Cartilage stem/progenitor cells wer

Cartilage stem/progenitor cells were
counted and collected (passage 7) in logarithmic phase with
conventional method. 1–5 × 105 cells/pipe were transferred
into the flow tube and then centrifuged at 1200 r/min for
8min. After centrifugation the supernatant was discarded
and cells were washed in PBS twice. Add the precooling
70% ethanol to the tube and gently blow into single cell
suspension. Incubate them overnight at 4∘C. The next day,
they were centrifuged at 1200 r/min for 8 min to collect cells
and washed in PBS once. The cells were permeabilized with
0.25% Triton X-100 for 15min and washed in PBS twice. And
then cells were incubated in PBS containing the following
polyclonal antibodies, respectively: rabbit anti-collagen type
II (1 : 100), rabbit anti-collagen type I (1 : 100), rabbit antiaggrecan
1 (1 : 100), rabbit anti-SOX9 (1 : 100), rabbit antivimentin
(1 : 100), and rabbit anti-FGFR3 (1 : 100) over night at
4∘C. Next day, they were washed in PBS twice and incubated in PBS containing IgG. Finally, theywerewashed in PBS twice and subjected to single channel fluorescently activated cell
sorting (FACS) analysis.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

เซลล์ต้น กำเนิด/progenitor กระดูกอ่อนได้ตรวจนับ และรวบรวม (ข้อ 7) ในระยะลอการิทึมด้วยวิธีทั่วไป มีการถ่ายโอน 1 – 5 × 105 เซลล์/ท่อเป็นท่อไหล และ centrifuged แล้ว ที่ r 1200/นาที สำหรับ8 นาที หลังจาก centrifugation supernatant ถูกละทิ้งและเซลล์ถูกล้างใน PBS ครั้ง เพิ่มที่ precoolingเอทานอล 70% หลอดและค่อย ๆ เป่าลงในเซลล์เดียวระบบกันสะเทือน ฟักนั้นค้างคืนที่ 4∘C ในวันถัดไปพวกเขาถูก centrifuged ที่ 8 นาทีเก็บเซลล์ r 1200/minและหินใน PBS ครั้ง เซลล์มี permeabilized ด้วย0.25% 100 X ไตรตั้นสำหรับ 15 นาทีและหินใน PBS ครั้ง และแล้ว เซลล์ถูก incubated ใน PBS ประกอบด้วยดังนี้แอนตี้ polyclonal ลำดับ: กระต่ายชนิดคอลลาเจนต่อต้านชนิด II (1:100), คอลลาเจนป้องกันกระต่ายฉัน (1:100), antiaggrecan กระต่าย1 (1:100), กระต่ายป้องกัน-SOX9 (1:100), antivimentin กระต่าย(1:100), และกระต่ายป้องกัน-FGFR3 (1:100) ผ่านคืนที่4∘C วันถัดไป ที่พวกเขาถูกล้างใน PBS สอง และ incubated ใน PBS ประกอบด้วย IgG สุดท้าย theywerewashed สอง PBS และช่องการเดียว fluorescently เรียกใช้เซลล์เรียงลำดับวิเคราะห์ (FACS)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

กระดูกอ่อนก้าน /
เซลล์ต้นกำเนิดได้รับการนับและรวบรวม(ทาง 7)
ในขั้นตอนการลอการิทึมด้วยวิธีการทั่วไป 1-5 × 105 เซลล์ /
ท่อถูกย้ายลงในหลอดการไหลและหมุนเหวี่ยงแล้วที่1200 รอบ / นาทีสำหรับ
8min
หลังจากการหมุนเหวี่ยงใสที่ถูกทิ้งและเซลล์ถูกล้างในพีบีเอสเป็นครั้งที่สอง เพิ่มลดอุณหภูมิเอทานอล 70% ถึงหลอดและเบา ๆ พัดเข้ามาในเซลล์เดียวระงับ ฟักพวกเขาค้างคืนที่4∘C วันรุ่งขึ้นพวกเขาจะถูกหมุนเหวี่ยงที่ 1,200 รอบ / นาทีเป็นเวลา 8 นาทีในการเก็บรวบรวมเซลล์และล้างในครั้งเดียวพีบีเอส เซลล์ที่ถูก permeabilized กับ0.25% Triton X-100 สำหรับ 15 นาทีและล้างในพีบีเอสเป็นครั้งที่สอง และจากนั้นเซลล์ถูกบ่มในพีบีเอสที่มีดังต่อไปนี้แอนติบอดีโพลีตามลำดับ: กระต่ายประเภทต่อต้านคอลลาเจนที่สอง (1: 100) กระต่ายประเภทต่อต้านคอลลาเจนที่ฉัน (1: 100) กระต่าย antiaggrecan 1 (1: 100) กระต่ายป้องกัน -SOX9 (1: 100) antivimentin กระต่าย(1: 100) และกระต่ายต่อต้าน FGFR3 (1: 100) ข้ามคืนที่4∘C วันรุ่งขึ้นพวกเขาจะถูกล้างในพีบีเอสเป็นครั้งที่สองและบ่มในพีบีเอสที่มี IgG สุดท้าย theywerewashed พีบีเอสในครั้งที่สองและเป็นไปช่องทางเดียว fluorescently เปิดใช้งานเซลล์เรียงลำดับ(FACS) การวิเคราะห์

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

กระดูกอ่อนก้าน / เซลล์ต้นกำเนิดถูก
นับและเก็บ ( หัวข้อ 7 ) ลอการิทึมเฟสกับ
ตามปกติ 1 – 5 × 105 เซลล์ / ท่อโอน
ในหลอดการไหลและระดับ 1200 r / min สำหรับ
8min หลังจากปั่นที่น่านถูกทิ้งและถูกล้างในเซลล์
PBS สองครั้ง เพิ่มความ
70% เอธานอลต่อหลอด และค่อย ๆพัดเข้าสู่เซลล์แขวนลอย
โสดบ่มเพาะพวกเขาค้างคืนที่ 4 ∘ C . วันถัดไป ,
พวกเขาระดับ 1200 r / min 8 นาทีเพื่อเก็บเซลล์
และล้างใน PBS ครั้ง เซลล์ก็ permeabilized กับ
0.25 % Triton X-100 สำหรับ 15 นาที และล้างด้วย pbs สองครั้ง และ
แล้วเซลล์ก็บ่มใน PBS ที่มีดังต่อไปนี้
ใช้แอนติบอดี ตามลำดับ : กระต่ายป้องกันคอลลาเจนชนิด
2 ( 1 : 100 ) , กระต่ายป้องกันคอลลาเจนชนิด I ( 1100 ) , กระต่าย antiaggrecan
1 ( 1 : 100 ) , กระต่าย anti-sox9 ( 1 : 100 ) , กระต่าย antivimentin
( 1 : 100 ) และกระต่าย anti-fgfr3 ( 1 : 100 ) ผ่านคืนที่∘ C
4 วันต่อมา พวกเขาล้างใน PBS สองครั้งและบ่มใน PBS ประกอบด้วย IgG . ในที่สุด theywerewashed ใน PBS สองครั้ง และต้องเปิดช่อง fluorescently เซลล์เรียงเดี่ยว ( facs

) การวิเคราะห์