Materials and methodsSeveral serial

Materials and methods

Several serial dilutions of the pre digester slurry were plated on nutrient agar (Peptone 1%, Beef extract 1%, NaCl 0.5%, Agar 2.0%, pH 7.2) to obtain well isolated colonies for further identification. Isolated colonies were subjected to Gram staining to study their Gram character. Spore staining was performed by Schaffer and Fulton’s method. Spores were also observed under phase contrast microscope [Zeiss]. All the isolates were maintained on nutrient agar slants. All the bacterial isolates were found to be Gram-positive sporulating rods and aerobic in nature. They were presumed to belong to the genus Bacillus. These Gram-positive sporulating rods of Bacillus were further characterized to the species level by performing a number of biochemical (e.g., catalase test, Voges-Proskauer test etc.), morphological (rod width measurement, parasporal bodies, etc.) and growth pattern (at different temperature and pH) studies as suggested by Slepecky and Hemphill [16]. All the chemicals and media components were obtained from HiMedia Ltd, Mumbai, India.

Each Bacillus isolate was grown overnight at 42 °C in 4 ml nutrient broth and was harvested and was washed twice in sterile deionised water. It was resuspended in 500 μl of sterile deionised water. The potassium bromide (KBr) pellets of these bacterial samples were prepared for the FT-IR studies. For a typical KBR pellet, 100 μl of the above bacterial re-suspension was added directly to approximately 2 g of potassium bromide (IR grade, Merck) and was mixed thoroughly in a mortar and pestle. This mixture was made into a coin shaped pellet and was used for FTIR spectroscopy in a JASCO 4100 instrument with DTGS detector. Resolution of 4 cm−1 and a cosine apodization function for all the FT-IR measurements were used. The scanning speed was 2 mm/s and a co-adding of 30 was used for data acquisition. The serial dilution experiments were done with the same scanning speed, however a co-adding of 60 was used to get a better signal to noise ratio. For the serial dilution study in FTIR, O.D. of the washed and resuspended cultures were taken at 600 nm and appropriate quantity was added to correspond to the intended cell number.

For UV–Vis NIR spectroscopy, samples were prepared as above and 100 μl of resuspended bacterial culture was spotted on 1 cm2 silicon wafer surface (Si 1–0–0) and were dried under IR lamp. DR–UV–Vis–NIR measurements at 200–2700 nm was conducted on a two-beam spectrometer (V-670-NIR, JASCO) with a specular reflectance attachment. Required subtraction of the spectra of the Si (1–0–0) was done for each bacterial spectrum to remove any contribution from the Si-surface. Two mirrors were used as reference for the same.

For partial 16S rRNA gene amplification and sequencing, universal forward and reverse primers AGAGTTTGATCMTGGCTCAG and TACGGYTAC CTTGTTACGACTT were obtained from MWG, Germany.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

วัสดุและวิธีการDilutions หลายอนุกรมของสารละลาย digester ก่อนถูกชุบใน agar ธาตุอาหาร (Peptone 1% เนื้อแยก 1%, NaCl 0.5%, Agar 2.0%, pH 7.2) รับอาณานิคมแยกด้วยรหัสต่อไปนี้ อาณานิคมแยกถูกต้องย้อมสีเพื่อศึกษาอักขระของกรัมกรัม สปอร์ที่ย้อมสีที่ดำเนินการ โดยวิธี Schaffer และของฟุลตัน เพาะเฟิร์นก็ยังสังเกตภายใต้กล้องจุลทรรศน์เปรียบระยะ [Zeiss] ทั้งหมดแยกได้ถูกรักษาไว้บน slants agar ธาตุอาหาร ทั้งหมดแยกแบคทีเรียที่พบเป็นแบคทีเรียแกรมบวก sporulating ก้าน และแอโรบิกในธรรมชาติ พวกเขาถูก presumed เป็นสมาชิกของตระกูลนี้คัด เพิ่มเติมมีลักษณะระดับชนิดนี้ก้าน sporulating แบคทีเรียแกรมบวกของคัด โดยทำตัวเลขของชีวเคมี (เช่น การทดสอบ catalase, Voges Proskauer ทดสอบฯลฯ), สัณฐาน (วัดความกว้างของร็อด ร่างกาย parasporal ฯลฯ) และศึกษารูปแบบที่แตกต่างกันอุณหภูมิและ pH) เติบโตแนะนำโดย Slepecky และ Hemphill [16] สารเคมีและส่วนประกอบสื่อทั้งหมดได้รับจาก HiMedia Ltd มุมไบ อินเดียคัดแยกแต่ละถูกปลูกค้างคืนที่ 42 ° C ใน 4 ml ธาตุอาหารซุป และถูกเก็บเกี่ยว และถูกล้างในน้ำกอซ deionised ครั้ง มันถูก resuspended ใน μl 500 น้ำกอซ deionised เกล็ดโพแทสเซียมโบรไมด์ (KBr) ตัวอย่างแบคทีเรียเหล่านี้ถูกเตรียมไว้สำหรับศึกษา FT-IR สำหรับ KBR ที่ปกติเม็ด μl 100 ของการข้างต้นแบคทีเรีย re-ระงับเข้ามาตรงไปประมาณ 2 กรัมของโพแทสเซียมโบรไมด์ (IR เกรด เมอร์ค) และถูกผสมอย่างละเอียดในตัวโกร่ง ส่วนผสมนี้ถูกจัดทำเป็นเหรียญรูปเม็ด และถูกใช้สำหรับก FTIR ในเครื่องมือ JASCO 4100 DTGS เครื่องตรวจจับ ใช้ของ 4 cm−1 และฟังก์ชันโคไซน์ apodization สำหรับการประเมิน FT IR ความเร็วการสแกน 2 มม./ใช้สำหรับข้อมูลและความร่วมมือเพิ่ม 30 ทดลองการเจือจางประจำได้ทำ ด้วยความเร็วแกนเดียว แต่การร่วมเพิ่ม 60 ใช้รับสัญญาณต่อเสียงรบกวนดีกว่า สำหรับการศึกษาอนุกรมเจือจางใน FTIR, O.D. ของวัฒนธรรมหิน และ resuspended ที่ถ่ายที่ 600 nm และปริมาณที่เหมาะสม ถูกเพิ่มให้สอดคล้องกับจำนวนเซลล์เป้าหมายสำหรับ NIR UV – Vis ก มีเตรียมตัวอย่างด้านบน และ μl 100 ของแบคทีเรีย resuspended ด่างถูกบน 1 cm2 silicon wafer พื้นผิว (ซี 1-0-0) และถูกอบแห้งภายใต้หลอดไฟ IR วัด DR – UV – Vis-NIR ที่ 200 – 2700 nm วิธีสเปกโตรมิเตอร์ลำแสงสอง (V-670-NIR, JASCO) พร้อมแนบแบบแสงสะท้อนแบบกระจกสะท้อนแสง ต้องลบของแรมสเป็คตราของซี (1 – 0 – 0) ถูกทำสำหรับสเปกตรัมแต่ละแบคทีเรียเพื่อลบส่วนใด ๆ จากผิวศรี กระจกสองถูกใช้เป็นข้อมูลอ้างอิงสำหรับเดียวกันสำหรับการขยายบางส่วน 16S rRNA ยีนและลำดับ สากลไปข้างหน้า และย้อนกลับไพรเมอร์ AGAGTTTGATCMTGGCTCAG และ TACGGYTAC CTTGTTACGACTT ได้รับจาก MWG เยอรมนี

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

วัสดุและวิธีการเจือจางอนุกรมหลายสารละลายหมักก่อนถูกชุบสารอาหารในอาหารเลี้ยงเชื้อ (เปปโตน 1%, สารสกัดจากเนื้อ 1%, โซเดียมคลอไรด์ 0.5%, 2.0% วุ้นค่า pH 7.2) เพื่อให้ได้โคโลนีที่แยกกันสำหรับประชาชนต่อไป อาณานิคมแยกถูกยัดเยียดให้การย้อมสีแกรมที่จะศึกษาตัวละครที่แกรมของพวกเขา การย้อมสีสปอร์ได้ดำเนินการโดยเชฟเฟอร์และวิธีการของฟุลตัน สปอร์พบยังอยู่ภายใต้กล้องจุลทรรศน์เฟสตรงกันข้าม [Zeiss] ไอโซเลททั้งหมดถูกเก็บรักษาไว้ใน slants อาหารเลี้ยงเชื้อ ทั้งหมดแบคทีเรียพบว่ามีแท่ง sporulating แกรมบวกและแอโรบิกในธรรมชาติ พวกเขาได้รับการสันนิษฐานไว้ก่อนว่าจะเป็นสกุลบาซิลลัส เหล่านี้แท่ง sporulating แกรมบวกของ Bacillus มีลักษณะต่อไปยังระดับสายพันธุ์โดยการดำเนินการจำนวนชีวเคมี (เช่นการทดสอบ catalase, Voges-Proskauer ทดสอบ ฯลฯ ), ก้าน (ก้านวัดความกว้างของร่างกาย parasporal ฯลฯ ) และรูปแบบการเติบโต (ที่อุณหภูมิแตกต่างกันและมีค่า pH) การศึกษาตามที่แนะนำโดย Slepecky และ Hemphill [16] สารเคมีทั้งหมดและส่วนประกอบสื่อที่ได้รับจาก HIMEDIA จำกัด มุมไบประเทศอินเดีย. แยก Bacillus แต่ละคนได้เติบโตขึ้นในชั่วข้ามคืนที่ 42 ° C ในน้ำซุป 4 มลสารอาหารและได้รับการเก็บเกี่ยวและถูกล้างครั้งที่สองในน้ำ deionised ผ่านการฆ่าเชื้อ มันถูก resuspended ใน 500 ไมโครลิตรน้ำ deionised ผ่านการฆ่าเชื้อ โพแทสเซียมโบรไมด์ (KBr) เม็ดของตัวอย่างเชื้อแบคทีเรียเหล่านี้ถูกจัดทำขึ้นเพื่อการศึกษา FT-IR สำหรับเม็ด KBR ทั่วไป 100 ไมโครลิตรของเชื้อแบคทีเรียดังกล่าวข้างต้นระงับใหม่ถูกเพิ่มโดยตรงประมาณ 2 กรัมของโพแทสเซียมโบรไมด์ (เกรด IR เมอร์) และได้รับการผสมในโกร่งบดยา ส่วนผสมนี้ก็กลายเป็นเม็ดเหรียญและรูปที่ใช้สำหรับสเปคโทร FTIR ในตราสาร JASCO 4100 กับเครื่องตรวจจับ DTGS มติที่ 4 ซม-1 และโคไซน์ apodization ฟังก์ชั่นสำหรับทุกวัด FT-IR ถูกนำมาใช้ ความเร็วในการสแกนเป็น 2 มิลลิเมตร / วินาทีและร่วมเพิ่ม 30 ถูกนำมาใช้สำหรับการเก็บข้อมูล การทดลองเจือจางอนุกรมได้ทำกับความเร็วในการสแกนเดียวกันอย่างไรก็ตามร่วมเพิ่ม 60 ถูกใช้ในการรับสัญญาณที่ดีขึ้นเสียงอัตราส่วน สำหรับการศึกษาการลดสัดส่วนต่อเนื่องใน FTIR, OD ของวัฒนธรรมล้างและ resuspended ถูกนำมาที่ 600 นาโนเมตรและปริมาณที่เหมาะสมถูกเพิ่มเข้ามาเพื่อให้สอดคล้องกับจำนวนเซลล์ที่ตั้งใจไว้. สำหรับสเปคโทร UV-Vis NIR ตัวอย่างได้เตรียมไว้ข้างต้นและ 100 ไมโครลิตรของ resuspended วัฒนธรรมแบคทีเรียถูกพบเมื่อวันที่ 1 cm2 ผิวซิลิคอนเวเฟอร์ (ศรี 1-0-0) และได้รับการอบแห้งภายใต้โคมไฟ IR วัด DR-UV-Vis-NIR ที่ 200-2700 นาโนเมตรได้ดำเนินการในสเปกโตรมิเตอร์สองคาน (V-670-NIR, JASCO) กับสิ่งที่แนบสะท้อน specular ต้องการลบสเปกตรัมของศรี (1-0-0) ได้ทำในแต่ละคลื่นความถี่แบคทีเรียที่จะเอาผลงานจาก Si-พื้นผิวใด ๆ กระจกสองถูกนำมาใช้เป็นข้อมูลอ้างอิงสำหรับเดียวกัน. สำหรับส่วนขยายของยีน 16S rRNA และลำดับไพรเมอร์สากลไปข้างหน้าและย้อนกลับ AGAGTTTGATCMTGGCTCAG และ TACGGYTAC CTTGTTACGACTT ที่ได้รับจาก MWG เยอรมนี

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

วัสดุและวิธีการหลายแบบ

วิธีการก่อน โดยมีสารละลายชุบบน NUMB3RS ( เปปโตน 1 % สารสกัดจากเนื้อ 1 % NaCl 0.5% วุ้น , 2.0% , pH 7.2 ) เพื่อขอรับแยกดีอาณานิคมเพื่อกำหนดเพิ่มเติม กาเวียนได้ภายใต้การศึกษาของพวกเขากรัมกรัมตัวอักษร สปอร์ย้อม แสดงโดย เชเฟอร์ โกงและวิธีการพบสปอร์ภายใต้กล้องจุลทรรศน์เฟส Zeiss [ ความคมชัด ] ทุกสายพันธุ์ถูกเก็บรักษาไว้บนอาหารเลี้ยงเชื้อสารอาหาร slants . ทุกสายพันธุ์ พบว่ามีแบคทีเรียกรัมบวกและแท่งผลิตสปอร์แบบในธรรมชาติ พวกเขาสันนิษฐานว่าเป็นของจีนัส Bacillus .เหล่านี้ผลิตสปอร์ของเชื้อกรัมบวกแท่งได้ลักษณะในสปีชีส์ระดับแสดงหมายเลขของชีวเคมี ( เช่นสามารถทดสอบ , การทดสอบ Voges proskauer ฯลฯ ) , ลักษณะทางสัณฐานวิทยา ( วัดความกว้างของแท่ง parasporal ร่างกาย , ฯลฯ ) และรูปแบบการเจริญเติบโต ( ที่อุณหภูมิและ pH ) การศึกษา ตามที่แนะนำ โดย slepecky และเฮมฟิล [ 16 ]ทั้งหมดเคมีภัณฑ์และอุปกรณ์สื่อได้จาก himedia Ltd มุมไบ , อินเดีย

แต่ละเชื้อแยกปลูกค้างคืนที่ 42 ° C ใน nutrient broth และ 4 ml คือการเก็บเกี่ยวและล้างสองครั้งใน deionised ปราศจากน้ำ มัน resuspended 500 μลิตรปลอดเชื้อ deionised น้ำ โพแทสเซียมโบรไมด์ ( KBR ) เม็ดตัวอย่างแบคทีเรียเหล่านี้ถูกเตรียมการ - ศึกษาสำหรับเม็ด KBR ทั่วไป 100 μผมข้างบนระงับแบคทีเรียถูกเติมโดยตรงอีกประมาณ 2 กรัมของโพแทสเซียมโบรไมด์ ( IR เกรดเมอร์ค ) และผสมอย่างทั่วถึงในครกและสาก ส่วนผสมนี้ถูกสร้างเป็นเหรียญรูปเม็ดและใช้ FTIR spectroscopy ใน jasco 4100 กับ dtgs เครื่องมือตรวจจับความละเอียด 4 cm − 1 และโคไซน์อะโพไดเซชันฟังก์ชันสำหรับการวัดทั้งหมดอินฟราเรดมาใช้ สแกนความเร็ว 2 mm / s และ Co เพิ่ม 30 ถูกใช้สำหรับการเก็บข้อมูล อนุกรม ( ทดลองทำเหมือนเดิมแต่เพิ่มความเร็วในการสแกน จำกัด 60 ใช้รับสัญญาณที่ดีต่อเสียงรบกวน เพื่ออุทิศถวายการศึกษา ( O.D . ,การล้างและ resuspended วัฒนธรรมถ่ายที่ 600 นาโนเมตร และเพิ่มปริมาณที่เหมาะสมเพื่อให้สอดคล้องกับวัตถุประสงค์ เบอร์โทร .

สำหรับ UV VIS NIR สเปกโทรสโกปีและตัวอย่างเตรียมไว้ข้างต้นและ 100 μ l resuspended แบคทีเรียวัฒนธรรมเห็น 1 ตร. ซม. พื้นผิวซิลิคอนเวเฟอร์ ( SI 1 – 0 – 0 ) และ แห้งภายใต้ไฟ IRดร ––– UV VIS NIR การวัดที่ 200 – 2 , 700 nm ดำเนินการใน 2 สเปกคาน ( v-670-nir jasco , ) พร้อมแนบค่าการสะท้อนแสง การลบที่ต้องการของสเปกตรัมของจังหวัด ( 1 – 0 – 0 ) คือทำอะไรให้แต่ละแบคทีเรียสเปกตรัมเพื่อลบใด ๆที่บริจาคจากพื้นผิวครับ สองกระจกใช้เป็นข้อมูลอ้างอิงสำหรับเหมือนกัน

เบส 16S rRNA ยีนเครื่องขยายเสียงและการจัดลำดับสากลไปข้างหน้าและย้อนกลับและบน agagtttgatcmtggctcag tacggytac cttgttacgactt ได้จาก mwg
, เยอรมนี