DNA extraction methods- Alkaline ly

DNA extraction methods
- Alkaline lysis extraction:
DNA extraction was modified from a
previously instruction (18) Briefly, individual microfilariae
were suspended in a 0.2 ml thin-wall PCR tube
containing 5 μl lysis buffer (0.05% SDS and 0.025N
NaOH). Samples were incubated in a heat block at
95 °C for 15 min, spun down, and resuspended in
195-μl sterile deionized water. All DNA extractions
were stored at -20 °C until use.
- MagNA Pure extraction:
Individual microfilariae were suspended and
digested in a 1.5 ml microcentrifuge tube containing
90 μl lysis buffer (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 50 mM
KCl, 2.5 mM MgCl2, 0.5% Tween 20, 150 μg/ml
Proteinase K). Samples were then incubated in a
65 °C water bath for 3 h and enzyme activity was
inactivated by incubation in a heat block at 90 °C for
10 min. DNA extraction was performed using MagNA
Pure LC DNA Isolation Kit II (tissue) and the MagNA
Pure automated extractor (Roche Diagnostics,
Indianapolis, IN) according to manufacturers’
protocol. In brief, the isolation procedure is based
on magnetic-bead technology. The samples were
lysed by incubation with 300 μl of a special lysis buffer
containing a chaotropic salt and 100 μl of proteinase
K. Magnetic glass particles were added, and total
nucleic acids contained in the sample were bound to
their surface. Unbound substances were removed
with several washing steps: then the purified total
nucleic acid was eluted with 200 μl of low-salt
buffer. (19) All DNA extractions were stored at -20 °C
until use.
- Phenol-chloroform extraction:
Individual microfilariae were lysed and
enzymatic activities inactivated, as described
above. DNA was extracted with equal volumes of
phenol : chloroform : isoamyl alcohol (25:24:1) by
centrifugation at 15,300 g for 5 min. The aqueous
phase (upper phase) was transferred into a fresh tube,
and sequentially extracted using one volume of
chloroform. DNA was precipitated by the addition of
2.5 volume of ice-cold absolute ethanol and 0.1
volume of 3 M sodium acetate pH 5.2 at -70 °C for
30 min. The precipitate was centrifuged at 18,000 g
(4 °C) for 30 min. The pellet was washed with cold
70% ethanol, allowed to air dry, and resuspended
in 200 μl of sterile deionized water. (20) All DNA
extractions were stored at -20 °C until use.
The D. immitis microfilarial DNA samples
from 1, 10, and 100 microfilariae were prepared in
200-μl final volume and 5 μl of DNA samples
(equivalent to 0.025, 0.25, 2.5 microfilariae per
reaction, respectively) were used in qPCR.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

วิธีการสกัดดีเอ็นเอ-ด่าง lysis แยก:สกัดดีเอ็นเอล่าสุดจากการก่อนหน้านี้คำแนะนำ (18) สั้น ๆ แต่ละ microfilariaeถูกหยุดชั่วคราวในหลอด PCR ผนังบาง 0.2 mlประกอบด้วย 5 μl lysis บัฟเฟอร์ (0.05% SDS และ 0.025NNaOH) ตัวอย่างที่ incubated ในช่วงความร้อนที่95 ° C สำหรับ 15 นาที ปั่นลง และ resuspended ในน้ำ deionized ใส่ 195-μl สกัดดีเอ็นเอทั้งหมดถูกเก็บไว้ที่-20 ° C จนกว่าจะใช้-MagNA Pure แยก:แต่ละ microfilariae ถูกหยุดชั่วคราว และย่อยในตัว 1.5 ml microcentrifuge หลอดที่ประกอบด้วย90 μl lysis บัฟเฟอร์ (20 มม.ทริสเรทติ้ง HCl pH 8.0, 50 มม.KCl, MgCl2 2.5 มม. 0.5% Tween 20, μg 150 mlProteinase K) ตัวอย่างได้แล้ว incubated ในการมีห้องน้ำ 65 ° C สำหรับกิจกรรม 3 h และเอนไซม์ยกเลิก โดยคณะทันตแพทยศาสตร์ในช่วงความร้อนที่ 90 ° C สำหรับทำการสกัดดีเอ็นเอ 10 นาทีใช้ MagNAบริสุทธิ์ LC ดีเอ็นเอแยกชุด (เนื้อเยื่อ) II และ MagNAระบายอัตโนมัติบริสุทธิ์ (Roche วินิจฉัยอินเดียนาโพลิส IN) ตามของผู้ผลิตโพรโทคอลการ สังเขป ขั้นตอนการแยกอยู่เทคโนโลยีแม่เหล็กลูกปัด ตัวอย่างดีlysed โดยคณะทันตแพทยศาสตร์กับ 300 μl บัฟเฟอร์ lysis พิเศษประกอบด้วยการ chaotropic เกลือ และ 100 μl ของ proteinaseอนุภาคแม่เหล็กคุณแก้วได้เพิ่ม และรวมกรดนิวคลีอิกที่มีอยู่ในตัวอย่างถูกผูกไว้กับพื้นผิวของพวกเขา ผูกสารออกมีหลายขั้นตอนซักผ้า: รวมบริสุทธิ์แล้วกรดนิวคลีอิกมี eluted กับ μl 200 ของเกลือต่ำบัฟเฟอร์ (19) สกัดดีเอ็นเอทั้งหมดถูกเก็บไว้ที่-20 ° Cจนกว่าจะใช้-คลอโรฟอร์มวางแยก:Microfilariae ละได้ lysed และยกเลิก ดังที่กิจกรรมเอนไซม์ในระบบข้างต้น ดีเอ็นเอที่สกัด ด้วยปริมาณเท่ากันวาง: คลอโรฟอร์ม: isoamyl แอลกอฮอล์ (25:24:1) โดยcentrifugation ที่ g 15,300 ใน 5 นาที การอควีขั้นตอน (ขั้นตอนด้านบน) ถูกโอนย้ายไปยังหลอดสดและแยกตามลำดับโดยใช้ระดับหนึ่งคลอโรฟอร์ม มีการตกตะกอนดีเอ็นเอ โดยการเพิ่มปริมาตร 2.5 ของเอทานอลนอนฉ่ำและ 0.1ปริมาตรของ 3 M โซเดียม acetate pH 5.2 ที่-70 ° C สำหรับ30 นาที Precipitate ถูก centrifuged ที่ g 18000(4 ° C) สำหรับ 30 นาที เม็ดถูกล้าง ด้วยน้ำเย็นเอทานอล 70% อนุญาตให้อากาศแห้ง และ resuspendedใน μl 200 กระบอกน้ำ deionized (20) ดีเอ็นเอทั้งหมดสกัดถูกเก็บไว้ที่-20 ° C จนกว่าจะใช้ดีเอ็นเอตัวอย่าง microfilarial D. immitisจาก 1, 10 และ 100 microfilariae ถูกเตรียมไว้ในปริมาตรสุดท้าย 200-μl และ μl 5 ตัวอย่างดีเอ็นเอ(เทียบเท่ากับ 0.025, 0.25, 2.5 microfilariae ต่อปฏิกิริยา ตามลำดับ) ใช้ใน qPCR การ

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

วิธีการสกัดดีเอ็นเอ
- สกัดสลายอัลคาไลน์:
การสกัดดีเอ็นเอถูกปรับเปลี่ยนจากคำสั่งก่อนหน้านี้ (18) สั้น ๆ , microfilariae บุคคลที่ถูกระงับใน0.2 มล. หลอดผอมผนัง PCR ที่มี 5 บัฟเฟอร์สลายไมโครลิตร (0.05% SDS และ 0.025N NaOH) ตัวอย่างถูกบ่มในการป้องกันความร้อนที่95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 15 นาทีหมุนลงและ resuspended ใน195 ไมโครลิตรน้ำปราศจากไอออนผ่านการฆ่าเชื้อ สกัดดีเอ็นเอทั้งหมดถูกเก็บไว้ที่ -20 ° C จนการใช้งาน. - Magna สกัดบริสุทธิ์: microfilariae ส่วนบุคคลที่ถูกระงับและย่อยสลายได้ใน1.5 มล. หลอดไมโครมี90 ไมโครลิตรบัฟเฟอร์สลาย (20 มิลลิค่า pH Tris-HCl 8.0 50 มิลลิKCl 2.5 มิลลิ MgCl2, 0.5% Tween 20 150 ไมโครกรัม / มิลลิลิตรProteinase K) ตัวอย่างถูกบ่มแล้วใน65 ° C อ่างน้ำเป็นเวลา 3 ชั่วโมงและกิจกรรมของเอนไซม์ถูกยกเลิกโดยการบ่มในการป้องกันความร้อนที่90 องศาเซลเซียสเป็นเวลา10 นาที การสกัดดีเอ็นเอได้รับการดำเนินการโดยใช้ Magna บริสุทธิ์ LC ดีเอ็นเอแยก Kit II (เนื้อเยื่อ) และ Magna ระบายอัตโนมัติบริสุทธิ์ (Roche Diagnostics, อินเดียแนโพลิ) ตามที่ผู้ผลิตโพรโทคอ ในช่วงสั้น ๆ ขั้นตอนการแยกจะขึ้นอยู่กับเทคโนโลยีแม่เหล็กลูกปัด กลุ่มตัวอย่างถูกlysed โดยบ่ม 300 ไมโครลิตรของบัฟเฟอร์สลายพิเศษที่มีส่วนผสมของเกลือchaotropic และ 100 ไมโครลิตรของโปรเค อนุภาคแม่เหล็กแก้วถูกเพิ่มและรวมกรดนิวคลีอิกที่มีอยู่ในตัวอย่างที่ถูกผูกไว้กับพื้นผิวของพวกเขา สารหลุดถูกถอดออกด้วยขั้นตอนการซักผ้าหลายแล้วรวมบริสุทธิ์กรดนิวคลีอิกถูกชะ200 ไมโครลิตรของเกลือต่ำบัฟเฟอร์ (19) สกัดดีเอ็นเอทั้งหมดถูกเก็บไว้ที่ -20 ° C จนการใช้งาน. - สกัดฟีนอล-คลอโรฟอร์ม: microfilariae ส่วนบุคคลถูก lysed และกิจกรรมของเอนไซม์การใช้งานตามที่อธิบายไว้ข้างต้น ดีเอ็นเอถูกสกัดด้วยปริมาณที่เท่ากันของฟีนอล: คลอโรฟอร์ม: isoamyl เครื่องดื่มแอลกอฮอล์ (25: 24: 1) โดยการหมุนเหวี่ยงที่15,300 กรัมเป็นเวลา 5 นาที น้ำเฟส (เฟสบน) ถูกย้ายลงในหลอดสดและลำดับที่สกัดโดยใช้ปริมาณหนึ่งคลอโรฟอร์ม ดีเอ็นเอตกตะกอนโดยนอกเหนือจาก2.5 ปริมาณเอทานอลที่แน่นอนเย็น 0.1 และปริมาณของ3 เอ็มพีเอชโซเดียมอะซิเตท 5.2 ที่อุณหภูมิ -70 องศาเซลเซียสเป็นเวลา30 นาที ตะกอนถูกหมุนเหวี่ยงที่ 18,000 กรัม(4 ° C) เป็นเวลา 30 นาที เม็ดถูกล้างด้วยเย็นเอทานอล 70% ได้รับอนุญาตให้อากาศแห้งและ resuspended ใน 200 ไมโครลิตรน้ำปราศจากไอออนผ่านการฆ่าเชื้อ (20) ทั้งหมดดีเอ็นเอสกัดถูกเก็บไว้ที่-20 ° C จนการใช้งาน. D. immitis ตัวอย่างดีเอ็นเอ microfilarial ตั้งแต่วันที่ 1, 10, และ 100 microfilariae ได้จัดทำเล่มสุดท้าย200 ไมโครลิตรและ 5 ไมโครลิตรของตัวอย่างดีเอ็นเอ(เทียบเท่า 0.025, 0.25, 2.5 microfilariae ต่อปฏิกิริยาตามลำดับ) ถูกนำมาใช้ใน qPCR

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การสกัดดีเอ็นเอวิธี การสกัดการสลาย

ด่าง : การสกัดดีเอ็นเอถูกดัดแปลงจาก
ก่อนหน้านี้การเรียนการสอน ( 18 ) สั้น ๆ ,
บบุคคลถูกระงับใน 0.2 มล. Thin - Wall PCR หลอด
ที่มี 5 μ L การสลายบัฟเฟอร์ ( 0.05 % SDS และ 0.025n
NaOH ) ตัวอย่างที่บ่มในความร้อนบล็อกที่
95 องศา C เป็นเวลา 15 นาทีปั่นลง และ resuspended ใน
195 - μผมเป็นหมันคล้ายเนื้อเยื่อประสานน้ำ การสกัดดีเอ็นเอ
ทั้งหมดเก็บรักษาที่อุณหภูมิ - 20 องศา C จนกระทั่งใช้ .
- Magna สกัดบริสุทธิ์ :

บบุคคลถูกหยุดชั่วคราว และย่อยใน 1.5 ml หลอดไมโครเซนตริฟิวจ์ที่มี
90 μ l การสลายบัฟเฟอร์ ( 20 มม. จากกรดไฮโดรคลอริก pH 8.0 , 50 mm
KCl 2.5 มม. ชุด 0.5 % Tween 20 , 150 μกรัม / มิลลิลิตร
โปร K ) จำนวนแล้วบ่มใน
65 องศา C น้ำอาบและกิจกรรมเอนไซม์
3 Hการศึกษาการฟักไข่ในบล็อกความร้อนที่ 90 ° C
10 นาที ทำการสกัดดีเอ็นเอโดยใช้ Magna
บริสุทธิ์ LC การสกัดดีเอ็นเอชุด 2 ( เนื้อเยื่อ ) และกฎหมายสกัดบริสุทธิ์ ( โรชวินิจฉัยอัตโนมัติ

, Indianapolis , IN ) ตามขั้นตอนของผู้ผลิต

ในช่วงสั้น ๆ , ขั้นตอนการแยกใช้
เทคโนโลยีลูกปัดแม่เหล็ก จำนวน
lysed โดยการบ่มด้วย 300 μลิตรพิเศษการสลายบัฟเฟอร์
ที่มีเกลือ chaotropic และ 100 μ l โปร
K . แก้วพบอนุภาคแม่เหล็กเพิ่มและรวม
กรดนิวคลีอิกมีจำนวนจำกัด

ผิวของพวกเขา จับกับสารออก
มีหลายขั้นตอนการล้าง แล้วนำทั้งหมด
กรดนิวคลีอิกคือตัวอย่าง 200 ลิตร กันชนμเกลือ
น้อย( 19 ) การสกัดดีเอ็นเอทั้งหมดถูกเก็บไว้ที่ - 20 ° C

- ฟีนอลจนใช้คลอโรฟอร์มสกัด :

lysed บแต่ละตัวและกิจกรรมเอนไซม์ไฮโดร
ตามที่อธิบายไว้ข้างต้น ดีเอ็นเอที่มีปริมาณเท่ากันของ
ฟีนอล : คลอโรฟอร์ม : แอลกอฮอล์ในปริมาณ ( 25:24:1 )
3 ที่ 15 , 300 กรัม ต่อน้ำ 5 นาที ระยะ
( บนเฟส ) ถูกย้ายเข้าไปในหลอดสด
เป็นสารสกัดที่ใช้และปริมาณ
คลอโรฟอร์ม ดีเอ็นเอตกตะกอนโดยนอกเหนือจาก
2.5 ปริมาณเย็นแน่นอนและปริมาณของเอทานอล 1
3 M โซเดียมอะซิเตต pH 5.2 ที่ - 70 องศา C
30 นาที ที่เป็นระดับที่ 18 , 000 g
( 4 ° C ) เป็นเวลา 30 นาที เม็ดล้างด้วยแอลกอฮอล์ 70% หนาว
ได้รับอนุญาตอากาศแห้ง และ resuspended
200 μลิตรปลอดเชื้อคล้ายเนื้อเยื่อประสานน้ำ( 20 ) การสกัดดีเอ็นเอ
ทั้งหมดเก็บไว้ที่ - 20 ° C จนกระทั่งใช้ immitis
D
microfilarial ตัวอย่างดีเอ็นเอจาก 1 , 10 และ 100 บเตรียมใน
200 - μ L สุดท้ายปริมาณ 5 ลิตรและμดีเอ็นเอ
( เท่ากับ 0.025 , 0.25 , 2.5 บต่อ
ปฏิกิริยา ตามลำดับ ) จำนวน qpcr .