Fluorescently labeled primers wereu

Fluorescently labeled primers were
used to amplify fragments of both 16S (primers 341F,
TAMRA-50cctacgggaggcagcag30 , and 926R, RhodamineRedX-50ccgtc
ccgtc aattcctttragttt30; Liu et al., 1997) and 18S (primers EukA, FAM-
50aacctggttgatcctgccagt30 , and Euk570rev, HEX-50gctattggagct
ggaattac30) rRNA genes (Countway et al., 2005). All PCR reagents
were acquired from Promega, and fluorescently labeled primers
were synthesized by Integrated DNA Technologies. Triplicate 50 ml
PCRs contained 10 ml of 5 GoTaq Flexi Buffer, 3 ml of 25 mM MgCl2,
5 ml of dNTPs for 250 mM final concentration each, 4 ml of a 5 mM
stock of the forward primer 341F or EukA, 4 ml of a 5 mM stock of the
reverse primer 926R or Euk570rev, 0.5 ml 10 mg/ml acetylated BSA,
and 100 ng of template. Reactions were heated to 95 8C for 2 min,
then held at 80 8C while 1 U GoTaq Flexi DNA polymerase (Promega)
was added, and amplification was performed for 30 cycles of 95 8C
for 30 s, 57 8C (16S) or 55 8C (18S) for 30 s, and 72 8C for 1 min,
followed by a final extension at 72 8C for 5 min and a 4 8C hold. PCR
products were visualized on 1.2% agarose gels to confirm
amplification of products of the expected size. Replicate PCR
products were pooled and purified with Promega Wizard SV Gel and
PCR Clean-up System. The DNA was quantified by PicoGreen
staining (Invitrogen) and a Turner Designs TBS-380 Mini Fluorome-
ter. PCR products were treated with Klenow fragment (from
Promega) to fill in partially single-stranded amplicons (Egert
and Friedrich, 2005). Reactions (50 ml) contained 5 ml Klenow 10 buffer,2 ml ofdNTPsat250 mMfinalconcentration each,0.25 ml
acetylated BSA 10 mg/ml, and 1 U Klenow per mg DNA (typical
reactions contained from 0.5 to 2.0 mg of DNA). Reactions were
incubated at 25 8C for 50 min and the reaction stopped by heating to
75 8C for 10 min.Productswerepurified withPromegaWizardSVGel
and PCR Clean-up System and quantified by PicoGreen staining.
Klenow-treated PCR product (100 ng) was then digested with the
Promega restriction enzyme TaqI according to manufacturer
instructions in duplicate. Duplicate digests were pooled, ethanol
precipitated, and resuspended in 10 ml molecular grade water. Hi-Di
formamide (10 ml) and 0.5 ml of Genescan 600 LIZ size standard
(Applied Biosystems) were added to 1 ml of sample and analyzed on
an ABI3130XL capillary electrophoresis DNA fragment analyzer.
Electropherograms were processed with Peak Scanner version 1.0
software (Applied Biosystems). Trials with uncut Klenow-treated
PCR product showed no artifact peaks. Peakswere binned in T-REXTM
(Culman et al., 2008) using the algorithm developed by Smith et al.
(2005) and allowing more than one peak to be assigned to the same
terminal restriction fragment (TRF). T-RFLP data matrices were
exportedfromT-REXTMasabsolutepeakarea.Fragmentsbetween30
and600basesinlengthwereincludedintheanalysis.Foreachprimer
(341F produced yellow, Y, TRFs; 926R produced red, R, TRFs; EukA
produced blue, B, TRFs; and Euk570rev produced green, G, TRFs), the
totalpeak areaofeachsamplewas normalizedtothe sample withthe
lowesttotalpeakarea.Normalizedpeaksthatfellbelowthedetection
threshold or were found in only one profile were removed to reduce
effectsofunequal sampleloading, and the contribution ofeachTRF to
total peak area (for each color/sample combination) was calculated
for further analysis.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ไพรเมอร์ fluorescently ป้ายได้ใช้ขยายชิ้นส่วนของ 16S ทั้ง (ไพรเมอร์ 341FTAMRA 50cctacgggaggcagcag30 และ 926R, RhodamineRedX-50ccgtcccgtc aattcctttragttt30 หลิวและ al., 1997) และ 18S (ไพรเมอร์ EukA, FAM -50aacctggttgatcctgccagt30 และ Euk570rev หกเหลี่ยม 50gctattggagctggaattac30) rRNA ยีน (Countway et al., 2005) Reagents PCR ทั้งหมดได้รับมาจาก Promega และ fluorescently ป้ายไพรเมอร์ถูกสังเคราะห์ ด้วยเทคโนโลยีดีเอ็นเอ Triplicate 50 mlPCRs อยู่ 10 ml ของบัฟเฟอร์ Flexi GoTaq 5, 3 มล.ของ MgCl2, 25 มม.5 ml ของ dNTPs สำหรับ 250 มม.สุดท้ายเข้มข้นละ ml 4 มม. 5หุ้นรองพื้นไปข้างหน้า 341F หรือ EukA, 4 ml ของคลัง 5 มม.กลับพื้น 926R หรือ Euk570rev, 0.5 ml 10 mg/ml acetylated บีเอสเอและ 100 ng ของแม่ ปฏิกิริยาที่อุณหภูมิ 95 8C ในนาทีที่ 2บริเวณ 80 8C ขณะ 1 U GoTaq Flexi ดีเอ็นเอพอลิเมอเรส (Promega)เพิ่ม และทำการขยายสำหรับรอบ 30 ของ 95 8Cสำหรับ 30 s, 8C 57 (16S) หรือ 8C 55 (18S) สำหรับ 30 s และ 72 8C ใน 1 นาทีตาม ด้วยนามสกุลเป็นขั้นสุดท้ายที่ 72 8C 4 8C และ 5 นาทีค้างไว้ PCRผลิตภัณฑ์มี visualized บน agarose 1.2% ยืนยันขยายผลิตภัณฑ์ขนาดคาดไว้ ทำ PCRผลิตภัณฑ์ทางถูกพู และบริสุทธิ์ที่ มี Promega ช่วยเอสเจ และระบบล้าง PCR ดีเอ็นเอถูก quantified โดย PicoGreenย้อมสี (Invitrogen) และเป็นช่างกลึงออกแบบ TBS 380 มินิ Fluorome-ter. ผลิตภัณฑ์ PCR ได้รับการรักษา ด้วยส่วน Klenow (จากPromega) ในบางส่วนเดียวควั่น amplicons (Egertและฟรีดริ ช 2005) ปฏิกิริยา (50 ml) อยู่ 5 ml Klenow 10 บัฟเฟอร์ 2 ml ofdNTPsat250 mMfinalconcentration ละ 0.25 mlบีเอสเอ acetylated 10 mg/ml และ 1 U Klenow ต่อมิลลิกรัม (ปกติดีเอ็นเอปฏิกิริยามีอยู่จาก 0.5 ถึง 2.0 มิลลิกรัมของดีเอ็นเอ) ปฏิกิริยาได้incubated ที่ 8C 25 50 นาทีและปฏิกิริยาหยุดด้วยความร้อนเพื่อ75 8C สำหรับ 10 นาที Productswerepurified withPromegaWizardSVGelและระบบล้าง PCR และ quantified โดยย้อมสี PicoGreenรักษา Klenow ผลิตภัณฑ์ PCR (100 ng) ถูกต้องแล้วด้วยการPromega จำกัดเอนไซม์ TaqI ตามผู้ผลิตคำแนะนำในซ้ำ Digests ซ้ำถูกทางถูกพู เอทานอลตะกอน และ resuspended ใน 10 ml เกรดโมเลกุลน้ำ ไฮ ดิformamide (10 ml) และ 0.5 ml ของลิซ 600 Genescan ขนาดมาตรฐานเพิ่ม 1 มิลลิลิตรของตัวอย่าง และวิเคราะห์บน (Biosystems ใช้)การ ABI3130XL electrophoresis รูพรุนดีเอ็นเอส่วนวิเคราะห์Electropherograms ถูกประมวลผล ด้วยคสแกนเนอร์รุ่น 1.0ซอฟต์แวร์ (Biosystems ใช้) ทดลองกับเด็ดขาดถือว่า Klenowผลิตภัณฑ์ PCR พบไม่ยอดสิ่งประดิษฐ์ Peakswere binned ใน T-REXTM(Culman et al., 2008) โดยใช้อัลกอริทึมพัฒนาขึ้นโดย Smith et al(2005) และอนุญาตให้สูงสุดมากกว่าหนึ่งจะกำหนดเหมือนกันส่วนเทอร์มินัลจำกัด (สกว.) เมทริกซ์ข้อมูล T RFLP ถูกexportedfromT-REXTMasabsolutepeakarea.Fragmentsbetween30and600basesinlengthwereincludedintheanalysis Foreachprimer(341F ผลิตสีเหลือง Y, TRFs สีแดงผลิต 926R, R, TRFs EukAผลิตบลู B, TRFs และ Euk570rev ผลิตสีเขียว G, TRFs), การตัวอย่าง normalizedtothe areaofeachsamplewas totalpeak ด้วยการlowesttotalpeakarea Normalizedpeaksthatfellbelowthedetectionขีดจำกัด หรือพบในโพรไฟล์เฉพาะหนึ่งออกเพื่อลดeffectsofunequal sampleloading และ ofeachTRF ส่วนการมีคำนวณยอดรวมพื้นที่ (สำหรับแต่ละชุดสี/ตัวอย่าง)สำหรับการวิเคราะห์เพิ่มเติม

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ไพรเมอร์ที่มีข้อความ fluorescently ถูก
นำมาใช้เพื่อขยายชิ้นส่วนของทั้ง 16S (ไพรเมอร์ 341F,
Tamra-50cctacgggaggcagcag30 และ 926R, RhodamineRedX-50ccgtc
ccgtc aattcctttragttt30. หลิว, et al, 1997) และ 18S (ไพรเมอร์ EukA, FAM-
50aacctggttgatcctgccagt30 และ Euk570rev, HEX- 50gctattggagct
ggaattac30) ยีน rRNA (Countway et al., 2005) ทั้งหมดน้ำยา PCR
ได้มาจาก Promega และไพรเมอร์ที่มีข้อความ fluorescently
ถูกสังเคราะห์ดีเอ็นเอโดยเทคโนโลยีแบบบูรณาการ เพิ่มขึ้นสามเท่า 50 มล
PCRs บรรจุ 10 มล. 5? GoTaq Flexi บัฟเฟอร์ 3 มล. 25 มิลลิ MgCl2,
5 มิลลิลิตร dNTPs 250 มิลลิเข้มข้นสุดท้ายแต่ละ 4 มิลลิลิตร 5 มิลลิ
สต็อกของไพรเมอร์ไปข้างหน้า 341F หรือ EukA 4 มิลลิลิตรหุ้นมิลลิ 5 ของ
ไพรเมอร์กลับ 926R หรือ Euk570rev, 0.5 มล. 10 mg / ml acetylated บีเอสเอ
และ 100 นาโนกรัมของแม่แบบ ปฏิกิริยาถูกความร้อนถึง 95 8C สำหรับ 2 นาที
จากนั้นจัดขึ้นที่ 80 ในขณะที่ 8C 1 U GoTaq ดีเอ็นเอโพลิเมอร์ Flexi (Promega)
ได้รับการเพิ่มและขยายได้ดำเนินการเป็นเวลา 30 รอบ 95 8C
30 วินาที, 57 8C (16S) หรือ 55 8C (18S) เป็นเวลา 30 วินาทีและ 72 8C 1 นาที
ตามด้วยนามสกุลสุดท้ายที่ 72 8C เป็นเวลา 5 นาทีและ 4 8C ถือ PCR
ผลิตภัณฑ์ได้รับการมองเห็นใน 1.2% agarose เจลเพื่อยืนยัน
การขยายของผลิตภัณฑ์ที่มีขนาดที่คาดว่าจะ ทำซ้ำ PCR
ผลิตภัณฑ์ที่ได้รวบรวมและบริสุทธิ์ที่มีตัวช่วยสร้าง Promega เอเจลและ
PCR ระบบทำความสะอาด ปริมาณดีเอ็นเอโดย PicoGreen
ย้อมสี (Invitrogen) และเทอร์เนอออกแบบ TBS-380 มินิ Fluorome-
ตรี ผลิตภัณฑ์พีซีอาร์ได้รับการรักษาที่มีส่วน Klenow (จาก
Promega) เพื่อเติมเต็มในบางส่วน amplicons เดียวควั่น (Egert
และฟรีดริช, 2005) ปฏิกิริยา (50 มล.) ที่มีขนาด 5 ml Klenow 10 บัฟเฟอร์ 2 มิลลิลิตร ofdNTPsat250 mMfinalconcentration แต่ละ 0.25 มล.
acetylated บีเอสเอ 10 mg / ml และ 1 U Klenow มิลลิกรัมต่อดีเอ็นเอ (ทั่วไป
ปฏิกิริยาที่มี 0.5-2.0 มิลลิกรัม DNA) ปฏิกิริยาถูก
บ่มที่ 25 8C สำหรับ 50 นาทีและหยุดปฏิกิริยาความร้อน
75 8C 10 min.Productswerepurified withPromegaWizardSVGel
PCR และระบบทำความสะอาดและปริมาณโดยการย้อมสี PicoGreen.
Klenow รับการรักษาผลิตภัณฑ์ PCR (100 นาโนกรัม) ถูกย่อยแล้วด้วย
Promega ข้อ จำกัด เอนไซม์ Taqi ตามที่ผู้ผลิต
คำแนะนำในที่ซ้ำกัน ย่อยสลายซ้ำถูกรวบรวมเอทานอล
ตกตะกอนและ resuspended ใน 10 มล. น้ำเกรดโมเลกุล Hi-Di
formamide (10 มล.) และ 0.5 มิลลิลิตร Genescan 600 มาตรฐาน LIZ ขนาด
(Applied Biosystems) ถูกเพิ่มเข้าไปใน 1 มิลลิลิตรของกลุ่มตัวอย่างและวิเคราะห์เกี่ยวกับการ
วิเคราะห์ดีเอ็นเอชิ้นส่วนอิเล็กฝอย ABI3130XL.
Electropherograms ถูกประมวลผลด้วยเครื่องสแกนเนอร์พีครุ่น 1.0
ซอฟแวร์ (ประยุกต์ Biosystems) ทดลองกับ Klenow รับการรักษาไม่ได้เจียระไน
ผลิตภัณฑ์ PCR แสดงให้เห็นว่ายอดสิ่งประดิษฐ์ไม่มี Peakswere binned ใน T-REXTM
(Culman et al., 2008) โดยใช้อัลกอริทึมที่พัฒนาโดยสมิ ธ et al.
(2005) และอนุญาตให้มากกว่าหนึ่งจุดสูงสุดที่จะได้รับมอบหมายให้เดียวกัน
ส่วนข้อ จำกัด ขั้ว (สกว) T-RFLP ข้อมูลการฝึกอบรม ผลิตสีเหลือง, Y, TRFs; ผลิต 926R สีแดง, R, TRFs; EukA ผลิตสีฟ้า, B, TRFs; และ Euk570rev ผลิตสีเขียว, G, TRFs) totalpeak areaofeachsamplewas withthe ตัวอย่าง normalizedtothe lowesttotalpeakarea.Normalizedpeaksthatfellbelowthedetection เกณฑ์หรือถูกพบอยู่ในเพียงหนึ่งรายละเอียดที่ถูกถอดออกเพื่อลดsampleloading effectsofunequal และมีส่วนร่วมในการ ofeachTRF พื้นที่สูงสุดรวม (สำหรับแต่ละสี / การรวมตัวอย่าง) ที่คำนวณได้สำหรับการวิเคราะห์ต่อ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

fluorescently ข้อความโดยการใช้อำนาจของทั้ง
ชิ้นส่วน 16S ( ไพรเมอร์ 341f
tamra-50cctacgggaggcagcag30 , และ 926r rhodamineredx-50ccgtc
, ccgtc aattcctttragttt30 ; Liu et al . , 1997 ) และ 18S ( ไพรเมอร์ euka เพื่อน -
50aacctggttgatcctgccagt30 และ euk570rev hex-50gctattggagct
, ggaattac30 ) rRNA ยีน ( ตามทางเดิน et al . , 2005 ) ทั้งหมดได้มาจาก promega pcr reagents
,ป้ายสังเคราะห์ไพรเมอร์ และ fluorescently
โดยดีเอ็นเอเทคโนโลยีแบบบูรณาการ ทำสำเนาสามฉบับ 50 ml
pcrs ที่มีอยู่ 10 ml 5  gotaq Flexi บัฟเฟอร์ , 3 ml ชุด 25 มม. ,
5 มิลลิลิตร dntps 250 มิลลิเมตรสุดท้ายของแต่ละ , 4 ml 5 mm
หุ้นของส่งต่อรองพื้น 341f หรือ euka , 4 ml 5 มิลลิเมตรหุ้นของ
กลับ 926r รองพื้นหรือ euk570rev 10 mg / ml ยาวขนาด 0.5 มล.
, และ 100 ng ของแม่แบบปฏิกิริยาความร้อน 95 8C 2 มิน
จากนั้นจัดขึ้นที่ 80 8C ในขณะที่ 1 u gotaq ดีเอ็นเอพอลิเมอเรส ( promega Flexi )
ถูกเพิ่มและขยายได้ 30 รอบ 95 8C
30 , 57 8C ( 16S ) หรือ 55 8C ( 18S ) 30 , และ 72 8C สำหรับ 1 นาที ตามด้วยนามสกุล
สุดท้ายที่ 72 8C เป็นเวลา 5 นาทีและ 4 8C ถือ ผลิตภัณฑ์ PCR
ถูกมองเห็นใน 1.2% , ยืนยัน
เจลแบบผลิตภัณฑ์ของคาดขนาด เลียนแบบผลิตภัณฑ์ PCR
ถูกรวมและทำให้บริสุทธิ์ ด้วยเจล SV ตัว promega
PCR และทำความสะอาดระบบ ดีเอ็นเอ quantified โดย picogreen
staining ( Invitrogen ) และหมุนแบบ tbs-380 มินิ fluorome -
เธอ . ผลิตภัณฑ์ทั้งหมดจะถูกรักษาด้วย klenow ~ (
promega ) เพื่อเติมเต็มในบางส่วนเดียวติด amplicons ( เอเกิร์ต
และ ฟรีดริช , 2005 )ปฏิกิริยา ( 50 มล. ) ที่มีอยู่ 5 ml klenow 10  บัฟเฟอร์ , 2 ml ofdntpsat250 mmfinalconcentration ละ 0.25 ml
ยาวขนาด 10 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตร และ 1 u klenow ต่อมิลลิกรัม DNA ( ปฏิกิริยาทั่วไป
ที่มีอยู่จาก 0.5 ถึง 2.0 มิลลิกรัมของดีเอ็นเอ ) ปฏิกิริยา
อุณหภูมิ 25 8C 50 นาที และหยุดปฏิกิริยาความร้อน
75 8C 10 นาที productswerepurified withpromegawizardsvgel
และ PCR ทำความสะอาดระบบและ quantified โดย picogreen staining
klenow รักษาผลิตภัณฑ์ PCR ( 100 กรัม ) ถูกย่อยด้วยเอนไซม์ promega

taqi ตามผู้ผลิตคำแนะนำในที่ซ้ำกัน ย่อยซ้ำเป็นพู เอทานอล
ตกตะกอน และ resuspended 10 ml ระดับโมเลกุลน้ำ สวัสดีค่ะ ดิ
ฟอร์มาไมด์ ( 10 มล. ) และ 0.5 มิลลิลิตร ขนาดมาตรฐาน
genescan 600 ลิซ( Applied Biosystems ) เพิ่ม 1 มิลลิลิตรของตัวอย่างและวิเคราะห์ในการ abi3130xl capillary electrophoresis

electropherograms ดีเอ็นเอวิเคราะห์ วิเคราะห์ด้วยยอดเครื่องสแกนเนอร์รุ่น 1.0
ซอฟต์แวร์ ( Applied Biosystems ) การทดลองกับการเจียระไน klenow
PCR ไม่พบยอด ผลิตภัณฑ์ สิ่งประดิษฐ์ peakswere binned ใน t-rextm
( culman et al . , 2008 ) โดยใช้อัลกอริทึมที่พัฒนาโดย Smith et al .
( 2005 ) และให้มากกว่าหนึ่งสูงสุดที่จะได้รับมอบหมายเหมือนกัน
เทอร์มินัลจำกัดจำเพาะ ( TRF ) t-rflp เมทริกซ์ข้อมูล
exportedfromt rextmasabsolutepeakarea . fragmentsbetween30
and600basesinlengthwereincludedintheanalysis . foreachprimer
( 341f ผลิตสีเหลือง , Y , trfs ; 926r ผลิตสีแดง , R , trfs ; euka
ผลิตสีฟ้า , B , trfs และ euk570rev ผลิตสีเขียว , g ,
trfs )totalpeak areaofeachsamplewas normalizedtothe ตัวอย่างกับ lowesttotalpeakarea
.
normalizedpeaksthatfellbelowthedetection ธรณีประตูหรือพบเพียงหนึ่งโปรไฟล์ถูกลบออกเพื่อลด
effectsofunequal sampleloading และบริจาค ofeachtrf

พื้นที่พีคทั้งหมด ( แต่ละสี / ตัวอย่างการรวมกัน ) คือคำนวณ
สำหรับการวิเคราะห์ต่อไป