Multiplex-PCR for simultaneous dete

Multiplex-PCR for simultaneous detection of 3
bacterial fish pathogens, Flavobacterium columnare,
Edwardsiella ictaluri, and Aeromonas hydrophila
Victor S. Panangala1,*, Craig A. Shoemaker1, Vicky L. van Santen2, Kevin Dybvig3,
Phillip H. Klesius1
1Aquatic Animal Health Research Unit, US Department of Agriculture, Agricultural Research Service,
Aquatic Animal Health Research Unit, PO Box 952, Auburn, Alabama 36831-0952, USA
2Department of Pathobiology, College of Veterinary Medicine, Auburn University, Auburn, Alabama 36830, USA
3Department of Genetics, University of Alabama at Birmingham, Birmingham, Alabama 35294, USA
ABSTRACT: A multiplex PCR (m-PCR) method was developed for simultaneous detection of 3 important
fish pathogens in warm water aquaculture. The m-PCR to amplify target DNA fragments from
Flavobacterium columnare (504 bp), Edwardsiella ictaluri (407 bp) and Aeromonas hydrophila (209
bp) was optimized by adjustment of reaction buffers and a touchdown protocol. The lower detection
limit for each of the 3 bacteria was 20 pg of nucleic acid template from each bacteria per m-PCR reaction
mixture. The sensitivity threshold for detection of the 3 bacteria in tissues ranged between 3.4 ×
102 and 2.5 × 105 cells g–1 of tissue (channel catfish Ictalurus punctatus Rafinesque). The diagnostic
sensitivity and specificity of the m-PCR was evaluated with 10 representative isolates of each of the
3 bacteria and 11 other Gram-negative and 2 Gram-positive bacteria that are taxonomically related
or ubiquitous in the aquatic environment. Except for a single species (A. salmonicida subsp. salmonicida),
each set of primers specifically amplified the target DNA of the cognate species of bacteria.
m-PCR was compared with bacteriological culture for identification of bacteria in experimentally
infected fish. The m-PCR appears promising for the rapid, sensitive and simultaneous detection of
Flavobacterium columnare, E. ictaluri and A. hydrophila in infected fish compared to the timeconsuming
traditional bacteriological culture techniques.
KEY WORDS: Multiplex-PCR · Fish · Edwardsiella · Flavobacterium · Aeromonas
Resale or republication not permitted without written consent of the publisher
Dis Aquat Org 74: 199–208, 2007
most important bacterial diseases affecting the aquaculture
industry in the USA (United States Department
of Agriculture 2003). The prevalence and impact of
septicemic disease in fish caused by Aeromonas
hydrophila (referred to as motile aeromonad septicemia,
MSA), is less known. However, A. hydrophila
is ubiquitous in aquatic ecosystems (Holmes et al.
1996) and recent studies have shown that catfish
latently infected with A. hydrophila (carriers) could
shed the organism when co-infected with Edwardsiella
ictaluri (Nusbaum & Morrison 2002). Since all 3 species
of bacteria (Flavobacterium columnare, E. ictaluri, and
A. hydrophila) are ubiquitous in the aquatic environment
and fish are reared in extensive pond acreages
with high stocking densities (20 000 to 30 000 fish ha–1),
the occurrence of coinfections or multiple infections in
the same host should not be overlooked (Jack et al.
1992). Traditional methods of diagnosing bacterial
infections using culture techniques require several
days to arrive at a definitive diagnosis, resulting in
delayed implementation of control measures and
increased potential for spreading of disease. Because
PCR can target unique genetic sequences of microorganisms,
PCR-based nucleic acid amplification techniques
have gained recognition as rapid, sensitive, and
specific methods for detection of disease-causing
pathogens in various aquaculture species (Vantarakis
et al. 2000, Del Cero et al. 2002, Bader et al. 2003,
Bilodeau et al. 2003). When multiple bacterial
pathogens are likely to occur, as in the aquatic environment,
amplification of multiple target genes in a
single reaction mixture is possible with the multiplex
PCR (m-PCR) method (Brasher et al. 1998, Del Cero et
al. 2002, Panicker et al. 2004), thus reducing cost, time
and effort without compromising the test utility. In this
study, we developed an m-PCR method for simultaneous
identification of F. columnare, E. ictaluri, and
A. hydrophila, 3 of the most important bacterial
pathogens causing extensive losses in the channel catfish
aquaculture industry.
MATERIALS AND METHODS
Bacteria isolates and culture conditions. The bacterial
isolates used in this study are listed in Table 1. The
majority of the fish-pathogenic bacteria were originally
isolated from diseased fish, characterized into
their respective genera and species using standard
methods (Arias et al. 2004, Panangala et al. 2005), and
maintained in the archived culture repository of the
Aquatic Animal Health Research Unit, Auburn,
Alabama, USA. Additional cultures were kindly provided
by John M. Grizzle (Department of Fisheries and
Allied Aquaculture, Auburn University, Alabama,
USA), Andrew E. Goodwin (Department of Aquaculture/
Fisheries, University of Arkansas, Pine Bluff,
Arkansas, USA) and Ronald D. Schultz (Department of
Pathobiology, University of Wisconsin, Madison, Wisconsin,
USA). The bacterial isolates were cultured
directly from glycerol stocks on brain heart infusion
agar or blood agar plates (tryptic soy agar with 5% v/v
defibrinated sheep blood: Difco) for Edwardsiella
ictaluri and Aeromonas hydrophila, and Shieh agar
(Shieh 1980) for Flavobacterium columnare. Single
colonies picked after incubation for 36 h were transferred
to 10 ml brain heart infusion broth and cultured
to log-phase growth at 28°C in a shaker water bath.
For isolation of bacteria from tissues of experimentally
infected fish, Shieh medium modified by replacing
peptone with tryptone (Difco) was used for selective
isolation of F. columnare. For isolation of E. ictaluri,
Shotts selective medium (Shotts & Waltman 1990) was
used, and for isolation of A. hydrophila, blood agar
plates were used. Results were recorded after 24 to
48 h of incubation at 28°C. Isolates were distinguished
as F. columnare, E. ictaluri and A. hydrophila on the
basis of their morphological appearance on selective
media and Gram-stain characteristics. Select isolates
were characterized biochemically to species level
using API 20E test strips (bioMerieux) and additional
biochemical tests (when necessary) according to established
criteria (Decostere et al. 1998, Altwegg 1999,
Farmer 2003). Occasionally, contaminating organisms
were also isolated on culture media, but these organisms
were readily distinguished from F. columnare,
E. ictaluri and A. hydrophila on the basis of morphological
and biochemical characteristics.
Infection of fish and sample collection. Fingerling
(~12 to 14 g) channel catfish Ictalurus punctatus
Rafinesque, National Warmwater Aquaculture Center
Strain 103, obtained from disease-free stock reared at
the Aquatic Animal Health Research Unit, were used
for experimental infection. The fish were maintained in
58 l glass aquaria with flow-through dechlorinated tap
water, constant aeration, a water temperature of 26 ±
2°C and a 12:12 h light:dark photoperiod. A commercial
diet (Aquamax Grower 400 Brentwood) was fed
daily to satiation. Initially, fish were randomized into 3
groups, with 7 fish per group. Fish in Group 1 were
injected intraperitoneally with 0.1 ml of a log-phase
broth culture of Flavobacterium columnare ARS-1,
containing ~1 × 105 CFU ml–1, Group 2 fish were similarly
injected with Edwardsiella ictaluri (American
Type Culture Collection: ATCC-33202), and Group 3
fish were injected with ~102 CFU ml–1 of Aeromonas
hydrophila K106K. Subsequently, 3 other groups of 7
fish per group (Groups 4 to 6) were injected with a
combination of the organisms to simulate mixed infections
as follows: Group 4, F. columnare + E. ictaluri
200
Panangala et al.: Multiplex-PCR for detection of 3 fish pathogens
(~1.3 × 105 CFU ml–1 of each organism); Group 5, E.
ictaluri + A. hydrophila (~ 1.4 × 105 CFU ml–1 of each
organism); Group 6, F. columnare + E. ictaluri + A.
hydrophila (~1 × 105 CFU ml–1 of each organism). An
uninfected group (Group 7) of 7 fish were maintained
as controls. Fish were monitored following infection
and dead or moribund fish were promptly removed for
sample collection. Blood was collected into 1 ml hypodermic
syringes by direct cardiac puncture, and the
kidney and gill tissues were surgically removed.
Duplicate sample sets were collected to provide for
nucleic acid extraction and for bacteriological culture.
In addition to samples from infected fish, tissues (gills,
kidney and blood) obtained from euthanized (using
200 mg l–1 tricaine methanesulfonate; Western Chemical)
naïve fish were spiked with F. columnare, E.
201
Species Isolate Source Origin
Edwardsiella ictaluri ATCC-33202 Channel catfish Ictalurus punctatus Rafinesque ATCC
E. ictaluri AL-93-75 Channel catfish Alabama
E. ictaluri ALG-03-58 Channel catfish Alabama
E. ictaluri ALG-03-161 Channel catfish Alabama
E. ictaluri 013-S99-1908 Channel catfish Mississippi
E. ictaluri 016-S99-1911 Channel catfish Mississippi
E. ictaluri 017-S99-1914 Channel catfish Mississippi
E. ictaluri 003-S99-1760 Channel catfish Mississippi
E. ictaluri IA-30-NJ#1 Tadpole madtom Noturus gyrinus Mitchell New Jersey
E. ictaluri EILO Walking catfish Clarius batrachus L. Thailand
Flavobacterium columnare ATCC-23463 Chinook salmon Oncorhynchus tshawytscha Walbaum ATCC
F. columnare ARS-1 Channel catfish Alabama
F. columnare ALG-00-530 Channel catfish Alabama
F. columnare ALG-00-522 Channel catfish Alabama
F. columnare ALG-02-036 Largemouth bass Micropterus salmoides Lacepede Alabama
F. columnare BioMed Channel catfish Alabama
F. columnare HS Channel catfish Alabama
F. columnare LSU Channel catfish Louisiana
F. columnare MS-02-463 Channel catfish Mississippi
F. columnare IR Common carp Cyprinus carpio L. Israel
Aeromonas hydrophila CECT-839 Milk CECT
A. hydrophila CIB Channel catfish Alabama
A. hydrophila K106K Channel catfish Alabama
A. hydrophila

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ล็ก-PCR ตรวจพร้อมกัน 3โรคปลาแบคทีเรีย Flavobacterium columnareEdwardsiella ictaluri และ Aeromonas hydrophilaวิคเตอร์ S. Panangala1, *, เคร็ก A. Shoemaker1, Vicky L. van Santen2, Kevin Dybvig3ฟิลลิป H. Klesius11Aquatic สัตว์วิจัยหน่วย สหรัฐอเมริกากรมวิชาการเกษตร บริการวิจัยเกษตรหน่วยวิจัยสุขภาพสัตว์น้ำ PO Box 952 ออเบิร์น อลาบามา 36831-0952 สหรัฐอเมริกา2Department Pathobiology วิทยาลัยสัตวแพทยศาสตร์ มหาวิทยาลัยออเบิร์น ออเบิร์น อลาบามา 36830 สหรัฐอเมริกา3Department พันธุศาสตร์ มหาวิทยาลัยของอลาบามาที่เบอร์มิงแฮม เบอร์มิงแฮม อลาบามา 35294 สหรัฐอเมริกาบทคัดย่อ: วิธี multiplex PCR (m-PCR) ได้รับการพัฒนาพร้อมตรวจ 3 สำคัญโรคปลาในตู้เพาะเลี้ยงสัตว์น้ำ M-PCR ดีเอ็นเอเป้าหมายขยายชิ้นส่วนจากFlavobacterium columnare (504 bp), Edwardsiella ictaluri (407 bp) และ Aeromonas hydrophila (209bp) ถูกปรับให้เหมาะสม โดยการปรับปรุงบัฟเฟอร์ปฏิกิริยาและโพรโทคอเหรียญ การตรวจพบต่ำกว่าวงเงินสำหรับแต่ละของแบคทีเรีย 3 มี pg 20 ของแม่ละแบคทีเรียต่อปฏิกิริยา m PCR กรดนิวคลีอิกส่วนผสมของ ขีดจำกัดความไวสำหรับตรวจหาแบคทีเรีย 3 ในเนื้อเยื่อที่อยู่ในช่วงระหว่าง 3.4 ×102 และ 2.5 × 105 เซลล์ g – 1 ของเนื้อเยื่อ (อเมริกัน Ictalurus punctatus Rafinesque) วิเคราะห์การเชื่อมต่อความไวและ specificity m-PCR ถูกประเมินกับ 10 พนักงานแยกของแต่ละ3 แบคทีเรียและ 11 อื่น ๆ แบคทีเรียแกรมลบ และ 2 แบคทีเรียที่เกี่ยวข้อง taxonomicallyหรือในสภาพแวดล้อมทางน้ำ ยกเว้นในสายพันธุ์เดียว (A. salmonicida salmonicida ถั่ว),แต่ละชุดของไพรเมอร์โดยเฉพาะขยายเป้าหมายดีเอ็นเอของแบคทีเรียชนิด cognatem-PCR ถูกเปรียบเทียบกับวัฒนธรรม bacteriological สำหรับรหัสของแบคทีเรียใน experimentallyปลาที่ติดเชื้อ M-PCR ปรากฏสัญญาสำหรับการอย่างรวดเร็ว มีความละเอียดอ่อน และเกิดตรวจพบFlavobacterium columnare, E. ictaluri และ A. hydrophila ในปลาติดเชื้อเปรียบเทียบกับ timeconsumingวัฒนธรรม bacteriological เทคนิคคำสำคัญ: PCR ล็ก· ปลาลอก Edwardsiella · Flavobacterium · Aeromonasขายหรือ republication ที่ไม่ได้รับอนุญาตโดยไม่ได้รับความยินยอมเป็นลายลักษณ์อักษรของผู้เผยแพร่Dis Aquat องค์กร 74:199 – 208, 2007โรคแบคทีเรียสำคัญที่ส่งผลกระทบต่อการเพาะเลี้ยงสัตว์น้ำอุตสาหกรรมในสหรัฐอเมริกา (สหรัฐอเมริกากรมของเกษตร 2003) ชุกและผลกระทบของโรคในปลาที่เกิดจาก Aeromonas septicemichydrophila (เรียกว่า motile aeromonad บริการน้อยคือรู้จัก MSA), อย่างไรก็ตาม A. hydrophilaอยู่ในระบบนิเวศทางน้ำ (โฮลมส์ et alปี 1996) และการศึกษาล่าสุดแสดงให้เห็นว่าlatently ติดกับ A. hydrophila (สาย) ได้ผลัดที่มีชีวิตเมื่อติดเชื้อ Edwardsiella ร่วมictaluri (Nusbaum & 2002 มอร์ริสัน) ตั้งแต่ 3 ชนิดทั้งหมดของแบคทีเรีย (Flavobacterium columnare, E. ictaluri และA. hydrophila) อยู่ในสภาพแวดล้อมทางน้ำและมีผลิตภัณฑ์ปลาในบ่อมากมาย acreagesมีมิติสูงความหนาแน่น (20 000-30 000 ปลาฮา – 1),การเกิดขึ้นของ coinfections หรือการติดเชื้อในหลายโฮสต์เดียวกันไม่ควรมองข้าม (แจ็ค et al1992) การวินิจฉัยแบคทีเรียวิธีแบบดั้งเดิมการติดเชื้อโดยใช้เทคนิควัฒนธรรมต้องหลายวันมาตรวจวินิจฉัยทั่วไป ในดำเนินการตามมาตรการควบคุมการล่าช้า และมีศักยภาพที่เพิ่มขึ้นสำหรับการแพร่กระจายของโรค เนื่องจากPCR สามารถกำหนดเป้าหมายเฉพาะลำดับพันธุกรรมของจุลินทรีย์เทคนิคการขยายผลกรดนิวคลีอิกได้รับการจำแนกเป็นอย่างรวดเร็ว ละเอียดอ่อน และวิธีการเฉพาะสำหรับการตรวจหาสาเหตุของโรคโรคในสัตว์น้ำหลายชนิด (Vantarakisร้อยเอ็ด al. 2000, Del Cero et al. 2002, Bader et al. 2003Bilodeau et al. 2003) เมื่อแบคทีเรียหลายโรคมักจะเกิดขึ้น ในสิ่งแวดล้อมน้ำขยายหลายยีนเป้าหมายในการส่วนผสมปฏิกิริยาเดียวได้ ด้วยการล็กวิธี PCR (m-PCR) (Brasher et al. 1998, Del Cero ร้อยเอ็ดal. 2002, Panicker et al. 2004), ช่วยลดต้นทุน เวลาและความพยายามโดยไม่สูญเสียอรรถประโยชน์การทดสอบ ในที่นี้ศึกษา เราพัฒนาวิธีการ m PCR พร้อมกันรหัสของ F. columnare, E. ictaluri และA. hydrophila, 3 แบคทีเรียสำคัญที่สุดโรคที่ก่อให้เกิดความสูญเสียมากมายในปลาช่องอุตสาหกรรมสัตว์น้ำวัสดุและวิธีการแบคทีเรียที่แยกได้และสภาพวัฒนธรรม แบคทีเรียแยกใช้ในการศึกษานี้ได้แสดงในตารางที่ 1 ที่ส่วนใหญ่แบคทีเรียปลา pathogenic ก็แยกต่างหากจากปลาเส้น ลักษณะเป็นสกุลที่เกี่ยวข้องและใช้มาตรฐานสายพันธุ์ของพวกเขาวิธีการ (Arias et al. 2004, Panangala et al. 2005), และรักษาในเก็บถาวรวัฒนธรรมของการหน่วยวิจัยสุขภาพสัตว์น้ำ ออเบิร์นอลาบามา สหรัฐอเมริกา เพิ่มเติมวัฒนธรรมได้กรุณาโดยจอห์นม. Grizzle (กรมประมง และสัตว์น้ำฝ่ายสัมพันธมิตร มหาวิทยาลัยออเบิร์น อลาบามาสหรัฐอเมริกา), แอนดรูว์ E. Goodwin (ภาควิชาเพาะเลี้ยงสัตว์น้ำ /ประมง มหาวิทยาลัยอาร์คันซอ สน Bluffรัฐอาร์คันซอ สหรัฐอเมริกา) และโรนัลด์ D. Schultz (ภาควิชาPathobiology มหาวิทยาลัยวิสคอนซิน เมดิสัน วิสคอนซินสหรัฐอเมริกา) แยกเชื้อแบคทีเรียได้อ่างโดยตรงจากกลีเซอรหุ้นบนคอนกรีตหัวใจสมองแผ่น agar หรือเลือด agar (agar tryptic ถั่วเหลือง 5% v/vdefibrinated แกะเลือด: Difco) สำหรับ Edwardsiellaictaluri และ Aeromonas hydrophila และ Shieh agar(Shieh 1980) สำหรับความ Flavobacterium columnare เดี่ยวมีการถ่ายโอนอาณานิคมเบิกหลังจากฟักตัวใน 36 h10 ml สมองหัวใจคอนกรีตซุป และอ่างการเจริญเติบโตขั้นตอนการบันทึกที่ 28° C ในน้ำน้ำเชคเกอร์การแยกแบคทีเรียจากเนื้อเยื่อของ experimentallyปลาติดเชื้อ กลาง Shieh โดยแทนpeptone มี tryptone (Difco) ใช้สำหรับงานแยกของ F. columnare สำหรับแยกของ E. ictaluriShotts ถูกเลือกปานกลาง (Shotts & Waltman 1990)ใช้ และ การแยกของ A. hydrophila เลือด agarแผ่นใช้ บันทึกผลหลังจาก 24 ไปh 48 ของบ่มที่ 28 องศาเซลเซียส แยกแตกต่างF. columnare, E. ictaluri และ A. hydrophila ในการพื้นฐานของลักษณะสัณฐานที่ปรากฏในงานสื่อและลักษณะคราบกรัม เลือกแยกมีลักษณะ biochemically ระดับพันธุ์ใช้ API 20E แถบทดสอบ (bioMerieux) และเพิ่มเติมชีวเคมีทดสอบ (เมื่อจำเป็น) ตามกำหนดเงื่อนไข (Decostere et al. ปี 1998, Altwegg 1999ชาวนา 2003) บางครั้ง ขยะสิ่งมีชีวิตแนะนำสื่อวัฒนธรรมแยกบน แต่สิ่งมีชีวิตเหล่านี้มีความพร้อมที่แตกต่างจากเอฟ columnareE. ictaluri และ A. hydrophila ตามสัณฐานและลักษณะเชิงชีวเคมีการติดเชื้อของปลาและตัวอย่างชุด Fingerling(~ 12-14 กรัม) อเมริกัน Ictalurus punctatusRafinesque, Warmwater ศูนย์เพาะเลี้ยงสัตว์น้ำต้องใช้ 103 ได้รับจากหลักทรัพย์ปราศจากโรคผลิตภัณฑ์ที่ใช้น้ำสัตว์สุขภาพวิจัยหน่วยสำหรับทดลองการติดเชื้อ ปลาถูกจัดเก็บอยู่ในอควาเรียแก้ว 58 l มีกระแสผ่าน dechlorinated เคาะน้ำ aeration คง อุณหภูมิน้ำของ 26 ±2° C และ 12:12 ชั่วโมงไฟ h: มืด การพาณิชย์มีเลี้ยงอาหาร (Aquamax Grower 400 เบรนท์วูด)การ satiation ทุกวัน ตอนแรก ปลาถูก randomized ใน 3กลุ่ม ปลา 7 สำหรับแต่ละกลุ่ม ปลาในกลุ่มที่ 1 ได้ฉีด ด้วย 0.1 ml ของเฟสล็อก intraperitoneallyวัฒนธรรมซุป columnare Flavobacterium อาอาร์ส-1ประกอบด้วย ~ 1 × 105 CFU ml-1 กลุ่ม 2 ปลาได้ในทำนองเดียวกันฉีดกับ Edwardsiella ictaluri (อเมริกันคอลเลกชันชนิดวัฒนธรรม: ATCC 33202), และกลุ่ม 3ปลาที่ถูกฉีด ด้วย ~ 102 CFU ml – 1 ของ Aeromonashydrophila K106K ในเวลาต่อมา 3 กลุ่มอื่น ๆ 7ปลาสำหรับแต่ละกลุ่ม (กลุ่ม 4-6) ถูกฉีดด้วยการชุดของสิ่งมีชีวิตเพื่อจำลองเชื้อผสมดังนี้: กลุ่ม 4, F. columnare + E. ictaluri200Panangala et al.: ล็ก-PCR ตรวจโรคปลา 3(~1.3 × 105 CFU ml – 1 ของแต่ละสิ่งมีชีวิต); กลุ่ม 5 อีictaluri + A. hydrophila (~ 1.4 × 105 CFU ml – 1 ของแต่ละสิ่งมีชีวิต); กลุ่ม 6, F. columnare E. ictaluri + อ.hydrophila (~ 1 × 105 CFU ml – 1 ของแต่ละสิ่งมีชีวิต) มีมีรักษาเชื้อกลุ่ม (กลุ่ม 7) ปลา 7เป็นการควบคุม ปลาได้ติดตามตามติดและปลาตาย หรือ moribund ถูกลบออกในทันทีเก็บตัวอย่าง เลือดที่เก็บเป็นเข็มฉีดยา 1 mlเข็มฉีดยา โดยตรงเจาะหัวใจ และเนื้อเยื่อไตและเหงือกถูกผ่าตัดเอาออกชุดตัวอย่างซ้ำถูกรวบรวมเพื่อให้การสกัดกรดนิวคลีอิก และวัฒนธรรม bacteriologicalนอกจากตัวอย่างจากปลาติดเชื้อ เนื้อเยื่อ (gillsไตและเลือด) ที่ได้รับจาก euthanized (ใช้200 mg l-1 tricaine methanesulfonate ตะวันตกเคมี)ปลาขำน่ามี spiked กับ F. columnare, E.201ชนิดแยกแหล่งกำเนิดEdwardsiella ictaluri ATCC 33202 อเมริกัน Ictalurus punctatus Rafinesque ATCCE. ictaluri อัล-93-75 อเมริกันอลาบามาE. ictaluri ALG-03-58 อเมริกันอลาบามาE. ictaluri ALG-03-161 อเมริกันอลาบามาE. ictaluri 013-S99-1908 อเมริกันมิสซิสซิปปีE. ictaluri 016-S99-1911 อเมริกันมิสซิสซิปปีE. ictaluri 017-S99-1914 อเมริกันมิสซิสซิปปีE. ictaluri 003-S99-1760 อเมริกันมิสซิสซิปปีE. ictaluri IA-30-NJ #1 ลูกอ๊อด madtom Noturus gyrinus Mitchell นิวเจอร์ซี่E. ictaluri เดิน EILO ปลาดุกด้าน Clarius L. ไทยFlavobacterium columnare สกุล ATCC 23463 Chinook แซลมอนปลาแซลมอนแปซิฟิก tshawytscha Walbaum ATCCF. columnare อาอาร์ส 1 อเมริกันอลาบามาF. columnare ALG-00-530 อเมริกันอลาบามาF. columnare ALG-00-522 อเมริกันอลาบามาF. columnare salmoides Micropterus เบส ALG-02-036 Largemouth Lacepede อลาบามาF. columnare BioMed อเมริกันอลาบามาF. columnare HS อเมริกันอลาบามาF. columnare ชุดปั๊มหมึกอเมริกันหลุยเซียน่าF. columnare MS 02 463 อเมริกันมิสซิสซิปปีF. columnare ทั่วไป IR ปลาคาร์ฟปลาไน L. อิสราเอลAeromonas hydrophila CECT นม CECT-839A. hydrophila CIB อเมริกันอลาบามาA. hydrophila K106K อเมริกันอลาบามาA. hydrophila

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

Multiplex-PCR ในการตรวจหาพร้อมกันของ 3
เชื้อโรคปลาแบคทีเรีย Flavobacterium columnare,
Edwardsiella ictaluri และ Aeromonas hydrophila
วิคเตอร์เอส Panangala1 * เครกเอ Shoemaker1 วิกกี้ลิตรรถตู้ Santen2 เควิน Dybvig3,
ฟิลลิปเอช Klesius1
1Aquatic วิจัยด้านสุขภาพสัตว์ หน่วยสหรัฐอเมริกากรมวิชาการเกษตร, บริการวิจัยการเกษตร,
น้ำสุขภาพสัตว์หน่วยวิจัย, PO Box 952, ออเบิร์น, อลาบา 36831-0952 สหรัฐอเมริกา
2 ภาควิชาพยาธิชีววิทยาวิทยาลัยสัตวแพทยศาสตร์มหาวิทยาลัย Auburn ออเบิร์น, อลาบามา 36830, USA
3Department พันธุศาสตร์ มหาวิทยาลัยอลาบามาที่เบอร์มิงแฮม, เบอร์มิงแฮม, อลาบามา 35294, USA
บทคัดย่อ: การ multiplex PCR (m-PCR) วิธีการได้รับการพัฒนาสำหรับการตรวจสอบพร้อมกันของ 3
สิ่งสำคัญที่ก่อโรคในปลาเพาะเลี้ยงสัตว์น้ำอุ่น M-PCR เพื่อขยายดีเอ็นเอเป้าหมายจาก
Flavobacterium columnare (504 bp) Edwardsiella ictaluri (407 bp) และเชื้อ Aeromonas hydrophila (209
bp) ถูกปรับให้เหมาะสมโดยการปรับตัวของบัฟเฟอร์ปฏิกิริยาและโปรโตคอลทัชดาวน์ การตรวจจับที่ต่ำกว่าขีด จำกัด สำหรับแต่ละ 3 แบคทีเรีย 20 หน้าแม่แบบกรดนิวคลีแบคทีเรียจากแต่ละต่อม-PCR ปฏิกิริยาส่วนผสม เกณฑ์ความไวในการตรวจหาเชื้อแบคทีเรียที่ 3 ในเนื้อเยื่ออยู่ระหว่าง 3.4 × 102 และ 2.5 × 105 กรัมเซลล์-1 ของเนื้อเยื่อ (ช่องปลาดุก Ictalurus punctatus Rafinesque) วินิจฉัยความไวและความจำเพาะของ M-PCR ถูกประเมิน 10 แยกเป็นตัวแทนของแต่ละ 3 แบคทีเรียและอื่น ๆ 11 แกรมลบและ 2 แบคทีเรียแกรมบวกที่มี taxonomically ที่เกี่ยวข้องหรือที่แพร่หลายในสิ่งแวดล้อมทางน้ำ ยกเว้นสายพันธุ์เดียว (เอ salmonicida subsp. salmonicida) ชุดของไพรเมอร์แต่ละขยายเฉพาะดีเอ็นเอเป้าหมายของสายพันธุ์ของเชื้อแบคทีเรียที่คล้ายคลึงกัน. ม-PCR เมื่อเทียบกับวัฒนธรรมแบคทีเรียเพื่อระบุตัวตนของแบคทีเรียในการทดลองปลาที่ติดเชื้อ M-PCR ปรากฏมีแนวโน้มอย่างรวดเร็วสำหรับการตรวจสอบที่สำคัญและพร้อมกันของFlavobacterium columnare อี ictaluri และ A. hydrophila ในปลาที่ติดเชื้อเมื่อเทียบกับ timeconsuming วัฒนธรรมแบบดั้งเดิมแบคทีเรียเทคนิค. คำสำคัญ: Multiplex-PCR ·ปลา· Edwardsiella ·· Flavobacterium Aeromonas ขายหรือเผยแพร่โดยไม่ได้รับอนุญาตไม่ได้รับความยินยอมเป็นลายลักษณ์อักษรจากสำนักพิมพ์Dis Aquat องค์กร 74: 199-208 2007 โรคแบคทีเรียที่สำคัญที่สุดที่มีผลต่อการเพาะเลี้ยงสัตว์น้ำอุตสาหกรรมในประเทศสหรัฐอเมริกา (United States กรมวิชาการเกษตร2003) ความชุกและผลกระทบของโรค septicemic ในปลาที่เกิดจากเชื้อ Aeromonas hydrophila (เรียกว่าภาวะโลหิตเป็นพิษเคลื่อนที่ aeromonad, MSA) เป็นที่รู้จักกันน้อย อย่างไรก็ตาม A. hydrophila เป็นที่แพร่หลายในระบบนิเวศทางน้ำ (โฮล์มส์ et al. 1996) และการศึกษาที่ผ่านมาได้แสดงให้เห็นว่าปลาดุกlatently ติดเชื้อ A. hydrophila (ผู้ให้บริการ) จะหลั่งชีวิตเมื่อร่วมกับการติดเชื้อEdwardsiella ictaluri (Nusbaum และมอร์ริสัน 2002) . เนื่องจากทั้ง 3 สายพันธุ์ของเชื้อแบคทีเรีย(Flavobacterium columnare อี ictaluri และA. hydrophila) ที่แพร่หลายในสิ่งแวดล้อมทางน้ำและปลาที่เลี้ยงในบ่อacreages กว้างขวางที่มีความหนาแน่นสูง(20 000-30 000 ปลาฮ่า-1), การเกิดขึ้นของ coinfections หรือการติดเชื้อในหลายโฮสต์เดียวกันไม่ควรมองข้าม(แจ็ค et al. 1992) วิธีการแบบดั้งเดิมของการวินิจฉัยแบคทีเรียการติดเชื้อโดยใช้เทคนิคการเพาะเลี้ยงต้องใช้เวลาหลายวันในการประสบความสำเร็จในการวินิจฉัยที่ชัดเจนส่งผลให้การดำเนินงานล่าช้าของมาตรการการควบคุมและการเพิ่มขึ้นที่มีศักยภาพสำหรับการแพร่กระจายของโรค เพราะPCR สามารถกำหนดเป้าหมายลำดับพันธุกรรมที่เป็นเอกลักษณ์ของจุลินทรีย์PCR ที่ใช้เทคนิคการขยายกรดนิวคลีอิกได้รับการยอมรับเป็นอย่างรวดเร็วที่สำคัญและวิธีการเฉพาะในการตรวจหาโรคที่ก่อให้เกิดเชื้อโรคสายพันธุ์เพาะเลี้ยงสัตว์น้ำต่างๆ(Vantarakis et al. 2000 Del Cero et al, . 2002 Bader et al. 2003 Bilodeau et al. 2003) เมื่อเชื้อแบคทีเรียหลายเชื้อโรคมีแนวโน้มที่จะเกิดขึ้นในขณะที่สิ่งแวดล้อมทางน้ำ, การขยายของยีนเป้าหมายในหลายผสมปฏิกิริยาเดียวเป็นไปได้ด้วย multiplex PCR (m-PCR) วิธีการ (Brasher et al. 1998 เดล Cero et al. 2002 , Panicker et al. 2004) ซึ่งช่วยลดค่าใช้จ่ายเวลาและความพยายามโดยไม่สูญเสียยูทิลิตี้การทดสอบ ในการนี้การศึกษาเราพัฒนาวิธีการของ m-PCR สำหรับพร้อมกันบัตรประจำตัวของเอฟcolumnare อี ictaluri และเอ hydrophila 3 ของเชื้อแบคทีเรียที่สำคัญที่สุดเชื้อโรคที่ก่อให้เกิดความสูญเสียอย่างกว้างขวางในช่องปลาดุกอุตสาหกรรมการเพาะเลี้ยง. วัสดุและวิธีการแบคทีเรียที่แยกและเงื่อนไขวัฒนธรรม แบคทีเรียสายพันธุ์ที่ใช้ในการศึกษาครั้งนี้มีการระบุไว้ในตารางที่ 1 ส่วนใหญ่ของเชื้อแบคทีเรียที่ทำให้เกิดโรคปลาที่ได้รับเดิมที่แยกได้จากปลาที่เป็นโรคลักษณะเข้าไปในจำพวกของตนและสายพันธุ์โดยใช้มาตรฐานวิธีการ(Arias et al. 2004 Panangala et al. 2005 ) และเก็บรักษาไว้ในพื้นที่เก็บข้อมูลวัฒนธรรมเก็บของสุขภาพสัตว์น้ำหน่วยวิจัยออเบิร์น, อลาบามาประเทศสหรัฐอเมริกา วัฒนธรรมเพิ่มเติมได้ให้ความกรุณาโดยจอห์นเอ็มผมหงอก(กรมประมงและพันธมิตรเพาะเลี้ยงสัตว์น้ำ, มหาวิทยาลัยออเบิร์แอละแบมาสหรัฐอเมริกา), แอนดรูอีกูดวิน (ภาควิชาเพาะเลี้ยงสัตว์น้ำ / ประมงมหาวิทยาลัยอาร์คันซอไพน์บลัฟฟ์อาร์คันซอสหรัฐอเมริกา) และโรนัลด์ D. ชูลท์ซ (ภาควิชาพยาธิชีววิทยามหาวิทยาลัยวิสคอนซินเมดิสันวิสคอนซินสหรัฐอเมริกา) แบคทีเรียโดยการเพาะโดยตรงจากหุ้นกลีเซอรอลในยาหัวใจสมองวุ้นหรือแผ่นวุ้นเลือด(วุ้นถั่วเหลือง tryptic 5% ปริมาตร / ปริมาตรdefibrinated เลือดแกะ Difco) สำหรับ Edwardsiella ictaluri และเชื้อ Aeromonas hydrophila และ Shieh วุ้น(Shieh 1980) สำหรับ Flavobacterium columnare เดี่ยวอาณานิคมเลือกหลังจากบ่ม 36 ชั่วโมงมีการถ่ายโอนถึง10 มล. สมองน้ำซุปแช่หัวใจและเพาะเลี้ยงเพื่อการเจริญเติบโตเข้าสู่ระบบเฟสที่28 ° C ในอ่างน้ำปั่น. สำหรับการแยกเชื้อแบคทีเรียจากเนื้อเยื่อของการทดลองปลาติดเชื้อกลาง Shieh แก้ไขโดยการเปลี่ยน เปปโตนกับ tryptone (Difco) ที่ใช้สำหรับการเลือกแยกเอฟcolumnare สำหรับการแยกอี ictaluri, ช็อตขนาดกลางเลือก (ช็อตและ Waltman 1990) ถูกนำมาใช้และสำหรับการแยกhydrophila A. , วุ้นเลือดแผ่นถูกนำมาใช้ ผลที่ถูกบันทึกไว้หลังจากที่จะตลอด 24 48 ชั่วโมงของการบ่มที่ 28 องศาเซลเซียส แยกโดดเด่นเป็น columnare เอฟอี ictaluri และ A. hydrophila บนพื้นฐานของลักษณะทางสัณฐานวิทยาของพวกเขาในการเลือกสื่อและลักษณะแกรมคราบ เลือกสายพันธุ์มีลักษณะทางชีวเคมีระดับสายพันธุ์โดยใช้แถบทดสอบAPI 20E (bioMerieux) และเพิ่มเติมการทดสอบทางชีวเคมี(เมื่อจำเป็น) ตามที่จัดตั้งขึ้นตามเกณฑ์(Decostere et al. 1998 Altwegg ปี 1999 ชาวนา 2003) บางครั้งการปนเปื้อนสิ่งมีชีวิตที่แยกได้ยังอยู่ในอาหารเลี้ยงเชื้อแต่มีชีวิตเหล่านี้โดดเด่นได้อย่างง่ายดายจากเอฟcolumnare, อี ictaluri และ A. hydrophila บนพื้นฐานของก้านลักษณะและชีวเคมี. การติดเชื้อของปลาและเก็บตัวอย่าง ฟิงเกอร์(~ 12-14 กรัม) ปลาดุกช่อง Ictalurus punctatus Rafinesque แห่งชาติศูนย์ Warmwater เพาะเลี้ยงสัตว์น้ำสายพันธุ์103 ที่ได้รับจากหุ้นปลอดโรคเลี้ยงที่สุขภาพสัตว์น้ำหน่วยวิจัยถูกนำมาใช้สำหรับการติดเชื้อจากการทดลอง ปลาที่ได้รับการดูแลใน58 ลิตรตู้กระจกที่มีการไหลผ่านการแตะฆ่าเชื้อด้วยคลอรีนน้ำอากาศคงที่อุณหภูมิน้ำ26 ± 2 องศาเซลเซียสและแสงชั่วโมง 00:12: แสงที่มืด พาณิชย์อาหาร (AQUAmax ปลูก 400 เบรนท์) เป็นอาหารในชีวิตประจำวันที่จะเต็มอิ่ม ในขั้นต้นได้รับการสุ่มปลาออกเป็น 3 กลุ่มมี 7 ปลาต่อกลุ่ม ปลาในกลุ่มที่ 1 ได้รับการเข้าintraperitoneally 0.1 มิลลิลิตรขั้นตอนการเข้าสู่ระบบวัฒนธรรมน้ำซุปของFlavobacterium columnare ARS-1 ที่มี ~ 1 × 105 CFU ml-1, กลุ่มที่ 2 ปลาในทำนองเดียวกันฉีดEdwardsiella ictaluri (American ประเภทวัฒนธรรมการเก็บ: ATCC -33202) และกลุ่มที่ 3 ปลาฉีด ~ 102 CFU ml-1 ของเชื้อ Aeromonas hydrophila K106K ต่อมา 3 กลุ่มอื่น ๆ ของ 7 ปลาต่อกลุ่ม (กลุ่ม 4-6) ได้รับการฉีดที่มีการรวมกันของสิ่งมีชีวิตเพื่อจำลองการติดเชื้อผสมดังนี้กลุ่มที่4 เอฟ columnare + อี ictaluri 200 Panangala et al .: Multiplex-PCR ในการตรวจหาเชื้อโรคปลา 3 (~ 1.3 × 105 CFU ml-1 ของแต่ละชีวิต); กลุ่มที่ 5, อีictaluri + A. hydrophila (~ 1.4 × 105 CFU ml-1 ของแต่ละชีวิต); กลุ่มที่ 6 เอฟ columnare + อี ictaluri + A. hydrophila (~ 1 × 105 CFU ml-1 ของแต่ละสิ่งมีชีวิต) กลุ่มที่ไม่ติดเชื้อ (กลุ่ม 7) 7 ปลาได้รับการดูแลเป็นตัวควบคุม ปลาถูกตรวจสอบการติดเชื้อต่อไปและปลาตายหรือตายถูกถอดออกทันทีสำหรับการเก็บตัวอย่าง เลือดที่ถูกเก็บรวบรวมเป็น 1 มล. ฉีดยาเข็มฉีดยาโดยเจาะหัวใจโดยตรงและเนื้อเยื่อไตและเหงือกถูกผ่าตัดออก. ซ้ำชุดตัวอย่างที่ถูกเก็บรวบรวมเพื่อให้การสกัดกรดนิวคลีอิกและวัฒนธรรมแบคทีเรีย. นอกจากตัวอย่างจากปลาที่ติดเชื้อเนื้อเยื่อ (เหงือก , ไตและเลือด) ที่ได้รับจาก euthanized (ใช้200 mg l-1 tricaine methanesulfonate; เคมีตะวันตก) ปลาไร้เดียงสาถูกแทงด้วยเอฟ columnare อี201 สายพันธุ์แยกแหล่งกำเนิดEdwardsiella ictaluri ATCC 33202-ปลาดุกช่อง Ictalurus punctatus Rafinesque ATCC อี ictaluri AL-93-75 ช่องปลาดุกอลาบามาอี ictaluri ALG-03-58 ช่องปลาดุกอลาบามาอี ictaluri ALG-03-161 ปลาดุกอลาบามาทางช่องอี ictaluri 013-S99-1908 ปลาดุกช่องมิสซิสซิปปี้อี ictaluri 016-S99-1911 ปลาดุกช่องมิสซิสซิปปี้อี ictaluri 017-S99-1914 ปลาดุกช่องมิสซิสซิปปี้อี ictaluri 003-S99-1760 ปลาดุกช่องมิสซิสซิปปี้อี ictaluri IA-30 นิวเจอร์ซีย์ # 1 กบ madtom Noturus gyrinus นิวเจอร์ซีย์เซรั่มอี ictaluri EILO ปลาดุก Clarius batrachus ลิตรประเทศไทยFlavobacterium columnare ปลาแซลมอน-ATCC 23463 Chinook Oncorhynchus tshawytscha Walbaum ATCC เอฟ columnare ARS-1 ช่องปลาดุกอลาบาเอฟ columnare ALG-00-530 ช่องปลาดุกอลาบาเอฟ columnare ALG-00-522 ช่องปลาดุกอลาบาเอฟ columnare ALG-02-036 Largemouth เบส Micropterus salmoides Lacepede อลาบาเอฟ columnare BioMed ช่องปลาดุกอลาบาเอฟ columnare HS ช่องปลาดุกอลาบาเอฟ columnare LSU ช่องปลาดุกหลุยเซียเอฟ columnare MS-02-463 ปลาดุกช่องมิสซิสซิปปีเอฟ columnare IR ปลาคาร์พทั่วไป Cyprinus ไนแอลอิสราเอลAeromonas hydrophila CECT-839 นม CECT เอ hydrophila CIB ช่องปลาดุกอลาบามาเอ hydrophila K106K ช่องปลาดุกอลาบามาเอ hydrophila

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

เทคนิค multoplex PCR ในการตรวจหาเชื้อโรคแบคทีเรียพร้อมกัน 3
,
columnare ปลาฟลาโวแบคทีเรียม , edwardsiella ictaluri และ hydrophila
วิคเตอร์ เอส panangala1 , * , เคร็ก อ. shoemaker1 วิคกี้ แอลแวน santen2 เควิน dybvig3
.
1aquatic , ฟิลลิป klesius1 สัตว์วิจัยสุขภาพหน่วยเรากรมวิชาการเกษตร บริการวิจัยเกษตร
หน่วยวิจัย สุขภาพสัตว์น้ำ , PO กล่อง 952 ,ออเบิร์น , อลาบาม่า 36831-0952 USA
ภาควิชาพยาธิวิทยา คณะสัตวแพทย์ มหาวิทยาลัย Auburn ออเบิร์น , อลาบาม่า 36830 USA
3department พันธุศาสตร์ มหาวิทยาลัยอลาบามาที่เบอร์มิงแฮม , เบอร์มิงแฮม , อลาบาม่า 35294 USA
บทคัดย่อ : เทคนิค multoplex PCR ( m-pcr ) ได้พัฒนาวิธีตรวจหาเชื้อโรคที่สำคัญ 3
ปลาในที่อบอุ่น เพาะเลี้ยงสัตว์น้ำพร้อมกันการ m-pcr ขยายชิ้น DNA เป้าหมายจาก
ฟลาโวแบคทีเรียม columnare ( 504 BP ) edwardsiella ictaluri ( 407 BP ) และ hydrophila ( 209
BP ) คือที่เหมาะสม จากการปรับตัวของบัฟเฟอร์ของปฏิกิริยาและทัชดาวน์โปรโตคอล ลดการตรวจจับ
จำกัดสำหรับแต่ละ 3 แบคทีเรีย 20 pg ของแม่แบบของกรดนิวคลีอิกจากแต่ละแบคทีเรียต่อผสมปฏิกิริยา
m-pcr .เกณฑ์ความไวของการตรวจหาแบคทีเรียในเนื้อเยื่อ 3 อยู่ระหว่าง 3.4 ×
102 และ 2.5 × 105 กรัม - 1 เซลล์เนื้อเยื่อปลาดุก ( ช่อง ictalurus punctatus ใหญ่ ) ความไวและความจำเพาะของการวินิจฉัย
m-pcr ประเมิน 10 เป็นตัวแทนจากแต่ละของ
3 แบคทีเรียกรัมลบ และอีก 11 2 กรัมบวกแบคทีเรียที่เกี่ยวข้องกับ taxonomically
หรือที่แพร่หลายในสภาพแวดล้อมทางน้ำ ยกเว้นชนิดเดียว ( A . salmonicida subsp . salmonicida )
แต่ละชุดของดีเอ็นเอเป้าหมายโดยเฉพาะแถบดีเอ็นเอของสายพันธุ์เชื้อสายของแบคทีเรีย .
m-pcr เทียบกับวัฒนธรรมแบคทีเรียชนิดของแบคทีเรียในการทดลอง
ปลาที่ติดเชื้อ การ m-pcr ปรากฏสัญญาสำหรับอย่างรวดเร็ว ความอ่อนไหวและการตรวจหา
พร้อมกันฟลาโวแบคทีเรียม columnare เช่น A . hydrophila ในปลาและ ictaluri ติดเชื้อเมื่อเทียบกับ timeconsuming
เทคนิควัฒนธรรมดั้งเดิมของแบคทีเรีย .
คำสำคัญ : multiplex PCR ด้วยปลาด้วย edwardsiella ด้วยฟลาโวแบคทีเรียมด้วยเชื้อ
ขายหรือสาธารณรัฐไม่ได้รับอนุญาตโดยไม่มีความยินยอมเป็นลายลักษณ์อักษรจากสำนักพิมพ์
DIS aquat org 74 : 199 ( 208 , 2007
ที่สำคัญที่สุดที่มีผลต่อแบคทีเรียโรค การเพาะเลี้ยงสัตว์น้ำ
อุตสาหกรรมในประเทศสหรัฐอเมริกา ( สหรัฐอเมริกากรม
การเกษตร 2003 ) ความชุกและผลกระทบของโรคในปลา
มีสาเหตุจากเชื้อ
hydrophila ( เรียกว่าเคลื่อนที่ภายหลัง
aeromonad , MSA ) น้อยกว่าที่รู้จัก อย่างไรก็ตาม , A . hydrophila
เป็นที่แพร่หลายในระบบนิเวศทางน้ำ ( โฮล์มส์ et al .
1996 ) และการศึกษาล่าสุดแสดงให้เห็นว่าปลาดุก
latently ติดเชื้อ A . hydrophila ( ผู้ให้บริการ )