (A) + อาร์เอ็นเอ (10 มก.) ที่ได้รับจากการควบคุม
หัว (หัวที่ผ่านการฆ่าเชื้อ PDA ดิสก์ถูก
เก็บไว้เป็นเวลา 24 ชั่วโมง) คือ photobiotinylated ถัดไปเป็น
ขั้นตอนการผสมข้ามพันธุ์ระหว่างหัก biotinylated
โพลี (A) + อาร์เอ็นเอที่เตรียมจากหัวควบคุมและการ
ซึ่งแปลเดียวควั่นเตรียมจาก fungalinfected
หัวได้ดำเนินการ สุดท้ายหัก
cDNA ถูกดัดแปลงเป็นสาระคู่
โมเลกุล ligated เพื่อ Linkers [24] และขยายโดย
วิธี PCR สอบสวนควบคุมยีนยังถูกจัดทำขึ้น
ดังต่อไปนี้ขั้นตอนเดียวกันเริ่มต้นจาก 3 มก
โพลี (A) + RNA จาก 24 ชั่วโมงที่ผ่านการฆ่าเชื้อ PDA diskstreated
อ้อมและหลีกเลี่ยงการลดขั้นตอน.
ทั้งสอง probes cDNA ถูกกำกับด้วย [A-
32P] dCTP
โดยสุ่ม รองพื้น [25] และใช้โดยตรงสำหรับ
การคัดกรองจากห้องสมุด cDNA มันฝรั่งหัว.
500 000 โล่ที่อัตราความหนาแน่นประมาณ
50 000 โล่ / 15 ซม. แผ่นถูกคัดกรอง.
Hybridizations ได้ดำเนินการตาม
Gamas et al, [23] โคลน recombinant บวก
ที่แยกได้จากคราบจุลินทรีย์บริสุทธิ์โดยใช้
เงื่อนไขการผสมข้ามพันธุ์เดียวกัน ในการตัดตอนร่างกาย
ได้ดำเนินการจากที่เลือก Uni-ZAP XR
โคลนยีนตามคำแนะนำของผู้ผลิต
(Stratagene) และ recombinant pBluescript
SK (-) ที่มีโคโลนีที่ได้รับ
จากการติดเชื้อของ phagemid XL1 ฟ้าสายพันธุ์
(Stratagene)