2.3. RT-PCR and cloning of crustin

2.3. RT-PCR and cloning of crustin gene
Total RNA was extracted from the haemocytes using TRIzolR reagent (Invitrogen, USA). The concentration and purity were determined by NanoDrop®spectrophotometer (ND-1000, V3.7.0,Thermo Fisher Scientific, USA). cDNA was reverse transcribed from RNA using 2 g of total RNA, 2 l of oligo dT (100 ng l−1) and 5 U of RevertAid H minus (MBI Fermentas, USA) with the reaction being carried out at 42◦C for 1 h. A sequence of crustin of Pacific white shrimp, Litopenaeus vannamei was retrieved from GenBank (Accession no: AY488497) and primers designed: CRUS F (5- CAG GATAAA GGC AAT GCC GA-3) and CRUS R (5-CTA TCC TGA GAA CCCTGC CAC G- 3) for PCR. The reaction was performed in a thermal cycler (MJ research, USA) in 30 l volume reaction mix containing 1 U Taq polymerase (Bangalore Genei, Bangalore, India), 3 l of 10X buffer (500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl, pH 8.3, 20 mM MgCl2),100 ng of cDNA, 100 M of each of the 4 dNTPs and 20 pmol of each primer. The cycling conditions included an initial denaturation at 95◦C for 5 min followed by 35 cycles comprising denaturation at95◦C for 1 min, annealing at 55◦C for 1 min, and extension at 72◦Cfor 1 min. This was followed by a final delay of 10 min at 72◦C.The amplicons were electrophoresed in 1.5% agarose gel containing ethidium bromide (0.5 g ml−1) and analyzed using a gel documentation system (Bio-Rad, USA). The PCR product was purified using commercial kit (Qiagen, USA), ligated to commercially available pQE30-UA linearized vector (Qiagen, USA) at 16◦C for 2 h and transformed into SG 13009 Escherichia coli competent cells by heat shock.The recombinant transformants were selected on Luria Bertani (LB)(HiMedia, India) agar plates containing ampicillin (100 g ml−1)and kanamycin (25 g ml−1). PCR was performed using gene specific primers for the inserts and the orientation in the clones was determined by combination of vector and gene specific primers.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.3. RT-PCR และการโคลนยีน crustinรวม RNA ถูกแยกจาก haemocytes โดยใช้สาร TRIzolR (Invitrogen สหรัฐอเมริกา) ความเข้มข้นและความบริสุทธิ์ถูกกำหนด โดย NanoDrop ® spectrophotometer (ND-1000, V3.7.0 เทอร์โม Fisher วิทยาศาสตร์ สหรัฐอเมริกา) cDNA ถูกย้อนกลับทับศัพท์จาก RNA RNA รวม 2 ลิตรของสารโอลิโก 2 กรัมใช้ dT (100 ฉบับ l−1) และ 5 U ของ RevertAid H ลบ (MBI Fermentas สหรัฐอเมริกา) กับปฏิกิริยาเกิดขึ้นใน 42◦C สำหรับ 1 ชั่วโมง ลำดับของ crustin ของกุ้งขาว แวนไมมาถูกดึงจาก GenBank (ทะเบียนไม่มี: AY488497) และไพรเมอร์ที่ออกแบบมา: ฉลากรูปดอกไม้แสดงอยู่ F (5 - CAG GATAAA GGC AAT GCC GA-3) และฉลากรูปดอกไม้แสดงอยู่ R (5 - CTA TCC TGA ไหว้ CCCTGC CAC G-3) สำหรับ PCR ทำปฏิกิริยาใน cycler ความร้อน (MJ วิจัย สหรัฐอเมริกา) ในการผสมปฏิกิริยาปริมาตร 30 ลิตรที่ประกอบด้วยพอลิเมอเรส U Taq 1 (Genei บังกาลอร์ บังกาลอร์ อินเดีย), l 3 10 X บัฟเฟอร์ (500 mM KCl ทริ HCl ค่า pH 8.3, 100 มม. 20 มม. MgCl2), 100 ฉบับของ cDNA, 100 เมตรของแต่ละ 4 dNTPs และ 20 pmol ของรองพื้นแต่ละงาน เงื่อนไขการขี่จักรยานรวม denaturation เป็นครั้งแรกที่ 95◦C สำหรับ 5 นาทีตาม ด้วย 35 รอบประกอบ denaturation at95◦C 1 นาที หลอมที่ 55◦C นาที และส่วนขยายที่ 72◦Cfor 1 นาที นี้ตามมา โดยสุดท้ายล่าช้า 10 นาทีที่ 72◦C.The amplicons ได้ electrophoresed 1.5% agarose เจประกอบด้วยโบรไมด์ ethidium (ml−1 0.5 กรัม) และวิเคราะห์โดยใช้ระบบเอกสารเจล (Bio Rad สหรัฐอเมริกา) ผลิตภัณฑ์ PCR บริสุทธิ์ใช้ชุดพาณิชย์ (Qiagen สหรัฐอเมริกา), ควบการจำหน่าย pQE30-UA linearized เวกเตอร์ (Qiagen สหรัฐอเมริกา) ที่ 16◦C สำหรับ 2 ชม. และเปลี่ยนเป็นจำนวน 13009 Escherichia coli มีเซลล์จากความร้อน Recombinant transformants ถูกเลือกใน Bertani Luria (ปอนด์) (HiMedia อินเดีย) อาหารจานที่ประกอบด้วยแอมพิซิลลิน (ml−1 100 กรัม) และกานามัยซิน (ml−1 25 กรัม) ทำ PCR โดยใช้ไพรเมอร์เฉพาะยีนสำหรับการแทรก และการวางแนวในโคลนที่กำหนด โดยการรวมกันของเวกเตอร์และยีนเฉพาะไพรเมอร์

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.3 RT-PCR และการโคลนยีน crustin
RNA ทั้งหมดถูกสกัดจากเม็ดเลือดโดยใช้น้ำยา TRIzolR (Invitrogen, สหรัฐอเมริกา) ความเข้มข้นและความบริสุทธิ์ได้รับการพิจารณาโดยNanoDrop®spectrophotometer (ND-1000 V3.7.0, Thermo Fisher Scientific, สหรัฐอเมริกา) ยีนที่ถูกคัดลอกกลับจากอาร์เอ็นเอโดยใช้ 2 กรัมของ RNA รวม 2 ลิตร Oligo dT (100 NG? L-1) และ 5 U ของ RevertAid H ลบ (MBI Fermentas, สหรัฐอเมริกา) มีปฏิกิริยาที่มีการดำเนินการที่42◦ C เป็นเวลา 1 ชั่วโมง ลำดับของ crustin ของกุ้งขาวแวนนาไมถูกดึงมาจาก GenBank (Accession No: AY488497) และไพรเมอร์ได้รับการออกแบบ: CRUS F (5 - CAG GATAAA GGC AAT GCC GA-3?) และ CRUS R (5 -CTA ทีซีซี? TGA GAA CCCTGC CAC G- 3?) สำหรับวิธี PCR ปฏิกิริยาที่ได้ดำเนินการใน Cycler ความร้อน (วิจัย MJ, สหรัฐอเมริกา) ในวันที่ 30? L ปริมาณผสมปฏิกิริยาที่มี 1 U Taq โพลิเมอร์ (บังกาลอร์ Genei บังกาลอร์, อินเดีย) 3 ลิตร 10X บัฟเฟอร์ (500 มิลลิ KCl, 100 มิลลิเมตร tris- HCl พีเอช 8.3, 20 มิลลิเมตร MgCl2) 100 NG ของยีน, 100 M ของแต่ละ 4 dNTPs และ 20 pmol ของแต่ละไพรเมอร์ เงื่อนไขการขี่จักรยานรวมถึงการสูญเสียสภาพธรรมชาติเริ่มต้นที่95◦Cเป็นเวลา 5 นาทีตามด้วย 35 รอบประกอบด้วย denaturation at95◦Cเวลา 1 นาทีหลอมที่55◦Cเป็นเวลา 1 นาทีและส่วนขยายที่72◦Cfor 1 นาที นี้ตามมาด้วยความล่าช้าสุดท้ายของ 10 นาทีที่ amplicons 72◦C.Theถูก electrophoresed ในเจล agarose 1.5% มี ethidium bromide (0.5? G ML-1) และวิเคราะห์โดยใช้ระบบเอกสารเจล (Bio-Rad, สหรัฐอเมริกา) ผลิตภัณฑ์ PCR บริสุทธิ์โดยใช้ชุดพาณิชย์ (Qiagen, USA) ligated ไปใช้ได้ในเชิงพาณิชย์ pQE30-UA เชิงเส้นเวกเตอร์ (Qiagen, สหรัฐอเมริกา) ที่16◦Cเป็นเวลา 2 ชั่วโมงและกลายเป็น SG 13009 Escherichia coli เซลล์อำนาจด้วยความร้อน shock.The recombinant transformants ได้รับการคัดเลือกใน Luria Bertani (ปอนด์) (HIMEDIA อินเดีย) วุ้นแผ่นที่มี ampicillin (100 กรัม mL-1) และกานามัยซิ (25? G mL-1) PCR ได้ดำเนินการโดยใช้ไพรเมอร์ที่เฉพาะเจาะจงยีนแทรกและการวางแนวในโคลนที่ถูกกำหนดโดยการรวมกันของเวกเตอร์และยีนไพรเมอร์ที่เฉพาะเจาะจง

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.3 การโคลนยีน crustin RT-PCR และอาร์เอ็นเอทั้งหมดถูกสกัดจากเม็ดเลือดโดยใช้ trizolr Reagent ( Invitrogen , USA ) ความเข้มข้นและความบริสุทธิ์ที่ถูกกำหนดโดย nanodrop ® Spectrophotometer ( nd-1000 v3.7.0 , เทอร์โมฟิชเชอร์ทางวิทยาศาสตร์ , USA ) ยีนคือกลับจาก RNA และใช้ 2 กรัมของอาร์เอ็นเอทั้งหมด , 2 ลิตร ( 100 ng l โอลิโก DT − 1 ) 5 U ของ revertaid H ลบ ( 2 fermentas , USA ) กับปฏิกิริยาที่ถูกดำเนินการที่◦ 42 องศาเซลเซียสนาน 1 ชั่วโมงเป็นลำดับ crustin ของกุ้งขาว vannamei งถูกดึง , 5% ( จากการไม่มี : ay488497 ) และไพรเมอร์ที่ออกแบบ : ขา F ( 5 - CAG gataaa ggc AAT GCC ga-3 ) และขา R ( 5-cta TCC TGA GAA ccctgc the G - 3 ) PCR ปฏิกิริยาที่แสดงในรอบความร้อน ( USA การวิจัย MJ ) 30 ลิตรปริมาตรปฏิกิริยาผสมประกอบด้วย 1 u แท็ค Polymerase ( บังกาลอร์ genei บังกาลอร์ , อินเดีย ) 3 l ) บัฟเฟอร์ ( 500 mm . , 100 มม. หรือ HCl , pH 8.3 mm 20 ชุด ) 100 กรัมของ cDNA , 100 เมตร ของทั้ง 4 dntps 20 pmol แต่ละรองพื้น สภาพจักรยานรวมเริ่มต้นที่ 95 ( ◦องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาที ตามด้วย 35 รอบประกอบด้วย ( at95 ◦องศาเซลเซียสนาน 1 นาที อบอ่อนที่อุณหภูมิ 55 องศาเซลเซียสนาน 1 นาที◦และส่วนขยายที่ 72 ◦ C เป็นเวลา 1 นาที นี้ตามด้วยการหน่วงเวลาสุดท้าย 10 นาทีที่ 72 ◦ c . amplicons เป็น electrophoresed ใน 1.5 เปอร์เซ็นต์ เจลที่มีทิเดียมโบรไมด์ ( + 0.5 กรัมและ− 1 ) โดยใช้ระบบเอกสารเจล ( USA ชีวภาพราด ) ผลิตภัณฑ์ PCR คือบริสุทธิ์ใช้ชุดพาณิชย์ ( QIAGEN , USA ) , ผูกเพื่อใช้ในเชิงพาณิชย์เวกเตอร์ ( เพิ่ม pqe30 มากช่วง สหรัฐอเมริกา ) ที่ 16 ◦ C 2 H และแปลงเป็น SG 13009 Escherichia coli ที่มีเซลล์โดยช็อกความร้อน พลาสมิดพาหะถูกเลือกในลุเรียแบร์ตานิ ( ปอนด์ ) ( himedia อินเดีย ) วุ้น จานที่มีแอมพิซิลลิน ( 100 กรัมต่อมิลลิลิตรและ kanamycin ( − 1 ) ขนาด 25 กรัม− 1 ) ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสโดยใช้ไพร์เมอร์จำเพาะของยีนสำหรับการแทรกและการปฐมนิเทศในโคลนถูกกำหนดโดยการรวมกันของเวกเตอร์และยีนดีเอ็นเอที่เฉพาะเจาะจง