- ข้อความ
- ประวัติศาสตร์
The current flowing in the exposure
The current flowing in the exposure devices was monitored by AC current meter connected in series and the waveform and the frequency were monitored by a scope connected in parallel to a resistor in series with the coil. The voltage and frequency stability are those of the power line distribution (10% max for voltage and 2% for the frequency). The knowledge of the space uniformity of magnetic field inside the devices is important mainly for the reproducibility of the experimental conditions in different trials [37] (Fig. 1). In preliminary experiments (sham field experiments), we excluded any influence of the experimental devices on environmental parameters such as temperature or gases tension. For the in vitro exposition to magnetic field the samples were positioned in a central area (were the maximum B variation from centre value was 2.2%) of coronal plexiglas plane inserted into the solenoid stationed inside an humidified incubator (Heraeus, Hera Cell) at 38.5 °C, 5%CO2. The in vivo exposition was obtained inserting one oviduct on the coil and maintaining the contra lateral as control.
The frequency and harmonics components of the current flowing in the exposition devices were monitored through the voltage on 1 ohm resistor in series with the coil by a scope – FFT analyser (Tektronics TDS 1002). In the frequency spectrum the 50 Hz component was observed without other significant harmonics.
2.3. In vitro sperm capacitation
Semen samples were collected every three days by the gloved-hand technique from 2 boars of proven fertility. The seminal plasma was removed by centrifugation through a two-step 35% and 70% isotonic Percoll discontinuous gradient [37] and [38], to select motile cells. After removal of the supernatant layers, the resultant loose pellet was resuspended in residual 70% Percoll and washed by centrifugation at 800 g for 10 min in Dulbecco's medium-PBS with Ca2+, Mg2+ and 0.4%BSA. The pellet was then diluted in capacitation medium (TCM 199 supplemented with 10% FCS, calcium lactate 2.25 mM, sodium pyruvate 1.25 mM and glucose 13.9 mM) to evaluate cell viability and to determine sample concentration. The spermatozoa were incubated to a final concentration of 2 × 108 spermatozoa/ml at 38.5 °C with 5% CO2 in an humidified atmosphere incubator (Heraeus, Hera Cell) for 4 h. Before starting incubation the spermatozoa were divided in control groups (CTR) and ELF-EMF exposed. In detail, the ELF-EMF-treated spermatozoa were firstly incubated 1.5 h without exposition, then exposed to a sinusoidal field with 50 Hz frequency and intensity ranging between 0 and 2 mT at 0.25 mT of interval for 1 h and cultured for further 1.5 h under CTR conditions. The CTR samples, incubated into the same incubator but maintained far from the solenoid (35 cm, with the sample upper the solenoid) where the magnetic field, evaluated with triaxial Wandel & Goltermann EM field analyzer EFA-300, resulted indistinguishable from the ground level.
2.4. Morpho-functional evaluation of in vitro capacitated spermatozoa
The sperm viability before and at the end of the incubation was assessed by live/dead™ kit (Molecular Probes) following the manufacturer indications. To evaluate and quantify the effect of ELF-EMF on the acrosome integrity on live spermatozoa, two staining techniques were associated, Hoechst 33258 and FITC-PSA, as previously described [37]. For each sample at least 200 alive spermatozoa on two different slides were analysed.
The total DNA was extracted from CTR and ELF treated spermatozoa, as described by Kao et al to verify if the EMFs exposure could affect DNA integrity. [39]. Briefly, the CTR and exposed samples were pelleted by a 5000 g centrifugation to obtain 5 × 107 cells pellet. The pellets were resuspended in lysis buffer (Tris-HCl 50 mM, 2%SDS, 10 mM dithiothreitol, 100 μg/ml Proteinase K, pH 8.3) at 56 °C for 2 h. At the end of the lysis the Proteinase K was inhibited by an incubation for 5 min at 100 °C. After 5.000 g centrifugation the supernatant extraction with phenol-chloroform (1:1 v/v) was carried out. The obtained samples were precipitated in isopropanol 1:1 v/v and Na-acetate 1:10 3 M, pH5.6. After an incubation at −20 °C the DNA was washed with ethanol 75% and dried in air. To perform the electrophoresis the samples were rinsed in H2Odd and 0.8% agarose gel was used.
Finally, the competence of in vitro cultured spermatozoa to reach the functional endpoint of the capacitation was assessed evaluating the acrosomal exocytosis after the administration of solubilized zonae pellucide (sZP), the physiological agonist of AR (37). To this aim, aliquots of CTR and ELF-treated spermatozoa were coincubated for 30 min with sZP (10ZP/μl), obtained as previously described [40]. At the end of the co-incubation, the incidence of ZP-induced AR of alive spermatozoa was quantified by using the two staining techniques (FITC-PSA and Hoechst) as above described. In detail, the total AR recorded at the end of the co-incubation was subtracted of the spontaneous AR recorded before to obtain the incidence of the true sZP-induced AR.
2.5. IVF assay
To study the effect of ELF-EMF field exposure on spermatozoa fertilizing ability a set of IVF was carried out, adopting the field parameters determined in the previous experiments (maximum, minimum and DT50). The oocytes collection and maturation was carried out as described [37] and the IVF was performed according to a previously validated protocol [40], [41] and [42] by using control and exposed to 0.5, 0.75 and 1 mT in vitro capacitated spermatozoa. To obtain the fertilization of at least part of the oocytes in each experimental group and in the expectation of an adverse effect of MF on the fertilizing ability of spermatozoa, a high concentration of cells (0.5 × 107 motile spermatozoa/ml) was used. After 1 h of incubation in the presence of spermatozoa, the oocytes were gently removed from the Petri dish, transferred in fresh medium and maintained in culture for at least 8 h. We carried out three independent determination using in each experimental groups 35-40 oocytes. To quantify the effect of MF on spermatozoa fertilizing ability at the end of incubation the fertilization rate (% of penetrated oocytes), the incidence of polyspermy (% of polyspermic oocytes) and the mean number of penetrating spermatozoa/polyspermic oocyte were recorded according to Abeydeera [43] and [44]. To this aim, oocytes were mounted on a slide, were fixed in ethanol and acetic acid (3/1 v/v) and were assessed under a Nikon Eclipse E600 microscope (40X) after Lacmoid staining.
2.6. In vivo experimental protocols
Two different experimental protocols were carried out (see explicative scheme Fig. 2) to study the effect of the ELF- EMF exposure of spermatozoa stored in the oviducts on the process of fertilization and early embryo development. The surgical approach was due to the need to avoid possible systemic neuro-endocrine effect occurring in the whole animal exposure. In the first one, named protocol A (PA), uterine tubes were exposed to the different ELF-EMF in the presence of spermatozoa 0-4 h before ovulation. Under this experimental protocol, the ELF-EMF exposure effects were reproduced both on spermatozoa and on the female genital tract. In the second protocol, named protocol B (PB), the oviducts were exposed to the different ELF-EMF fields in the absence of spermatozoa 0-4 h before ovulation. In this experimental approach, the in vitro capacitated spermatozoa were inserted at the end of field exposure. Under this experimental protocol, it was evaluated exclusively the influence of ELF-EMF on the female genital tract. More in detail, in prepubertal gilts of 91.1 ± 3.1 Kg the oestrus cycle was promoted by using a validated hormonal treatment [45] and [46]: follicular growth was stimulated by injecting IM 1250 UI eCG (Folligon, Intervet, MI) and approximately 64 h later, the ovulation was induced with 750 UI hCG (Corulon, Intervet, MI), in 40-44 h.
The frequency and harmonics components of the current flowing in the exposition devices were monitored through the voltage on 1 ohm resistor in series with the coil by a scope – FFT analyser (Tektronics TDS 1002). In the frequency spectrum the 50 Hz component was observed without other significant harmonics.
2.3. In vitro sperm capacitation
Semen samples were collected every three days by the gloved-hand technique from 2 boars of proven fertility. The seminal plasma was removed by centrifugation through a two-step 35% and 70% isotonic Percoll discontinuous gradient [37] and [38], to select motile cells. After removal of the supernatant layers, the resultant loose pellet was resuspended in residual 70% Percoll and washed by centrifugation at 800 g for 10 min in Dulbecco's medium-PBS with Ca2+, Mg2+ and 0.4%BSA. The pellet was then diluted in capacitation medium (TCM 199 supplemented with 10% FCS, calcium lactate 2.25 mM, sodium pyruvate 1.25 mM and glucose 13.9 mM) to evaluate cell viability and to determine sample concentration. The spermatozoa were incubated to a final concentration of 2 × 108 spermatozoa/ml at 38.5 °C with 5% CO2 in an humidified atmosphere incubator (Heraeus, Hera Cell) for 4 h. Before starting incubation the spermatozoa were divided in control groups (CTR) and ELF-EMF exposed. In detail, the ELF-EMF-treated spermatozoa were firstly incubated 1.5 h without exposition, then exposed to a sinusoidal field with 50 Hz frequency and intensity ranging between 0 and 2 mT at 0.25 mT of interval for 1 h and cultured for further 1.5 h under CTR conditions. The CTR samples, incubated into the same incubator but maintained far from the solenoid (35 cm, with the sample upper the solenoid) where the magnetic field, evaluated with triaxial Wandel & Goltermann EM field analyzer EFA-300, resulted indistinguishable from the ground level.
2.4. Morpho-functional evaluation of in vitro capacitated spermatozoa
The sperm viability before and at the end of the incubation was assessed by live/dead™ kit (Molecular Probes) following the manufacturer indications. To evaluate and quantify the effect of ELF-EMF on the acrosome integrity on live spermatozoa, two staining techniques were associated, Hoechst 33258 and FITC-PSA, as previously described [37]. For each sample at least 200 alive spermatozoa on two different slides were analysed.
The total DNA was extracted from CTR and ELF treated spermatozoa, as described by Kao et al to verify if the EMFs exposure could affect DNA integrity. [39]. Briefly, the CTR and exposed samples were pelleted by a 5000 g centrifugation to obtain 5 × 107 cells pellet. The pellets were resuspended in lysis buffer (Tris-HCl 50 mM, 2%SDS, 10 mM dithiothreitol, 100 μg/ml Proteinase K, pH 8.3) at 56 °C for 2 h. At the end of the lysis the Proteinase K was inhibited by an incubation for 5 min at 100 °C. After 5.000 g centrifugation the supernatant extraction with phenol-chloroform (1:1 v/v) was carried out. The obtained samples were precipitated in isopropanol 1:1 v/v and Na-acetate 1:10 3 M, pH5.6. After an incubation at −20 °C the DNA was washed with ethanol 75% and dried in air. To perform the electrophoresis the samples were rinsed in H2Odd and 0.8% agarose gel was used.
Finally, the competence of in vitro cultured spermatozoa to reach the functional endpoint of the capacitation was assessed evaluating the acrosomal exocytosis after the administration of solubilized zonae pellucide (sZP), the physiological agonist of AR (37). To this aim, aliquots of CTR and ELF-treated spermatozoa were coincubated for 30 min with sZP (10ZP/μl), obtained as previously described [40]. At the end of the co-incubation, the incidence of ZP-induced AR of alive spermatozoa was quantified by using the two staining techniques (FITC-PSA and Hoechst) as above described. In detail, the total AR recorded at the end of the co-incubation was subtracted of the spontaneous AR recorded before to obtain the incidence of the true sZP-induced AR.
2.5. IVF assay
To study the effect of ELF-EMF field exposure on spermatozoa fertilizing ability a set of IVF was carried out, adopting the field parameters determined in the previous experiments (maximum, minimum and DT50). The oocytes collection and maturation was carried out as described [37] and the IVF was performed according to a previously validated protocol [40], [41] and [42] by using control and exposed to 0.5, 0.75 and 1 mT in vitro capacitated spermatozoa. To obtain the fertilization of at least part of the oocytes in each experimental group and in the expectation of an adverse effect of MF on the fertilizing ability of spermatozoa, a high concentration of cells (0.5 × 107 motile spermatozoa/ml) was used. After 1 h of incubation in the presence of spermatozoa, the oocytes were gently removed from the Petri dish, transferred in fresh medium and maintained in culture for at least 8 h. We carried out three independent determination using in each experimental groups 35-40 oocytes. To quantify the effect of MF on spermatozoa fertilizing ability at the end of incubation the fertilization rate (% of penetrated oocytes), the incidence of polyspermy (% of polyspermic oocytes) and the mean number of penetrating spermatozoa/polyspermic oocyte were recorded according to Abeydeera [43] and [44]. To this aim, oocytes were mounted on a slide, were fixed in ethanol and acetic acid (3/1 v/v) and were assessed under a Nikon Eclipse E600 microscope (40X) after Lacmoid staining.
2.6. In vivo experimental protocols
Two different experimental protocols were carried out (see explicative scheme Fig. 2) to study the effect of the ELF- EMF exposure of spermatozoa stored in the oviducts on the process of fertilization and early embryo development. The surgical approach was due to the need to avoid possible systemic neuro-endocrine effect occurring in the whole animal exposure. In the first one, named protocol A (PA), uterine tubes were exposed to the different ELF-EMF in the presence of spermatozoa 0-4 h before ovulation. Under this experimental protocol, the ELF-EMF exposure effects were reproduced both on spermatozoa and on the female genital tract. In the second protocol, named protocol B (PB), the oviducts were exposed to the different ELF-EMF fields in the absence of spermatozoa 0-4 h before ovulation. In this experimental approach, the in vitro capacitated spermatozoa were inserted at the end of field exposure. Under this experimental protocol, it was evaluated exclusively the influence of ELF-EMF on the female genital tract. More in detail, in prepubertal gilts of 91.1 ± 3.1 Kg the oestrus cycle was promoted by using a validated hormonal treatment [45] and [46]: follicular growth was stimulated by injecting IM 1250 UI eCG (Folligon, Intervet, MI) and approximately 64 h later, the ovulation was induced with 750 UI hCG (Corulon, Intervet, MI), in 40-44 h.
0/5000
The current flowing in the exposure devices was monitored by AC current meter connected in series and the waveform and the frequency were monitored by a scope connected in parallel to a resistor in series with the coil. The voltage and frequency stability are those of the power line distribution (10% max for voltage and 2% for the frequency). The knowledge of the space uniformity of magnetic field inside the devices is important mainly for the reproducibility of the experimental conditions in different trials [37] (Fig. 1). In preliminary experiments (sham field experiments), we excluded any influence of the experimental devices on environmental parameters such as temperature or gases tension. For the in vitro exposition to magnetic field the samples were positioned in a central area (were the maximum B variation from centre value was 2.2%) of coronal plexiglas plane inserted into the solenoid stationed inside an humidified incubator (Heraeus, Hera Cell) at 38.5 °C, 5%CO2. The in vivo exposition was obtained inserting one oviduct on the coil and maintaining the contra lateral as control.
The frequency and harmonics components of the current flowing in the exposition devices were monitored through the voltage on 1 ohm resistor in series with the coil by a scope – FFT analyser (Tektronics TDS 1002). In the frequency spectrum the 50 Hz component was observed without other significant harmonics.
2.3. In vitro sperm capacitation
Semen samples were collected every three days by the gloved-hand technique from 2 boars of proven fertility. The seminal plasma was removed by centrifugation through a two-step 35% and 70% isotonic Percoll discontinuous gradient [37] and [38], to select motile cells. After removal of the supernatant layers, the resultant loose pellet was resuspended in residual 70% Percoll and washed by centrifugation at 800 g for 10 min in Dulbecco's medium-PBS with Ca2+, Mg2+ and 0.4%BSA. The pellet was then diluted in capacitation medium (TCM 199 supplemented with 10% FCS, calcium lactate 2.25 mM, sodium pyruvate 1.25 mM and glucose 13.9 mM) to evaluate cell viability and to determine sample concentration. The spermatozoa were incubated to a final concentration of 2 × 108 spermatozoa/ml at 38.5 °C with 5% CO2 in an humidified atmosphere incubator (Heraeus, Hera Cell) for 4 h. Before starting incubation the spermatozoa were divided in control groups (CTR) and ELF-EMF exposed. In detail, the ELF-EMF-treated spermatozoa were firstly incubated 1.5 h without exposition, then exposed to a sinusoidal field with 50 Hz frequency and intensity ranging between 0 and 2 mT at 0.25 mT of interval for 1 h and cultured for further 1.5 h under CTR conditions. The CTR samples, incubated into the same incubator but maintained far from the solenoid (35 cm, with the sample upper the solenoid) where the magnetic field, evaluated with triaxial Wandel & Goltermann EM field analyzer EFA-300, resulted indistinguishable from the ground level.
2.4. Morpho-functional evaluation of in vitro capacitated spermatozoa
The sperm viability before and at the end of the incubation was assessed by live/dead™ kit (Molecular Probes) following the manufacturer indications. To evaluate and quantify the effect of ELF-EMF on the acrosome integrity on live spermatozoa, two staining techniques were associated, Hoechst 33258 and FITC-PSA, as previously described [37]. For each sample at least 200 alive spermatozoa on two different slides were analysed.
The total DNA was extracted from CTR and ELF treated spermatozoa, as described by Kao et al to verify if the EMFs exposure could affect DNA integrity. [39]. Briefly, the CTR and exposed samples were pelleted by a 5000 g centrifugation to obtain 5 × 107 cells pellet. The pellets were resuspended in lysis buffer (Tris-HCl 50 mM, 2%SDS, 10 mM dithiothreitol, 100 μg/ml Proteinase K, pH 8.3) at 56 °C for 2 h. At the end of the lysis the Proteinase K was inhibited by an incubation for 5 min at 100 °C. After 5.000 g centrifugation the supernatant extraction with phenol-chloroform (1:1 v/v) was carried out. The obtained samples were precipitated in isopropanol 1:1 v/v and Na-acetate 1:10 3 M, pH5.6. After an incubation at −20 °C the DNA was washed with ethanol 75% and dried in air. To perform the electrophoresis the samples were rinsed in H2Odd and 0.8% agarose gel was used.
Finally, the competence of in vitro cultured spermatozoa to reach the functional endpoint of the capacitation was assessed evaluating the acrosomal exocytosis after the administration of solubilized zonae pellucide (sZP), the physiological agonist of AR (37). To this aim, aliquots of CTR and ELF-treated spermatozoa were coincubated for 30 min with sZP (10ZP/μl), obtained as previously described [40]. At the end of the co-incubation, the incidence of ZP-induced AR of alive spermatozoa was quantified by using the two staining techniques (FITC-PSA and Hoechst) as above described. In detail, the total AR recorded at the end of the co-incubation was subtracted of the spontaneous AR recorded before to obtain the incidence of the true sZP-induced AR.
2.5. IVF assay
To study the effect of ELF-EMF field exposure on spermatozoa fertilizing ability a set of IVF was carried out, adopting the field parameters determined in the previous experiments (maximum, minimum and DT50). The oocytes collection and maturation was carried out as described [37] and the IVF was performed according to a previously validated protocol [40], [41] and [42] by using control and exposed to 0.5, 0.75 and 1 mT in vitro capacitated spermatozoa. To obtain the fertilization of at least part of the oocytes in each experimental group and in the expectation of an adverse effect of MF on the fertilizing ability of spermatozoa, a high concentration of cells (0.5 × 107 motile spermatozoa/ml) was used. After 1 h of incubation in the presence of spermatozoa, the oocytes were gently removed from the Petri dish, transferred in fresh medium and maintained in culture for at least 8 h. We carried out three independent determination using in each experimental groups 35-40 oocytes. To quantify the effect of MF on spermatozoa fertilizing ability at the end of incubation the fertilization rate (% of penetrated oocytes), the incidence of polyspermy (% of polyspermic oocytes) and the mean number of penetrating spermatozoa/polyspermic oocyte were recorded according to Abeydeera [43] and [44]. To this aim, oocytes were mounted on a slide, were fixed in ethanol and acetic acid (3/1 v/v) and were assessed under a Nikon Eclipse E600 microscope (40X) after Lacmoid staining.
2.6. In vivo experimental protocols
Two different experimental protocols were carried out (see explicative scheme Fig. 2) to study the effect of the ELF- EMF exposure of spermatozoa stored in the oviducts on the process of fertilization and early embryo development. The surgical approach was due to the need to avoid possible systemic neuro-endocrine effect occurring in the whole animal exposure. In the first one, named protocol A (PA), uterine tubes were exposed to the different ELF-EMF in the presence of spermatozoa 0-4 h before ovulation. Under this experimental protocol, the ELF-EMF exposure effects were reproduced both on spermatozoa and on the female genital tract. In the second protocol, named protocol B (PB), the oviducts were exposed to the different ELF-EMF fields in the absence of spermatozoa 0-4 h before ovulation. In this experimental approach, the in vitro capacitated spermatozoa were inserted at the end of field exposure. Under this experimental protocol, it was evaluated exclusively the influence of ELF-EMF on the female genital tract. More in detail, in prepubertal gilts of 91.1 ± 3.1 Kg the oestrus cycle was promoted by using a validated hormonal treatment [45] and [46]: follicular growth was stimulated by injecting IM 1250 UI eCG (Folligon, Intervet, MI) and approximately 64 h later, the ovulation was induced with 750 UI hCG (Corulon, Intervet, MI), in 40-44 h.
The frequency and harmonics components of the current flowing in the exposition devices were monitored through the voltage on 1 ohm resistor in series with the coil by a scope – FFT analyser (Tektronics TDS 1002). In the frequency spectrum the 50 Hz component was observed without other significant harmonics.
2.3. In vitro sperm capacitation
Semen samples were collected every three days by the gloved-hand technique from 2 boars of proven fertility. The seminal plasma was removed by centrifugation through a two-step 35% and 70% isotonic Percoll discontinuous gradient [37] and [38], to select motile cells. After removal of the supernatant layers, the resultant loose pellet was resuspended in residual 70% Percoll and washed by centrifugation at 800 g for 10 min in Dulbecco's medium-PBS with Ca2+, Mg2+ and 0.4%BSA. The pellet was then diluted in capacitation medium (TCM 199 supplemented with 10% FCS, calcium lactate 2.25 mM, sodium pyruvate 1.25 mM and glucose 13.9 mM) to evaluate cell viability and to determine sample concentration. The spermatozoa were incubated to a final concentration of 2 × 108 spermatozoa/ml at 38.5 °C with 5% CO2 in an humidified atmosphere incubator (Heraeus, Hera Cell) for 4 h. Before starting incubation the spermatozoa were divided in control groups (CTR) and ELF-EMF exposed. In detail, the ELF-EMF-treated spermatozoa were firstly incubated 1.5 h without exposition, then exposed to a sinusoidal field with 50 Hz frequency and intensity ranging between 0 and 2 mT at 0.25 mT of interval for 1 h and cultured for further 1.5 h under CTR conditions. The CTR samples, incubated into the same incubator but maintained far from the solenoid (35 cm, with the sample upper the solenoid) where the magnetic field, evaluated with triaxial Wandel & Goltermann EM field analyzer EFA-300, resulted indistinguishable from the ground level.
2.4. Morpho-functional evaluation of in vitro capacitated spermatozoa
The sperm viability before and at the end of the incubation was assessed by live/dead™ kit (Molecular Probes) following the manufacturer indications. To evaluate and quantify the effect of ELF-EMF on the acrosome integrity on live spermatozoa, two staining techniques were associated, Hoechst 33258 and FITC-PSA, as previously described [37]. For each sample at least 200 alive spermatozoa on two different slides were analysed.
The total DNA was extracted from CTR and ELF treated spermatozoa, as described by Kao et al to verify if the EMFs exposure could affect DNA integrity. [39]. Briefly, the CTR and exposed samples were pelleted by a 5000 g centrifugation to obtain 5 × 107 cells pellet. The pellets were resuspended in lysis buffer (Tris-HCl 50 mM, 2%SDS, 10 mM dithiothreitol, 100 μg/ml Proteinase K, pH 8.3) at 56 °C for 2 h. At the end of the lysis the Proteinase K was inhibited by an incubation for 5 min at 100 °C. After 5.000 g centrifugation the supernatant extraction with phenol-chloroform (1:1 v/v) was carried out. The obtained samples were precipitated in isopropanol 1:1 v/v and Na-acetate 1:10 3 M, pH5.6. After an incubation at −20 °C the DNA was washed with ethanol 75% and dried in air. To perform the electrophoresis the samples were rinsed in H2Odd and 0.8% agarose gel was used.
Finally, the competence of in vitro cultured spermatozoa to reach the functional endpoint of the capacitation was assessed evaluating the acrosomal exocytosis after the administration of solubilized zonae pellucide (sZP), the physiological agonist of AR (37). To this aim, aliquots of CTR and ELF-treated spermatozoa were coincubated for 30 min with sZP (10ZP/μl), obtained as previously described [40]. At the end of the co-incubation, the incidence of ZP-induced AR of alive spermatozoa was quantified by using the two staining techniques (FITC-PSA and Hoechst) as above described. In detail, the total AR recorded at the end of the co-incubation was subtracted of the spontaneous AR recorded before to obtain the incidence of the true sZP-induced AR.
2.5. IVF assay
To study the effect of ELF-EMF field exposure on spermatozoa fertilizing ability a set of IVF was carried out, adopting the field parameters determined in the previous experiments (maximum, minimum and DT50). The oocytes collection and maturation was carried out as described [37] and the IVF was performed according to a previously validated protocol [40], [41] and [42] by using control and exposed to 0.5, 0.75 and 1 mT in vitro capacitated spermatozoa. To obtain the fertilization of at least part of the oocytes in each experimental group and in the expectation of an adverse effect of MF on the fertilizing ability of spermatozoa, a high concentration of cells (0.5 × 107 motile spermatozoa/ml) was used. After 1 h of incubation in the presence of spermatozoa, the oocytes were gently removed from the Petri dish, transferred in fresh medium and maintained in culture for at least 8 h. We carried out three independent determination using in each experimental groups 35-40 oocytes. To quantify the effect of MF on spermatozoa fertilizing ability at the end of incubation the fertilization rate (% of penetrated oocytes), the incidence of polyspermy (% of polyspermic oocytes) and the mean number of penetrating spermatozoa/polyspermic oocyte were recorded according to Abeydeera [43] and [44]. To this aim, oocytes were mounted on a slide, were fixed in ethanol and acetic acid (3/1 v/v) and were assessed under a Nikon Eclipse E600 microscope (40X) after Lacmoid staining.
2.6. In vivo experimental protocols
Two different experimental protocols were carried out (see explicative scheme Fig. 2) to study the effect of the ELF- EMF exposure of spermatozoa stored in the oviducts on the process of fertilization and early embryo development. The surgical approach was due to the need to avoid possible systemic neuro-endocrine effect occurring in the whole animal exposure. In the first one, named protocol A (PA), uterine tubes were exposed to the different ELF-EMF in the presence of spermatozoa 0-4 h before ovulation. Under this experimental protocol, the ELF-EMF exposure effects were reproduced both on spermatozoa and on the female genital tract. In the second protocol, named protocol B (PB), the oviducts were exposed to the different ELF-EMF fields in the absence of spermatozoa 0-4 h before ovulation. In this experimental approach, the in vitro capacitated spermatozoa were inserted at the end of field exposure. Under this experimental protocol, it was evaluated exclusively the influence of ELF-EMF on the female genital tract. More in detail, in prepubertal gilts of 91.1 ± 3.1 Kg the oestrus cycle was promoted by using a validated hormonal treatment [45] and [46]: follicular growth was stimulated by injecting IM 1250 UI eCG (Folligon, Intervet, MI) and approximately 64 h later, the ovulation was induced with 750 UI hCG (Corulon, Intervet, MI), in 40-44 h.
การแปล กรุณารอสักครู่..
กระแสไฟฟ้าที่ไหลในอุปกรณ์การสัมผัสถูกตรวจสอบโดย AC เมตรปัจจุบันเชื่อมต่อในชุดและรูปแบบของคลื่นและความถี่ในการได้รับการตรวจสอบโดยขอบเขตการเชื่อมต่อในขนานกับตัวต้านทานในซีรีส์ที่มีขดลวด แรงดันไฟฟ้าและความมั่นคงความถี่เป็นของผู้จัดจำหน่ายสายไฟ (สูงสุด 10% สำหรับแรงดันไฟฟ้าและ 2% สำหรับความถี่) ความรู้เกี่ยวกับความสม่ำเสมอของพื้นที่ของสนามแม่เหล็กที่อยู่ภายในอุปกรณ์ที่มีความสำคัญเป็นหลักสำหรับการทำสำเนาของเงื่อนไขการทดลองในการทดลองที่แตกต่างกัน [37] (รูปที่ 1). ในการทดลองเบื้องต้น (การทดลองภาคสนามซ้อม) เราได้รับการยกเว้นอิทธิพลใด ๆ ของอุปกรณ์การทดลองกับพารามิเตอร์ด้านสิ่งแวดล้อมเช่นอุณหภูมิหรือความตึงเครียดก๊าซ สำหรับการแสดงออกในการทดลองกับสนามแม่เหล็กตัวอย่างที่ถูกวางอยู่ในพื้นที่ภาคกลาง (มีการเปลี่ยนแปลงสูงสุด B จากค่าศูนย์เป็น 2.2%) ของเครื่องบินเรียงรายเวียนแทรกเข้าไปในขดลวดแม่เหล็กไฟฟ้าประจำการภายในศูนย์บ่มเพาะความชื้น (Heraeus เฮร่าเซลล์) ที่ 38.5 ° C, CO2 5% ในการแสดงออกร่างกายที่ได้รับการใส่ท่อนำไข่หนึ่งในขดลวดและการบำรุงรักษาทางตรงกันข้ามด้านข้างเป็นตัวควบคุม. ความถี่และส่วนประกอบฮาร์โมนิของกระแสไฟฟ้าที่ไหลในอุปกรณ์การแสดงออกที่ถูกตรวจสอบผ่านแรงดันไฟฟ้าในตัวต้านทานโอห์ม 1 ในซีรีส์ที่มีขดลวดโดยขอบเขต - วิเคราะห์ FFT (Tektronics TDS 1002) ในคลื่นความถี่ส่วนประกอบ Hz 50 ถูกพบโดยไม่ต้องเสียงดนตรีที่สำคัญอื่น ๆ . 2.3 ใน capacitation อสุจิในหลอดทดลองตัวอย่างน้ำเชื้อที่ถูกเก็บรวบรวมทุกสามวันโดยเทคนิคที่สวมถุงมือมือ 2 จากหมูป่าความอุดมสมบูรณ์ของการพิสูจน์ น้ำเชื้อถูกลบออกโดยการหมุนเหวี่ยงผ่านสองขั้นตอนที่ 35% และ 70% isotonic Percoll ลาดต่อเนื่อง [37] และ [38] เพื่อเลือกเซลล์เคลื่อนที่ หลังจากการกำจัดของชั้นใส, เม็ดหลวมผลลัพธ์ถูก resuspended ใน Percoll ที่เหลือ 70% และล้างโดยการหมุนเหวี่ยงที่ 800 กรัมเป็นเวลา 10 นาทีใน Dulbecco ของกลางพีบีเอสกับ Ca2 +, Mg2 + และ 0.4% BSA เม็ดถูกเจือจางแล้วในสื่อ capacitation (TCM 199 เสริมด้วย 10% FCS, แคลเซียมแลคเต 2.25 มิลลิไพรูโซเดียม 1.25 mm และกลูโคส 13.9 มิลลิ) เพื่อประเมินความมีชีวิตของเซลล์และเพื่อตรวจสอบความเข้มข้นของตัวอย่าง อสุจิถูกบ่มเพื่อความเข้มข้นสุดท้ายของ 2 × 108 อสุจิ / ml ที่ 38.5 ° C ที่มี CO2 5% ในศูนย์บ่มเพาะบรรยากาศความชื้น (Heraeus เฮร่าเซลล์) สำหรับ 4 ชั่วโมง ก่อนที่จะเริ่มการบ่มตัวอสุจิที่ถูกแบ่งออกเป็นกลุ่มควบคุม (CTR) และเอลฟ์-EMF สัมผัส ในรายละเอียดตัวอสุจิ ELF-EMF รับการรักษาถูกบ่มแรก 1.5 ชั่วโมงโดยไม่ต้องแสดงออกสัมผัสแล้วกับสนามซายน์ที่มีความถี่ 50 Hz และความรุนแรงระหว่าง 0 และ 2 mT ที่ 0.25 mT ของช่วงเวลา 1 ชั่วโมงและเพาะเลี้ยงเป็นเวลาอีก 1.5 ชั่วโมง ภายใต้เงื่อนไข CTR ตัวอย่าง CTR, บ่มเป็นศูนย์บ่มเพาะเดียวกัน แต่ยังคงห่างไกลจากขดลวดแม่เหล็กไฟฟ้า (35 ซม. มีตัวอย่างด้านบนขดลวดแม่เหล็กไฟฟ้า) ที่สนามแม่เหล็กประเมินด้วยสามแกน Wandel & Goltermann EM วิเคราะห์ข้อมูล EFA-300 ผลแตกต่างจากระดับพื้นดิน . 2.4 Morpho ทำงานการประเมินผลในหลอดทดลองพัฒนาศักยภาพตัวอสุจิมีชีวิตสเปิร์มก่อนและในตอนท้ายของการบ่มได้รับการประเมินโดยสด / ตายชุด™ (วัดระดับโมเลกุล) ดังต่อไปนี้บ่งชี้ผู้ผลิต เพื่อประเมินและปริมาณผลกระทบของเอลฟ์-EMF ที่สมบูรณ์ acrosome ในตัวอสุจิสดสองเทคนิคการย้อมสีที่เกี่ยวข้อง, Hoechst 33258 และ FITC-PSA ตามที่กล่าวไว้ก่อนหน้านี้ [37] สำหรับแต่ละตัวอย่างอย่างน้อย 200 ตัวอสุจิมีชีวิตอยู่ในสองสไลด์ที่แตกต่างกันถูกนำมาวิเคราะห์. ดีเอ็นเอทั้งหมดถูกสกัดจาก CTR และเอลฟ์ได้รับการรักษาตัวอสุจิตามที่อธิบายเขาและคณะเพื่อตรวจสอบว่าการเปิดรับ EMFs อาจมีผลต่อความสมบูรณ์ของดีเอ็นเอ [39] สั้น ๆ , CTR และตัวอย่างสัมผัสถูกเม็ดโดยการหมุนเหวี่ยง 5000 กรัมจะได้รับ 5 × 107 เซลล์เม็ด เม็ดที่ถูก resuspended ในบัฟเฟอร์สลาย (Tris-HCl 50 มิลลิเมตร, 2% SDS, 10 มิลลิ dithiothreitol 100 ไมโครกรัม / มล Proteinase K, ค่า pH 8.3) ที่ 56 ° C เป็นเวลา 2 ชั่วโมง ในตอนท้ายของการสลาย Proteinase K ถูกยับยั้งโดยบ่มเป็นเวลา 5 นาทีที่ 100 ° C หลังจากที่ 5.000 กรัมปั่นแยกสกัดด้วยสารละลายฟีนอลคลอโรฟอร์ม (1: 1 v / v) ได้รับการดำเนินการ ตัวอย่างที่ได้มาตกตะกอนใน isopropanol 1: 1 v / v และนาอะซิเตท 01:10 3 M, pH5.6 หลังจากบ่มที่อุณหภูมิ -20 ° C ดีเอ็นเอถูกล้างด้วยเอทานอล 75% และแห้งในอากาศ เพื่อดำเนินการ electrophoresis ตัวอย่างล้างใน H2Odd และ 0.8% agarose เจลถูกนำมาใช้. ในที่สุดความสามารถของตัวอสุจิในหลอดทดลองเพาะเลี้ยงที่จะไปถึงจุดสิ้นสุดการทำงานของ capacitation ได้รับการประเมินการประเมิน exocytosis acrosomal หลังการบริหารของ pellucide zonae ละลาย (SZP ) ตัวเอกทางสรีรวิทยาของ AR (37) เพื่อจุดประสงค์นี้ส่วนลงตัวของ CTR และตัวอสุจิเอลฟ์ได้รับการรักษาที่ถูก coincubated เวลา 30 นาทีกับ Szp (10ZP / ไมโครลิตร) ได้ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [40] ในตอนท้ายของร่วมบ่มอุบัติการณ์ของ AR ZP เหนี่ยวนำให้เกิดการมีชีวิตอยู่ตัวอสุจิที่ถูกวัดโดยใช้เทคนิคการย้อมสีสอง (FITC-PSA และเฮิ) ตามที่อธิบายไว้ข้างต้น ในรายละเอียดทั้งหมด AR บันทึกไว้ในตอนท้ายของการร่วมบ่มมาหักออกของ AR ธรรมชาติบันทึกไว้ก่อนที่จะได้รับอุบัติการณ์ของจริง Szp เหนี่ยวนำให้เกิด AR. 2.5 ทดสอบผสมเทียมเพื่อศึกษาผลกระทบของการเปิดรับข้อมูล ELF-EMF กับความสามารถในการใส่ปุ๋ยอสุจิชุดผสมเทียมได้ดำเนินการนำข้อมูลพารามิเตอร์ที่กำหนดไว้ในการทดลองก่อนหน้า (สูงสุดต่ำสุดและ DT50) คอลเลกชันเซลล์ไข่และการสุกได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ [37] และผสมเทียมได้ดำเนินการตามที่ผ่านการตรวจสอบก่อนหน้านี้โพรโทคอ [40], [41] และ [42] โดยใช้การควบคุมและการสัมผัสกับ 0.5, 0.75 และ 1 mT ในหลอดทดลอง capacitated ตัวอสุจิ ที่จะได้รับการปฏิสนธิอย่างน้อยส่วนหนึ่งของการพัฒนาของไข่ในแต่ละกลุ่มทดลองและในความคาดหวังของผลกระทบของ MF กับความสามารถในการใส่ปุ๋ยตัวอสุจิที่มีความเข้มข้นสูงของเซลล์ (0.5 × 107 อสุจิเคลื่อนที่ / ml) ถูกนำมาใช้ หลังจาก 1 ชั่วโมงของการบ่มในการปรากฏตัวของตัวอสุจิ, การพัฒนาของไข่ที่ถูกถอดออกเบา ๆ จากจานเลี้ยงเชื้อ, โอนในกลางสดและเก็บรักษาไว้ในวัฒนธรรมเป็นเวลาอย่างน้อย 8 ชั่วโมง เราดำเนินการสามมุ่งมั่นอิสระโดยใช้ในกลุ่มทดลองแต่ละ 35-40 เซลล์ไข่ ปริมาณผลกระทบจาก MF กับความสามารถในการใส่ปุ๋ยอสุจิในตอนท้ายของการบ่มอัตราการปฏิสนธิ (% ของเซลล์ไข่ทะลุ), อุบัติการณ์ของ polyspermy (% ของเซลล์ไข่ polyspermic) และจำนวนค่าเฉลี่ยในการเจาะตัวอสุจิ / polyspermic เซลล์ที่ถูกบันทึกไว้ตาม Abeydeera [43] และ [44] เพื่อจุดประสงค์นี้การพัฒนาของไข่ที่ถูกติดตั้งอยู่บนสไลด์ได้รับการแก้ไขในเอทานอลและกรดอะซิติก (3/1 v / v) และได้รับการประเมินภายใต้กล้องจุลทรรศน์ Nikon คราส E600 (40X) หลังจากการย้อมสี Lacmoid. 2.6 ในร่างกายโปรโตคอลการทดลองสองโปรโตคอลการทดลองที่แตกต่างกันออกไป (ดู explicative โครงการรูปที่. 2) เพื่อศึกษาผลกระทบของการเปิดรับ ELF- EMF ตัวอสุจิที่เก็บไว้ในท่อนำไข่ที่อยู่ในกระบวนการของการปฏิสนธิและการพัฒนาของตัวอ่อนในช่วงต้น วิธีการผ่าตัดเป็นผลมาจากความต้องการที่จะหลีกเลี่ยงผลกระทบที่เป็นไปได้ของระบบประสาทต่อมไร้ท่อที่เกิดขึ้นในการสัมผัสสัตว์ทั้ง ในครั้งแรกหนึ่งชื่อโปรโตคอล (PA), หลอดมดลูกได้สัมผัสกับ ELF-EMF แตกต่างกันในการแสดงตนของตัวอสุจิ 0-4 ชั่วโมงก่อนการตกไข่ ภายใต้โปรโตคอลการทดลองนี้ผลจากการระเบิด ELF-EMF ถูกทำซ้ำทั้งบนตัวอสุจิและระบบสืบพันธุ์เพศหญิง ในโปรโตคอลที่สองชื่อโปรโตคอล B (PB), ท่อนำไข่ได้สัมผัสกับสาขา ELF-EMF ที่แตกต่างกันในกรณีที่ไม่มีตัวอสุจิ 0-4 ชั่วโมงก่อนการตกไข่ ในวิธีการทดลองนี้ในหลอดทดลองอสุจิ capacitated ถูกแทรกในตอนท้ายของการเปิดรับข้อมูล ภายใต้โปรโตคอลการทดลองนี้จะถูกประเมินเฉพาะอิทธิพลของเอลฟ์-EMF ในระบบสืบพันธุ์เพศหญิง เพิ่มเติมในรายละเอียดในสุกร prepubertal ของ 91.1 ± 3.1 กิโลกรัมรอบเป็นสัดได้รับการเลื่อนโดยใช้การตรวจสอบการรักษาฮอร์โมน [45] และ [46]: การเจริญเติบโตของฟอลลิถูกกระตุ้นโดยการฉีด IM 1250 UI คลื่นไฟฟ้าหัวใจ (Folligon, Intervet, MI) และประมาณ 64 ชั่วโมงภายหลังการตกไข่ถูกชักนำด้วย 750 UI เอชซีจี (Corulon, Intervet, MI) ใน 40-44 ชั่วโมง
การแปล กรุณารอสักครู่..
กระแสไหลในการตรวจสอบอุปกรณ์เป็นกระแส AC เมตรเชื่อมต่อในชุดและรูปคลื่นและความถี่ที่ได้ตรวจสอบโดยขอบเขตการเชื่อมต่อในแบบขนานกับอนุกรมกับตัวต้านทานขดลวด แรงดันและเสถียรภาพของความถี่ เป็นพวกสายพลังกระจาย ( 10% สูงสุดสำหรับแรงดันไฟฟ้า และ 2% สำหรับความถี่ )ความรู้ของพื้นที่ความสม่ำเสมอของสนามแม่เหล็กภายในอุปกรณ์ที่สำคัญหลักสำหรับกระชับสภาวะในการทดลองที่แตกต่างกัน [ 37 ] ( รูปที่ 1 ) ในการทดลองเบื้องต้น ( การทดลองแชมสนาม ) เราไม่รวมอิทธิพลใด ๆของอุปกรณ์ทดลองกับตัวแปรด้านสิ่งแวดล้อม เช่น อุณหภูมิ หรือแก๊สแรงสำหรับประสิทธิภาพในมหกรรมสนามแม่เหล็กจำนวนวางในพื้นที่ภาคกลาง ( สูงสุด B ความแตกต่างจากค่าศูนย์ 2.2 % ) ของเครื่องบินมีแผ่นกระจกทนความร้อนใส่เข้าไปในขดลวดแม่เหล็กไฟฟ้าอยู่ภายในตู้อบ ( Heraeus humidified Hera , เซลล์ ) ที่ 38.5 องศา C คาร์บอนไดออกไซด์ 5%ในงานมหกรรมอาหารที่ได้รับการใส่ขดลวดที่ท่อนำไข่ ในการต้านการควบคุม
ความถี่และส่วนประกอบฮาร์มอนิก กระแสที่ไหลในงานแสดงอุปกรณ์ตรวจวัดแรงดันในตัวต้านทาน 1 โอห์ม โดยในชุดขดลวดโดยขอบเขต–หน่วยวิเคราะห์ ( tektronics TDS 1002 )ในสเปกตรัมความถี่ 50 Hz พบว่าไม่มีส่วนประกอบฮาร์มอนิก ที่สำคัญอื่น ๆ .
2.3 ในหลอดน้ำเชื้ออสุจิมีเลศนัย
โดยเก็บตัวอย่างทุกๆ 3 วัน โดยมือ gloved เทคนิคจาก 2 ตัวรับการพิสูจน์แล้วของความอุดมสมบูรณ์ พลาสมาอสุจิถูกลบออกโดยปั่นผ่านสองขั้นตอน 35 % และ 70% isotonic percoll ความลาด [ 37 ] และ [ 38 ] เพื่อเลือกมือถือเซลล์หลังจากการกำจัดชั้นนำ , เม็ดหลวมซึ่งเป็น resuspended ในส่วนที่เหลือ 70% percoll และล้างโดยการเหวี่ยงแยกที่ 800 กรัมต่อ 10 นาทีในดัลเบโค่ปานกลาง PBS กับแคลเซียม mg2 และ 0.4% , เสี่ยง เม็ดก็เจือจางในมีเลศนัยขนาดกลาง ( TCM 199 เสริม 10% FCS , แคลเซียมแลคเตท 2.25 มิลลิเมตรโซเดียมไพรูเวท 1.25 มม. และกลูโคส 139 มม. ) เพื่อประเมินและศึกษาตัวอย่างเซลล์ความเข้มข้น ซึ่งเป็นเชื้ออสุจิเพื่อความเข้มข้นสุดท้าย 2 × 108 5 / ml ที่ 38.5 องศา C คาร์บอนไดออกไซด์ 5% ในการ humidified บรรยากาศตู้ฟักไข่ ( Heraeus Hera , เซลล์ ) 4 ชั่วโมง ก่อนที่จะเริ่มบ่มเพาะที่ถูกแบ่งออกเป็นกลุ่มควบคุม ( 5 ศูนย์ ) และ elf-emf เปิดเผย ในรายละเอียดเอลฟ์ EMF ปฏิบัติ 2 . เชื้ออสุจิ 1.5 H ไม่มีงานแสดงแล้วสัมผัสกับสนามต่างกับ 50 Hz ความถี่และความรุนแรงในช่วงระหว่าง 0 และ 0.25 ตัน 2 ตันในช่วง 1 ชั่วโมงและสูตรเพิ่มเติม 1.5 ชั่วโมงภายใต้เงื่อนไข� ที่ศูนย์ตัวอย่าง บ่มในตู้เดียวกันแต่ยังคงห่างไกลจากจานจ่าย ( 35 เซนติเมตรกับตัวอย่างด้านบนจานจ่าย ) ซึ่งสนามแม่เหล็ก , ประเมินร่วมกับสามวันเดล& goltermann วิเคราะห์ efa-300 สนามแม่เหล็ก ทำให้แยกจากระดับพื้นดิน
2.4 . การประเมินผลในหลอดทดลอง capacitated morpho หน้าที่ 5
อสุจิก่อน และในตอนท้ายของการบ่มเพาะและโดยชีวิต / ตาย™ Kit ( โมเลกุลโพรบ ) ต่อไปนี้ผู้ผลิตข้อบ่งชี้ เพื่อประเมินและวัดผลของ elf-emf บนค่าเฉลี่ยอะโครโซมที่สมบูรณ์สด 5 , สองวิธีการทดสอบมีความเกี่ยวข้อง และ Hoechst 33258 fitc-psa ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [ 37 ]สำหรับแต่ละตัวอย่างอย่างน้อย 200 ชีวิต ผนังสองภาพนิ่งต่าง ๆวิเคราะห์
ดีเอ็นเอทั้งหมดสกัดจากศูนย์และพรายรักษา 5 , ตามที่อธิบายไว้โดยเขาและคณะเพื่อตรวจสอบว่า หัวข้อการเปิดรับอาจมีผลต่อความสมบูรณ์ของดีเอ็นเอ . [ 39 ] สั้น ๆ , Ctrl และเปิดเผยจำนวนเม็ด โดย 5 , 000 กรัม ปั่นให้ได้ 5 × 107 เซลล์เม็ดเม็ดเป็น resuspended ในการสลายบัฟเฟอร์ ( บริษัท HCL 50 mm 2 % SDS , บัตรแข็ง , 10 มม. 100 μ g / ml โปร K , pH 8.3 ) ที่ 56 ° C เป็นเวลา 2 ชั่วโมง ในตอนท้ายของการสลายโปรตีนที่ถูกยับยั้งโดย K บ่มเป็นเวลา 5 นาทีที่ 100 องศา หลังจากปั่น 5 กรัม การสกัดฟีนอลสูงด้วยคลอโรฟอร์ม ( 1 : 1 v / v ) มีการ นำจำนวนที่ตกตะกอนในไอโซโพรพานอล 11 V / V และนาเทต 1 : 10 3 M , ph5.6 . หลังจากการบ่มที่ 20 ° C −ดีเอ็นเอล้างด้วยเอทานอล 75% และแห้งในอากาศ แสดงจำนวนใน h2odd วิธีล้าง และ 0.8% เจลใช้
ในที่สุดความสามารถของอสุจิในหลอดทดลองเลี้ยงเพื่อเข้าถึงข้อมูลการทำงานของมีเลศนัยที่ได้รับการประเมิน nucleotide acrosomal หลังจากการบริหารงานสร้าง zonae pellucide ( szp ) , มิตต์ รอมนีย์ทางสรีรวิทยาของ AR ( 37 ) เพื่อจุดมุ่งหมายนี้เฉยๆ ของศูนย์และพรายรักษาอสุจิที่ถูก coincubated เป็นเวลา 30 นาที szp ( 10zp / μ L ) ได้อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [ 40 ]ในตอนท้ายของการจำกัดระยะเวลาการเกิดของไข่และอสุจิมีปริมาณอาร์ของชีวิตโดยการใช้สองวิธีการทดสอบ ( และ fitc-psa Hoechst ) ดังที่อธิบายไว้ รายละเอียด รวมเป็นบันทึกที่ส่วนท้ายของ Co บ่มถูกหักออกจากธรรมชาติ AR ที่บันทึกไว้ก่อน ที่จะได้รับ อุบัติการณ์ของการ szp จริง AR
2.5 IVF )
เพื่อศึกษาผลของการใส่ปุ๋ยในเขต elf-emf อสุจิในชุดของโรงพยาบาลมีการใช้ฟิลด์พารามิเตอร์ที่ระบุในการทดลองก่อนหน้านี้ ( สูงสุด , ต่ำสุดและ dt50 ) ร่วมกับคอลเลกชันและการกระทำตามที่อธิบายไว้ [ 37 ] และ IVF ได้ปฏิบัติตามขั้นตอนก่อนหน้านี้ ) [ 40 ][ 41 ] และ [ 42 ] โดยใช้การควบคุมและตาก 0.5 , 0.75 และ 1 ตันในหลอดทดลอง capacitated อสุจิ . รับผสมพันธุ์อย่างน้อยส่วนหนึ่งของไข่ในแต่ละกลุ่มทดลองและในการคาดการณ์ของทวนผลของ MF ในการปฏิสนธิของอสุจิ ความสามารถ , ความเข้มข้นสูงของเซลล์ ( 0.5 × 107 อสุจิเคลื่อนที่ / ml ) ใช้หลังจาก 1 ชั่วโมงของการบ่มในการแสดงตนของอสุจิ , oocyte ค่อยๆเอาออกจากจานเพาะเชื้อโอนปานกลาง สด และรักษาวัฒนธรรม อย่างน้อย 8 ชั่วโมง เราดำเนินการสามอิสระกำหนดใช้ในแต่ละกลุ่ม 35-40 ไข่ .เพื่อหาผลของการใส่ปุ๋ยใน MF บนผนังที่จุดสิ้นสุดของระยะเวลาการปฏิสนธิ ( % ของอัตราการเจาะไข่ ) , อุบัติการณ์ของ polyspermy ( % ของ polyspermic oocytes ) และค่าเฉลี่ยจำนวนเจาะ 5 / polyspermic นำบันทึกตาม abeydeera [ 43 ] และ [ 44 ] เพื่อจุดมุ่งหมายนี้ไข่ติดบนสไลด์ได้รับการแก้ไขในเอทานอลและกรดน้ำส้ม ( 3 / 1 v / v ) และมีการประเมินภายใต้กล้องจุลทรรศน์ Nikon คราส e600 ( 40 x ) หลังจาก lacmoid staining
2.6 ในสัตว์ทดลองที่แตกต่างกันสองโปรโตคอลโปรโตคอล
ทดลองทดลอง ( ดูการอธิบายอย่างละเอียดแบบภาพประกอบ2 ) เพื่อศึกษาผลของเอลฟ์ - เปิดรับ EMF ของอสุจิที่ถูกเก็บไว้ในท่อรังไข่ในกระบวนการของการปฏิสนธิ และการพัฒนาของตัวอ่อน ก่อน วิธีการผ่าตัดได้เนื่องจากต้องการเลี่ยงระบบประสาทต่อมไร้ท่อผลที่เกิดขึ้นในการสัมผัสสัตว์ทั้งหมด ในตอนแรก ชื่อโพรโทคอล ( PA )หลอดมดลูก ได้สัมผัสกับ elf-emf ที่แตกต่างกันในการแสดงตนของอสุจิที่ 0-4 H ก่อนตกไข่ ในขั้นตอนการทดลอง นี้ elf-emf เปิดรับผลกาทั้งในท่อและในอวัยวะสืบพันธุ์หญิง ในขั้นตอนที่สอง ชื่อโปรโตคอล B ( PB ) , แบ่งเขต elf-emf เปิดรับแตกต่างกันในกรณีที่ไม่มีอสุจิ 0-4 H ก่อนตกไข่ในวิธีการในการทดลองในหลอดทดลอง capacitated อสุจิที่ถูกแทรกไว้ในตอนท้ายของการเปิดรับสาขา ในขั้นตอนการทดลอง นี้จะถูกประเมินโดยเฉพาะอิทธิพลของ elf-emf ในอวัยวะสืบพันธุ์หญิง เพิ่มเติมในรายละเอียดในชายไทยสุขภาพดีโดยของ± 3.1 กก. ที่ติดรอบการตรวจสอบการรักษาโดยใช้ฮอร์โมน [ 45 ] และ [ 46 ] :การเจริญเติบโตฮอร์โมนถูกกระตุ้นโดยฉีด IM 1250 UI ECG ( folligon intervet , มิ ) และประมาณ 64 ชั่วโมงภายหลังการตกไข่การ 750 UI HCG ( corulon intervet , มิ ) ใน 40-44
h
ความถี่และส่วนประกอบฮาร์มอนิก กระแสที่ไหลในงานแสดงอุปกรณ์ตรวจวัดแรงดันในตัวต้านทาน 1 โอห์ม โดยในชุดขดลวดโดยขอบเขต–หน่วยวิเคราะห์ ( tektronics TDS 1002 )ในสเปกตรัมความถี่ 50 Hz พบว่าไม่มีส่วนประกอบฮาร์มอนิก ที่สำคัญอื่น ๆ .
2.3 ในหลอดน้ำเชื้ออสุจิมีเลศนัย
โดยเก็บตัวอย่างทุกๆ 3 วัน โดยมือ gloved เทคนิคจาก 2 ตัวรับการพิสูจน์แล้วของความอุดมสมบูรณ์ พลาสมาอสุจิถูกลบออกโดยปั่นผ่านสองขั้นตอน 35 % และ 70% isotonic percoll ความลาด [ 37 ] และ [ 38 ] เพื่อเลือกมือถือเซลล์หลังจากการกำจัดชั้นนำ , เม็ดหลวมซึ่งเป็น resuspended ในส่วนที่เหลือ 70% percoll และล้างโดยการเหวี่ยงแยกที่ 800 กรัมต่อ 10 นาทีในดัลเบโค่ปานกลาง PBS กับแคลเซียม mg2 และ 0.4% , เสี่ยง เม็ดก็เจือจางในมีเลศนัยขนาดกลาง ( TCM 199 เสริม 10% FCS , แคลเซียมแลคเตท 2.25 มิลลิเมตรโซเดียมไพรูเวท 1.25 มม. และกลูโคส 139 มม. ) เพื่อประเมินและศึกษาตัวอย่างเซลล์ความเข้มข้น ซึ่งเป็นเชื้ออสุจิเพื่อความเข้มข้นสุดท้าย 2 × 108 5 / ml ที่ 38.5 องศา C คาร์บอนไดออกไซด์ 5% ในการ humidified บรรยากาศตู้ฟักไข่ ( Heraeus Hera , เซลล์ ) 4 ชั่วโมง ก่อนที่จะเริ่มบ่มเพาะที่ถูกแบ่งออกเป็นกลุ่มควบคุม ( 5 ศูนย์ ) และ elf-emf เปิดเผย ในรายละเอียดเอลฟ์ EMF ปฏิบัติ 2 . เชื้ออสุจิ 1.5 H ไม่มีงานแสดงแล้วสัมผัสกับสนามต่างกับ 50 Hz ความถี่และความรุนแรงในช่วงระหว่าง 0 และ 0.25 ตัน 2 ตันในช่วง 1 ชั่วโมงและสูตรเพิ่มเติม 1.5 ชั่วโมงภายใต้เงื่อนไข� ที่ศูนย์ตัวอย่าง บ่มในตู้เดียวกันแต่ยังคงห่างไกลจากจานจ่าย ( 35 เซนติเมตรกับตัวอย่างด้านบนจานจ่าย ) ซึ่งสนามแม่เหล็ก , ประเมินร่วมกับสามวันเดล& goltermann วิเคราะห์ efa-300 สนามแม่เหล็ก ทำให้แยกจากระดับพื้นดิน
2.4 . การประเมินผลในหลอดทดลอง capacitated morpho หน้าที่ 5
อสุจิก่อน และในตอนท้ายของการบ่มเพาะและโดยชีวิต / ตาย™ Kit ( โมเลกุลโพรบ ) ต่อไปนี้ผู้ผลิตข้อบ่งชี้ เพื่อประเมินและวัดผลของ elf-emf บนค่าเฉลี่ยอะโครโซมที่สมบูรณ์สด 5 , สองวิธีการทดสอบมีความเกี่ยวข้อง และ Hoechst 33258 fitc-psa ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [ 37 ]สำหรับแต่ละตัวอย่างอย่างน้อย 200 ชีวิต ผนังสองภาพนิ่งต่าง ๆวิเคราะห์
ดีเอ็นเอทั้งหมดสกัดจากศูนย์และพรายรักษา 5 , ตามที่อธิบายไว้โดยเขาและคณะเพื่อตรวจสอบว่า หัวข้อการเปิดรับอาจมีผลต่อความสมบูรณ์ของดีเอ็นเอ . [ 39 ] สั้น ๆ , Ctrl และเปิดเผยจำนวนเม็ด โดย 5 , 000 กรัม ปั่นให้ได้ 5 × 107 เซลล์เม็ดเม็ดเป็น resuspended ในการสลายบัฟเฟอร์ ( บริษัท HCL 50 mm 2 % SDS , บัตรแข็ง , 10 มม. 100 μ g / ml โปร K , pH 8.3 ) ที่ 56 ° C เป็นเวลา 2 ชั่วโมง ในตอนท้ายของการสลายโปรตีนที่ถูกยับยั้งโดย K บ่มเป็นเวลา 5 นาทีที่ 100 องศา หลังจากปั่น 5 กรัม การสกัดฟีนอลสูงด้วยคลอโรฟอร์ม ( 1 : 1 v / v ) มีการ นำจำนวนที่ตกตะกอนในไอโซโพรพานอล 11 V / V และนาเทต 1 : 10 3 M , ph5.6 . หลังจากการบ่มที่ 20 ° C −ดีเอ็นเอล้างด้วยเอทานอล 75% และแห้งในอากาศ แสดงจำนวนใน h2odd วิธีล้าง และ 0.8% เจลใช้
ในที่สุดความสามารถของอสุจิในหลอดทดลองเลี้ยงเพื่อเข้าถึงข้อมูลการทำงานของมีเลศนัยที่ได้รับการประเมิน nucleotide acrosomal หลังจากการบริหารงานสร้าง zonae pellucide ( szp ) , มิตต์ รอมนีย์ทางสรีรวิทยาของ AR ( 37 ) เพื่อจุดมุ่งหมายนี้เฉยๆ ของศูนย์และพรายรักษาอสุจิที่ถูก coincubated เป็นเวลา 30 นาที szp ( 10zp / μ L ) ได้อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [ 40 ]ในตอนท้ายของการจำกัดระยะเวลาการเกิดของไข่และอสุจิมีปริมาณอาร์ของชีวิตโดยการใช้สองวิธีการทดสอบ ( และ fitc-psa Hoechst ) ดังที่อธิบายไว้ รายละเอียด รวมเป็นบันทึกที่ส่วนท้ายของ Co บ่มถูกหักออกจากธรรมชาติ AR ที่บันทึกไว้ก่อน ที่จะได้รับ อุบัติการณ์ของการ szp จริง AR
2.5 IVF )
เพื่อศึกษาผลของการใส่ปุ๋ยในเขต elf-emf อสุจิในชุดของโรงพยาบาลมีการใช้ฟิลด์พารามิเตอร์ที่ระบุในการทดลองก่อนหน้านี้ ( สูงสุด , ต่ำสุดและ dt50 ) ร่วมกับคอลเลกชันและการกระทำตามที่อธิบายไว้ [ 37 ] และ IVF ได้ปฏิบัติตามขั้นตอนก่อนหน้านี้ ) [ 40 ][ 41 ] และ [ 42 ] โดยใช้การควบคุมและตาก 0.5 , 0.75 และ 1 ตันในหลอดทดลอง capacitated อสุจิ . รับผสมพันธุ์อย่างน้อยส่วนหนึ่งของไข่ในแต่ละกลุ่มทดลองและในการคาดการณ์ของทวนผลของ MF ในการปฏิสนธิของอสุจิ ความสามารถ , ความเข้มข้นสูงของเซลล์ ( 0.5 × 107 อสุจิเคลื่อนที่ / ml ) ใช้หลังจาก 1 ชั่วโมงของการบ่มในการแสดงตนของอสุจิ , oocyte ค่อยๆเอาออกจากจานเพาะเชื้อโอนปานกลาง สด และรักษาวัฒนธรรม อย่างน้อย 8 ชั่วโมง เราดำเนินการสามอิสระกำหนดใช้ในแต่ละกลุ่ม 35-40 ไข่ .เพื่อหาผลของการใส่ปุ๋ยใน MF บนผนังที่จุดสิ้นสุดของระยะเวลาการปฏิสนธิ ( % ของอัตราการเจาะไข่ ) , อุบัติการณ์ของ polyspermy ( % ของ polyspermic oocytes ) และค่าเฉลี่ยจำนวนเจาะ 5 / polyspermic นำบันทึกตาม abeydeera [ 43 ] และ [ 44 ] เพื่อจุดมุ่งหมายนี้ไข่ติดบนสไลด์ได้รับการแก้ไขในเอทานอลและกรดน้ำส้ม ( 3 / 1 v / v ) และมีการประเมินภายใต้กล้องจุลทรรศน์ Nikon คราส e600 ( 40 x ) หลังจาก lacmoid staining
2.6 ในสัตว์ทดลองที่แตกต่างกันสองโปรโตคอลโปรโตคอล
ทดลองทดลอง ( ดูการอธิบายอย่างละเอียดแบบภาพประกอบ2 ) เพื่อศึกษาผลของเอลฟ์ - เปิดรับ EMF ของอสุจิที่ถูกเก็บไว้ในท่อรังไข่ในกระบวนการของการปฏิสนธิ และการพัฒนาของตัวอ่อน ก่อน วิธีการผ่าตัดได้เนื่องจากต้องการเลี่ยงระบบประสาทต่อมไร้ท่อผลที่เกิดขึ้นในการสัมผัสสัตว์ทั้งหมด ในตอนแรก ชื่อโพรโทคอล ( PA )หลอดมดลูก ได้สัมผัสกับ elf-emf ที่แตกต่างกันในการแสดงตนของอสุจิที่ 0-4 H ก่อนตกไข่ ในขั้นตอนการทดลอง นี้ elf-emf เปิดรับผลกาทั้งในท่อและในอวัยวะสืบพันธุ์หญิง ในขั้นตอนที่สอง ชื่อโปรโตคอล B ( PB ) , แบ่งเขต elf-emf เปิดรับแตกต่างกันในกรณีที่ไม่มีอสุจิ 0-4 H ก่อนตกไข่ในวิธีการในการทดลองในหลอดทดลอง capacitated อสุจิที่ถูกแทรกไว้ในตอนท้ายของการเปิดรับสาขา ในขั้นตอนการทดลอง นี้จะถูกประเมินโดยเฉพาะอิทธิพลของ elf-emf ในอวัยวะสืบพันธุ์หญิง เพิ่มเติมในรายละเอียดในชายไทยสุขภาพดีโดยของ± 3.1 กก. ที่ติดรอบการตรวจสอบการรักษาโดยใช้ฮอร์โมน [ 45 ] และ [ 46 ] :การเจริญเติบโตฮอร์โมนถูกกระตุ้นโดยฉีด IM 1250 UI ECG ( folligon intervet , มิ ) และประมาณ 64 ชั่วโมงภายหลังการตกไข่การ 750 UI HCG ( corulon intervet , มิ ) ใน 40-44
h
การแปล กรุณารอสักครู่..
ภาษาอื่น ๆ
การสนับสนุนเครื่องมือแปลภาษา: กรีก, กันนาดา, กาลิเชียน, คลิงออน, คอร์สิกา, คาซัค, คาตาลัน, คินยารวันดา, คีร์กิซ, คุชราต, จอร์เจีย, จีน, จีนดั้งเดิม, ชวา, ชิเชวา, ซามัว, ซีบัวโน, ซุนดา, ซูลู, ญี่ปุ่น, ดัตช์, ตรวจหาภาษา, ตุรกี, ทมิฬ, ทาจิก, ทาทาร์, นอร์เวย์, บอสเนีย, บัลแกเรีย, บาสก์, ปัญจาป, ฝรั่งเศส, พาชตู, ฟริเชียน, ฟินแลนด์, ฟิลิปปินส์, ภาษาอินโดนีเซี, มองโกเลีย, มัลทีส, มาซีโดเนีย, มาราฐี, มาลากาซี, มาลายาลัม, มาเลย์, ม้ง, ยิดดิช, ยูเครน, รัสเซีย, ละติน, ลักเซมเบิร์ก, ลัตเวีย, ลาว, ลิทัวเนีย, สวาฮิลี, สวีเดน, สิงหล, สินธี, สเปน, สโลวัก, สโลวีเนีย, อังกฤษ, อัมฮาริก, อาร์เซอร์ไบจัน, อาร์เมเนีย, อาหรับ, อิกโบ, อิตาลี, อุยกูร์, อุสเบกิสถาน, อูรดู, ฮังการี, ฮัวซา, ฮาวาย, ฮินดี, ฮีบรู, เกลิกสกอต, เกาหลี, เขมร, เคิร์ด, เช็ก, เซอร์เบียน, เซโซโท, เดนมาร์ก, เตลูกู, เติร์กเมน, เนปาล, เบงกอล, เบลารุส, เปอร์เซีย, เมารี, เมียนมา (พม่า), เยอรมัน, เวลส์, เวียดนาม, เอสเปอแรนโต, เอสโทเนีย, เฮติครีโอล, แอฟริกา, แอลเบเนีย, โคซา, โครเอเชีย, โชนา, โซมาลี, โปรตุเกส, โปแลนด์, โยรูบา, โรมาเนีย, โอเดีย (โอริยา), ไทย, ไอซ์แลนด์, ไอร์แลนด์, การแปลภาษา.
- Ten Red CrowsA Chinese FolktaleRetold by
- Hammer
- Just a bit ago I heard how Luke thinks a
- จากนั้น เราซื้อของที่
- อดีต
- In the 1950s and 60s, discharges from a
- I wish that
- แล้วเจอกันใหม่หลังจากกลับจาก ๊usa
- tasks
- บางทีฉันก็อย่างขับมอไซค์บิ๊กไบท์
- นวนิยาย
- แหลมกู๊ดโฮป (Cape of Good Hope) แหลมที่ม
- Department of Biosystems, Division of Me
- แต่มีคนตกงานน้อยมาก
- she look nice
- ผลิตภัณฑ์ cherchom 3 กล่องค่ะ
- เสื้อ
- You see I doubt shocked.
- แย่เลย วันนี้ฉันไม่ว่าง
- religion
- มันเป็นสนธิสัญญาระหว่างอเมริกากับรัสเซีย
- ฝ่ายทรัพยากรมนุษย์แจ้งประชาสัมพันธ์การขั
- เราซื้อของที่
- หน้าที่ 32 ของบทความ
