S. cerevisiae osmotic-remedial ther

S. cerevisiae osmotic-remedial thermosensitive autolytic mutants have been employed to produce and release K. lactis β-
galactosidase into the culture medium (Becerra et al., 1997; Becerra et al., 2004). In this way, 63 and 83% of total recombinant β galactosidase activity could be detected in YPD medium (yeast extract peptone dextrose medium) after osmotic shock of the yeast cells from each strain, respectively (Becerra et al., 1997). The maximum extracellular β-galactosidase activity obtained corresponded to 63% of release (Table 1). In this case, plasmid stability at the end of the culture was about 70%. (ii) Different recombinant yeast strains able to secrete K. lactis β-galactosidase into the culture medium have been constructed. The secretion signal of the K. lactis killer toxin was used to secrete K. lactis β-galactosidase in a K. lactis strain mutated in the lac4 gene (Becerra et al., 2001b; Rodríguez et al., 2006). That same signal sequence and the Saccharomyces α-factor have both been used to secrete K. lactis β-galactosidase in different S. cerevisiae strains (Becerra et al., 2001a; Becerra et al., 2001b; Becerra et al., 2002; Becerra et al., 2004).However, in all these works only partial secretion of recombinant β-galactosidase was achieved in the culture medium. Nevertheless, the constructed strains were able to growon lactose as sole carbon source. Different constructions and culture conditions were experimented to improve heterologous secretion of K. lactis β galactosidase. S. cerevisiae super-secreting mutants, together with the secretion signal of the K. lactis killer toxin, were used with that purpose but the maximum recombinant β-galactosidase activity detected in the culture medium corresponded only to 0.83% of secretion (Becerra et al., 2001a; Table 1). Although recombinant strains have grown well in YPL medium(yeast extract peptone lactose medium), the β-galactosidase activity and plasmid stability were considerably lower in this medium than in YPD medium(plasmid stability of the best secreting strain: 75% in YPD (120 h) and 43% in YPL (168 h)). An experimental factorial design was implemented to increase the secretion of heterologous β-galactosidase in a S. cerevisiae strain, using the α-factor signal sequence (Becerra et al., 2001b; Becerra et al., 2002). Cheese whey permeate, YPD and YPHSM (YPD medium plus glycerol and calcium chloride) media were used and the best results were obtained with YPD medium followed by YPHSM medium (Becerra et al., 2001b). The extracellular enzyme activity obtained in YPHSM medium at the determined optimal culture conditions (temperature: 23 °C; aeration: 2 rpm/mL;NaCl: 0%; time: 72 h) led to an 8-fold increase in β-galactosidase secretion (Becerra et al., 2001b; Table 1). The production of extracellular recombinant β-galactosidase by the lac4 mutated K. lactis strain was conducted in a 2-L bioreactor in both batch and continuous conditions, using different media (Becerra et al., 2001b). The higher extracellular recombinant β-galactosidase activity was obtained in continuous chemostat culture (μ=0.02 h−1) and corresponded to 6.64% of enzyme secretion (Becerra et al., 2001b). Plasmid stability was 75% under these conditions. Interestingly, the percentage of secretion by K. lactis was improved by direct mutagenesis of the N-terminal of the protein (Becerra et al., 2001b). To further improve secretion of heterologous β-galactosidase in K. lactis two hybrid proteins between K. lactis and A. niger β-galactosidases were constructed (Rodríguez et al., 2006). The secretion signal of the K. lactis killer toxin was fused to theN-terminal of each hybrid protein to allow their secretion. A hybrid enzyme with improved secretion was obtained by replacing the C-terminal five domains of K. lactis β-galactosidase with the corresponding five domains of A. niger β-galactosidase. Nevertheless, the activity levels of the hybrid and native β-galactosidases obtained in that work (Rodríguez et al., 2006)were lower than that obtained previously for the native enzyme using the same yeast strain and plasmid (Becerra et al., 2001b).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

S. cerevisiae สายพันธุ์ autolytic thermosensitive การออสโมติกแก้ไขได้รับการว่าจ้างการผลิต และปล่อยเค lactis β-galactosidase เป็นสื่อวัฒนธรรม (Becerra et al. 1997 Becerra et al. 2004) ในวิธีนี้ 63 และ 83% ของกิจกรรมทั้งหมด recombinant β galactosidase พบใน YPD (ยีสต์สกัด peptone เดกซ์โทรสปานกลาง) หลังจากช็อกออสโมติกของเซลล์ยีสต์จากแต่ละสายพันธุ์ ตามลำดับ (Becerra et al. 1997) กิจกรรมสูงสุดสารβ-galactosidase ได้ผูกพันกับ 63% ของการปล่อย (ตารางที่ 1) ในกรณีนี้ plasmid เสถียรที่สุดของวัฒนธรรมเป็นประมาณ 70% (ii) ต่าง recombinant ยีสต์สามารถขับเค lactis β-galactosidase เป็นสื่อวัฒนธรรมได้รับการก่อสร้าง ใช้สัญญาณการหลั่งของสารพิษฆ่า lactis เคขับเค lactis β-galactosidase ในเค lactis สายพันธุ์กลายพันธุ์ในยีน lac4 (Becerra et al. 2001b ปี et al. 2006) ที่ลำดับสัญญาณเดียวกันและ Saccharomyces α-ปัจจัยมีทั้งการใช้การหลั่งเค lactis β-galactosidase ในต่าง S. cerevisiae สายพันธุ์ (Becerra et al. 2001a Becerra et al. 2001b Becerra et al. 2002 Becerra et al. 2004) อย่างไรก็ตาม ในผลงานเหล่านี้ หลั่งเพียงบางส่วนของ recombinant β-galactosidase สำเร็จในสื่อวัฒนธรรม อย่างไรก็ตาม สายพันธุ์ที่สร้างขึ้นก็สามารถที่จะ growon แลคโตสเป็นแหล่งคาร์บอนแต่เพียงผู้เดียว วัฒนธรรมเงื่อนไขและโครงสร้างแตกต่างถูกทดลองเพื่อปรับปรุง heterologous หลั่งของ K. lactis β galactosidase S. cerevisiae ซ่อนซูเปอร์กลายพันธุ์ ร่วมกับสัญญาณการหลั่งของ K. lactis นักฆ่า ใช้กับวัตถุประสงค์ แต่กิจกรรมβ galactosidase recombinant สูงสุดที่พบในสื่อวัฒนธรรมผูกพันเท่ากับ 0.83% ของหลั่ง (Becerra et al. 2001a ตาราง 1) แม้สายพันธุ์ recombinant เติบโตดีใน YPL กลาง (ยีสต์สกัด peptone แล็กโทสปานกลาง), β-galactosidase กิจกรรมและเสถียรภาพ plasmid ก็ต่ำกว่ามากในสื่อนี้กว่าใน YPD (plasmid เสถียรภาพของซ่อนสายพันธุ์ที่ดีสุด: 75% ใน YPD (120 ชั่วโมง) และ 43% ใน YPL (168 ชั่วโมง)) แฟกทอเรียลแบบทดลองใช้งานเพื่อเพิ่มการหลั่งของβ-galactosidase heterologous ใน S. cerevisiae สายพันธุ์ ใช้ลำดับสัญญาณαปัจจัย (Becerra et al. 2001b Becerra et al. 2002) ชีสเวย์ซึม YPD และ YPHSM สื่อ (YPD ปานกลาง และกลีเซอรอล และแคลเซียมคลอไรด์) ถูกนำมาใช้ และได้รับผลลัพธ์ที่ดีที่สุดกับ YPD ปานกลางตาม ด้วย YPHSM ปานกลาง (Becerra et al. 2001b) กิจกรรมสารเอนไซม์ได้ใน YPHSM ที่มีเงื่อนไขกำหนดวัฒนธรรมที่เหมาะสม (อุณหภูมิ: 23 ° C อากาศ: 2 rpm/mL NaCl: 0% เวลา: 72 ชม.) นำไปสู่การเพิ่มขึ้นของ 8-fold β-galactosidase หลั่ง (Becerra et al. 2001b ตาราง 1) การผลิตสาร recombinant β-galactosidase โดยสายพันธุ์ lactis เค lac4 กลายดำเนินการในถังปฏิกรณ์ชีวภาพ 2 L ในชุดเงื่อนไขต่อเนื่อง การใช้สื่อที่แตกต่าง (Becerra et al. 2001b) กิจกรรมสาร recombinant β-galactosidase สูงขึ้นมาในวัฒนธรรม chemostat ต่อเนื่อง (μ = 0.02 h−1) และความผูกพันที่ 6.64% หลั่งเอนไซม์ (Becerra et al. 2001b) ความเสถียรของ plasmid เป็น 75% ภายใต้เงื่อนไขเหล่านี้ เรื่องน่าสนใจ เปอร์เซ็นต์ของการหลั่งโดย K. lactis ถูกปรับปรุง โดย mutagenesis โดยตรงของขั้ว N ของโปรตีน (Becerra et al. 2001b) เพิ่มการหลั่งของβ-galactosidase heterologous ในไฮบริ lactis สองเค โปรตีนระหว่างเค lactis และไนเจอร์ A. β-galactosidases สร้าง (ปี et al. 2006) สัญญาณการหลั่งของสารพิษฆ่า lactis เคถูกหลอมรวมไปแล้วเทอร์มินัลแต่ละโปรตีนไฮบริดเพื่อให้หลั่งของพวกเขา เอนไซม์ไฮบริดสลีกับหลั่งดีขึ้นได้รับ โดยการเปลี่ยนโดเมน 5 C-เทอร์มินัลของ K. lactis β-galactosidase ด้วยโดเมนห้าที่สอดคล้องกันของ A. ไนเจอร์β-galactosidase อย่างไรก็ตาม ระดับกิจกรรมของไฮบริดสลีและβ-galactosidases ดั้งเดิมที่ได้รับในที่ทำงาน (ปี et al. 2006) ได้ต่ำกว่าที่ได้รับก่อนหน้านี้สำหรับเอนไซม์ดั้งเดิมที่ใช้ plasmid (Becerra et al. 2001b) และยีสต์สายพันธุ์เดียวกัน

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

S. cerevisiae ออสโมติก-เยียวยากลายพันธุ์การสลายตัวของ thermosensitive ได้รับการว่าจ้างในการผลิตและปล่อยเค lactis β-
galactosidase ลงในอาหารเลี้ยงเชื้อ (Becerra, et al, 1997;.. Becerra, et al, 2004) ด้วยวิธีนี้ 63 และ 83% ของกิจกรรมβ galactosidase รวม recombinant จะได้รับการตรวจพบใน YPD กลาง (กลางยีสต์สารสกัดจากเปปโตนเดกซ์โทรส) หลังจากช็อตออสโมติกของเซลล์ยีสต์จากแต่ละสายพันธุ์ตามลำดับ (Becerra et al., 1997) extracellular กิจกรรมβ-galactosidase สูงสุดที่ได้รับตรงกับ 63% ของการปล่อย (ตารางที่ 1) ในกรณีนี้มีความมั่นคงพลาสมิดที่ส่วนท้ายของวัฒนธรรมเป็นประมาณ 70% (ii) ยีสต์ recombinant ที่แตกต่างกันสามารถที่จะหลั่งเค lactis β-galactosidase ลงในอาหารเลี้ยงเชื้อที่ได้รับการสร้างขึ้น สัญญาณการหลั่งของเคฆาตกร lactis สารพิษถูกใช้ในการหลั่งเค lactis β-galactosidase ใน lactis สายพันธุ์เคกลายพันธุ์ในยีน lac4 นี้ (Becerra, et al, 2001b;.. Rodríguez et al, 2006) ว่าลำดับสัญญาณเดียวกันและ Saccharomyces αปัจจัยทั้งสองถูกนำมาใช้ในการหลั่งเค lactis β-galactosidase ในสายพันธุ์ที่แตกต่างกัน S. cerevisiae (Becerra, et al, 2001a. Becerra, et al, 2001b. Becerra et al, 2002. Becerra et al., 2004) อย่างไรก็ตามในการทำงานทั้งหมดเหล่านี้เท่านั้นหลั่งบางส่วนของ recombinant β-galactosidase ก็ประสบความสำเร็จในระดับปานกลางวัฒนธรรม แต่สายพันธุ์ที่สร้างขึ้นก็สามารถที่จะ growon แลคโตสเป็นแหล่งคาร์บอน แต่เพียงผู้เดียว การก่อสร้างและเงื่อนไขวัฒนธรรมที่แตกต่างได้รับการทดลองเพื่อปรับปรุงการหลั่งของ heterologous เค lactis β galactosidase S. cerevisiae ซุปเปอร์หลั่งกลายพันธุ์ร่วมกับสัญญาณการหลั่งของเคฆาตกร lactis สารพิษถูกนำมาใช้กับวัตถุประสงค์ที่ แต่กิจกรรมβ-galactosidase recombinant สูงสุดตรวจพบในอาหารเลี้ยงเชื้อตรงเพียง 0.83% ของการหลั่ง (Becerra et al, ., 2001a; ตารางที่ 1) แม้ว่าสายพันธุ์ recombinant มีการเจริญเติบโตได้ดีใน YPL กลาง (ยีสต์กลางสารสกัดจากเปปโตนแลคโตส) กิจกรรมβ-galactosidase และความมั่นคงพลาสมิดเป็นอย่างมากลดลงในสื่อนี้กว่าใน YPD กลาง (ความมั่นคงพลาสมิดของความเครียดหลั่งที่ดีที่สุด: 75% ใน YPD (120 เอช) และ 43% ใน YPL (168 ชั่วโมง)) การออกแบบการทดลองปัจจัยถูกนำมาใช้เพื่อเพิ่มการหลั่งของ heterologous β-galactosidase ในสายพันธุ์ cerevisiae เอสโดยใช้ลำดับสัญญาณα-ปัจจัย (Becerra, et al, 2001b;.. Becerra, et al, 2002) ชีสเวย์ซึม, YPD และ YPHSM (YPD กลางบวกและกลีเซอรอลแคลเซียมคลอไรด์) สื่อถูกนำมาใช้และผลลัพธ์ที่ดีที่สุดที่ได้รับกับสื่อ YPD ตามสื่อ YPHSM (Becerra et al., 2001b) กิจกรรมของเอนไซม์สารที่ได้รับในกลาง YPHSM ที่สภาพการเลี้ยงที่เหมาะสมมุ่งมั่น (อุณหภูมิ: 23 ° C; เติมอากาศ: 2 รอบต่อนาที / mL; โซเดียมคลอไรด์: 0%; เวลา: 72 ชั่วโมง) นำไปสู่การเพิ่มขึ้น 8 เท่าในการหลั่งβ-galactosidase (Becerra, et al, 2001b. ตารางที่ 1) การผลิตสาร recombinant β-galactosidase โดย lac4 กลายพันธุ์สายพันธุ์ lactis เคได้ดำเนินการในเครื่องปฏิกรณ์ชีวภาพ 2-L ทั้งชุดและเงื่อนไขอย่างต่อเนื่องโดยใช้สื่อที่แตกต่างกัน (Becerra et al., 2001b) extracellular กิจกรรมβ-galactosidase recombinant สูงกว่าที่ได้รับในวัฒนธรรม chemostat ต่อเนื่อง (μ = 0.02 H-1) และตรงกับ 6.64% ของการหลั่งเอนไซม์ (Becerra et al., 2001b) ความมั่นคงพลาสมิด 75% ภายใต้เงื่อนไขเหล่านี้ ที่น่าสนใจร้อยละของการหลั่งโดยพ lactis ถูกปรับปรุงโดยฉับโดยตรงของ N-ขั้วของโปรตีน (Becerra et al., 2001b) เพื่อปรับปรุงการหลั่งของ heterologous β-galactosidase ในเค lactis สองโปรตีนลูกผสมระหว่าง lactis และเคเอไนเจอร์β-galactosidases ถูกสร้างขึ้น (Rodríguez et al., 2006) สัญญาณการหลั่งของเคฆาตกร lactis สารพิษได้รับการผสมแล้วขั้วของแต่ละโปรตีนไฮบริดที่จะช่วยให้การหลั่งของพวกเขา เอนไซม์ไฮบริดที่มีการหลั่งดีขึ้นได้โดยการเปลี่ยนขั้ว c- ห้าโดเมนของเค lactis β-galactosidase กับที่สอดคล้องกันห้าโดเมนของเอไนเจอร์β-galactosidase อย่างไรก็ตามระดับกิจกรรมของไฮบริดและพื้นเมืองβ-galactosidases ได้รับในที่ทำงาน (Rodríguez et al., 2006) ต่ำกว่าที่ได้รับก่อนหน้านี้สำหรับการทำงานของเอนไซม์พื้นเมืองโดยใช้ยีสต์ที่เหมือนกันและพลาสมิด (Becerra et al., 2001b) .