2.4. Determination of chitinolytic

2.4. Determination of chitinolytic activity
The fluorogenic substrates 4-methylumbelliferyl-b-D-N,N0, N0-triacetylchitotriose
[4-MU-(GlcNAc)3], 4-methylumbelliferyl-b-D-N, N0-
diacetylchitobioside [4-MU-(GlcNAc)2] and 4-methylumbelliferyl-Nacetyl-
b-D-glucosaminide [4-MU-GlcNAc] were used to detect endochitinases,
exochitinases and N-acetylhexosaminidases, respectively
(McCreath and Gooday, 1992; Lindahl and Finlay, 2005). Substrates
were supplied by SigmaeAldrich. Stock solutions of fluorogenic
substrateswere prepared in 50% ethanol at a concentration of 0.8mM
and stored at 20
C. The reaction mixture contained: 1 ml crude
enzymes, 0.125 ml substrate 4MU- (GlcNac)1e3 solution (the final
concentration in a sample was 50 mM/L and 0.125 ml of phosphate
buffer (50mM, pH7). Themixturewas incubated for 1 h in the dark at
40
C. The control, prior to addition of the substrate,was treated with
0.1ml solution of HgCl2 in order to deactivate the enzymes present in
the sample (final concentration: 4mM/l). Themixturewas incubated
for 1 h in the dark at 40
C. After incubation, enzymatic
reactions were stopped by adding HgCl2. The released 4-methy
lumbelliferone (MU) was measured fluorimetrically at 318 nm excitation
and 445 nm emission using the Hitachi F 2500 spectrofluorometer.
One unit of enzyme activity (U)was defined as the amount of
enzyme required to release 1 nM MU/mg protein/h. Protein content
was determined according tomethod of Bradford (1976) with bovine
serum albumin as a standard

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.4 การกำหนดกิจกรรม chitinolytic
fluorogenic พื้นผิว 4-methylumbelliferyl-b-D-N, N0, N0-triacetylchitotriose
[4 -หมู- (GlcNAc) 3], 4-methylumbelliferyl-b-D-N, N0-
diacetylchitobioside [4 -หมู- (GlcNAc) 2] และ 4-methylumbelliferyl-Nacetyl-
b-D-glucosaminide [4 หมู่ GlcNAc] ใช้ในการตรวจหา endochitinases,
exochitinases N-acetylhexosaminidases และตามลำดับ
(McCreath และ Gooday, 1992 Lindahl ก Finlay, 2005) พื้นผิว
ถูกจัดทำ โดย SigmaeAldrich หุ้นโซลูชั่นของ fluorogenic
substrateswere ที่เตรียมไว้ใน 50% เอทานอลที่ความเข้มข้น 0.8 มม.
และเก็บไว้ที่ 20 เซลเซียส ผสมปฏิกิริยาที่อยู่: มลดิบ 1
เอนไซม์ 4MU พื้นผิว 0.125 ml - โซลูชัน 1e3 (GlcNac) (สุดท้าย
ความเข้มข้นในตัวอย่างคือ 50 mM/L และ ml 0.125 ของฟอสเฟต
บัฟเฟอร์ (50 มม. pH7) Themixturewas incubated สำหรับ h 1 ในมืดที่
40 เซลเซียส ได้รับการควบคุม ก่อนการเพิ่มพื้นผิว
0.1 ml โซลูชันของ HgCl2 เพื่อปิดใช้งานเอนไซม์ใน
ตัวอย่าง (ความเข้มข้นสุดท้าย: 4 mM/l) Themixturewas incubated
สำหรับ h 1 ในมืดที่ 40 เซลเซียส หลังจากบ่ม เอนไซม์ในระบบ
ปฏิกิริยาได้ถูกหยุด โดยเพิ่ม HgCl2 จะออก 4 methy
lumbelliferone (หมู) ที่วัด fluorimetrically ที่ 318 nm ในการกระตุ้น
และ 445 nm ใช้ spectrofluorometer 2500 F ฮิตาชิอยู่
หน่วยหนึ่งของเอนไซม์ (U) ถูกกำหนดเป็นจำนวน
ต้องปล่อย 1 nM หมู่/มิลลิกรัม โปรตีน/h. โปรตีนเอนไซม์
กำหนดตาม tomethod ของแบรดฟอร์ด (1976) กับวัว
serum albumin เป็นมาตรฐาน

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.4 การกำหนดกิจกรรม chitinolytic
พื้นผิว fluorogenic 4 methylumbelliferyl-BDN, N0, N0-triacetylchitotriose
[4-MU-(GlcNAc) 3] 4 methylumbelliferyl-BDN, N0-
diacetylchitobioside [4-MU-(GlcNAc) 2] และ 4 -methylumbelliferyl-Nacetyl-
BD-glucosaminide [4-MU-GlcNAc] ถูกนำมาใช้ในการตรวจสอบ endochitinases,
exochitinases และ N-acetylhexosaminidases ตามลำดับ
(McCreath และ Gooday, 1992; ริและฟินเลย์, 2005) พื้นผิวที่
ถูกจัดทำโดย SigmaeAldrich การแก้ปัญหาการสต็อกสินค้าของ fluorogenic
substrateswere จัดทำขึ้น 50% เอทานอลที่ความเข้มข้น 0.8mm
และเก็บไว้ที่? 20? C. ผสมปฏิกิริยาที่มี: 1 มล. ดิบ
เอนไซม์ 0.125 มล. สารตั้งต้น 4MU (GlcNAc) วิธีการ 1E3 (สุดท้าย
ความเข้มข้นในกลุ่มตัวอย่างเป็น 50 มิลลิ / ลิตรและ 0.125 มิลลิลิตรของฟอสเฟต
บัฟเฟอร์ (50mm, PH7) Themixturewas บ่มเป็นเวลา 1 ชั่วโมงใน. สีเข้มที่
40 C. การควบคุมก่อนที่จะมีการเพิ่มขึ้นของสารตั้งต้นที่ได้รับการรักษาด้วย
วิธีการแก้ปัญหาของ 0.1ml HgCl2 เพื่อยกเลิกการใช้งานเอนไซม์ที่มีอยู่ใน
ตัวอย่าง (ความเข้มข้นสุดท้าย: 4mm / ลิตร). Themixturewas บ่ม
เป็นเวลา 1 ชั่วโมงใน สีเข้มที่ 40? C. หลังจากการบ่มเอนไซม์
ปฏิกิริยาถูกหยุดโดยการเพิ่ม HgCl2. เปิดตัว 4 methy
lumbelliferone (MU) วัด fluorimetrically ที่ 318 นาโนเมตรการกระตุ้น
และ 445 นาโนเมตรโดยใช้การปล่อย Hitachi F 2500 spectrofluorometer
หน่วยหนึ่งในกิจกรรมของเอนไซม์ (U) ถูกกำหนดเป็นปริมาณของ
เอนไซม์ที่จำเป็นในการปล่อย 1 นาโนเมตร MU / โปรตีน mg / ชั่วโมง. ปริมาณโปรตีน
ถูกกำหนดตาม tomethod ของ Bradford (1976) ที่มีวัว
อัลบูมิเซรั่มที่เป็นมาตรฐาน

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.4 . การกำหนดกิจกรรม chitinolytic
4-methylumbelliferyl-b-d-n , พื้นผิว fluorogenic NO NO triacetylchitotriose ,
( N - ชีวิต 3 ] 4-methylumbelliferyl-b-d-n NO , -
diacetylchitobioside ( N - ชีวิต 2 ] และ 4-methylumbelliferyl-nacetyl -
b-d-glucosaminide [ 4-mu-glcnac ] ถูกใช้เพื่อตรวจสอบ endochitinases
exochitinases , และ n-acetylhexosaminidases ตามลำดับ
( McCreath gooday และ , 1992 ;ลินดัล และ ฟินเลย์ , 2005 ) พื้นผิว
ถูกจัดโดย sigmaealdrich . หุ้นโซลูชั่นของ fluorogenic
substrateswere เตรียมในเอทานอล 50% ที่ความเข้มข้นของ 0.8mm
และเก็บไว้ที่  20
C . ปฏิกิริยาผสมที่มีอยู่ : 1 มิลลิลิตรเอนไซม์ดิบ
0.125 มล. ( 4mu - ชีวิต 1e3 โซลูชั่น ( ความเข้มข้นสุดท้าย
ในตัวอย่างคือ 50 มม. และ 0.125 มล. / ล. ฟอสเฟตบัฟเฟอร์
( 50mm การสกัด , )themixturewas บ่มเป็นเวลา 1 ชั่วโมงในที่มืดที่
40
C ควบคุม ก่อนที่จะเพิ่มพื้นผิว ถูกปฏิบัติ ด้วย
0.1ml แก้ไข hgcl2 เพื่อยกเลิกใช้เอนไซม์ที่มีอยู่ใน
ตัวอย่าง ( ความเข้มข้นสุดท้าย 4 / L ) themixturewas )
1 H ในที่มืดที่อุณหภูมิ 40
C หลังจากบ่มปฏิกิริยาเอนไซม์
ถูกหยุดโดยการเพิ่ม hgcl2 . ออก 4-methy
lumbelliferone ( MU ) วัด fluorimetrically ที่ 318 nm ความตื่นเต้นและการใช้
445 nm สำหรับ F 2 , 500 spectrofluorometer .
หนึ่งหน่วยของเอนไซม์ ( U ) ถูกกำหนดไว้เป็นจํานวน
เอนไซม์ต้องปล่อย 1 nm MU / mg protein / H .
โปรตีนถูกกำหนดตาม tomethod ของแบรดฟอร์ด ( 1976 ) วัว
อัลบูมินเป็นมาตรฐาน