2.5. Protein oxidationProtein oxida

2.5. Protein oxidation
Protein oxidation was assessed on each of the sampling days by estimating the protein carbonyl content with the derivatization of DNPH as described by Oliver, Ahn, Moerman, Goldstein, and Stadtman (1987).
Core samples (as defined under myoglobin redox determination) were collected on each of the sampling days, wrapped in tinfoil and snap frozen in liquid nitrogen in order to inhibit any further oxidation, kept frozen at −20 °C until analysed. Samples (1 g frozen core sample) were homogenised (P-8, Kinematica AG Littau, Switzerland) with 10 ml of 0.15 M KCl, and two equal aliquots of 0.1 ml was taken from the solution. The protein was precipitated with 1 ml 10% trichloracetic acid (TCA) and centrifuged for 5 min at 2240g (Allegra X-22R, Backman Coulter, Germany). The supernatant was discarded and one pellet was treated with 1 ml 2 N HCl while the other pellet was treated with an equal volume of 2 N HCl with 0.2% (w/v) dinitrophenylhydrazine (DNPH) and incubated at room temperature for 60 min. Both samples were then precipitated with 10% TCA (w/v) and centrifuged for 5 min at 2,240g. The supernatant was again discarded and the pellets were carefully washed twice with ethanol:ethyl acetate (1:1) to eliminate any excess DNPH. The pellet was dissolved in 2 ml 6 M guanidine HCl and 20 mM sodium phosphate buffer (pH 6.5). To remove insoluble fragments the samples were centrifuged for 2 min at 2240g. The carbonyl content was determined by subtracting the absorbance, as measured on a spectrophotometer (CE 2021, Cecil, Cambridge, England), of the HCl control sample from the DNPH sample at 320 nm, using 21.0 mM/cm as the absorption coefficient. The protein concentration was determined on the HCl control sample and a Bicinchroninic acid (BCA) protein assay kit and by reading the absorbance at 562 nm on a spectrophotometer (CE 2021, Cecil, Cambridge, England). The results were expressed as nanomoles of DNPH fixed per milligram of protein.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.5 โปรตีนออกซิเดชันออกซิเดชันโปรตีนถูกประเมินในแต่ละวันจะสุ่มตัวอย่าง โดยประมาณโปรตีน carbonyl กับ derivatization ของ DNPH ตามที่อธิบายไว้ โดย Oliver อาห์น Moerman, Goldstein และ Stadtman (1987)ตัวอย่างหลัก (ตามที่กำหนดไว้ภายใต้กำหนด redox ไมโยโกลบิน) ได้รวบรวมในแต่ละวันสุ่ม ห่อ tinfoil และแช่แข็งในไนโตรเจนเหลวเพื่อยับยั้งการเกิดออกซิเดชันเพิ่มเติมสแนป เก็บแช่แข็งที่ −20 ° C จนกว่า analysed ตัวอย่าง (ตัวอย่างแกนน้ำแข็ง 1 g) ได้ homogenised (P-8, Kinematica AG Littau สวิตเซอร์แลนด์) กับ 10 ml ของ 0.15 M KCl, aliquots สองเท่าของ 0.1 มล.ได้มาจากการแก้ปัญหา โปรตีนตกตะกอน ด้วยกรด trichloracetic 10% 1 ml (TCA) และ centrifuged ใน 5 นาทีที่ 2240g (Allegra X-22R, Backman Coulter เยอรมนี) Supernatant ถูกละทิ้ง และเม็ดที่หนึ่งถูกรับ 1 ml 2 N HCl ขณะเม็ดอื่น ๆ รับปริมาตรการเท่ากันของ 2 N HCl กับ 0.2% (w/v) dinitrophenylhydrazine (DNPH) และ incubated ที่อุณหภูมิห้องใน 60 นาที ตัวอย่างทั้งสองตกตะกอนแล้ว 10% TCA (w/v) และ centrifuged สำหรับ 5 นาที 2, 240g Supernatant ถูกปฏิเสธอีก และอย่างระมัดระวังถูกล้างขี้สองกับเอทานอล: เอทิล acetate (1:1) เพื่อกำจัด DNPH ส่วนเกินใด ๆ เม็ดถูกละลายใน 2 ml guanidine 6 M HCl และ 20 มม.โซเดียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (pH 6.5) เอาชิ้นส่วนที่ไม่ละลายน้ำตัวอย่างมี centrifuged สำหรับ 2 นาทีที่ 2240g เนื้อหา carbonyl ถูกกำหนด โดยการลบ absorbance วัดบนตัวเครื่องทดสอบกรดด่าง (CE 2021 เซซิล เคมบริดจ์ อังกฤษ), ของตัวอย่างควบคุม HCl จาก DNPH ที่ 320 nm, 21.0 มม./cm โดยใช้ค่าสัมประสิทธิ์การดูดซึม กำหนดความเข้มข้นของโปรตีน ในตัวอย่างควบคุม HCl และ Bicinchroninic กรด (BCA) โปรตีนวิเคราะห์ชุด และอ่าน absorbance ที่ 562 นาโนเมตรบนตัวเครื่องทดสอบกรดด่าง (CE 2021 เซซิล เคมบริดจ์ อังกฤษ) ผลลัพธ์ถูกแสดงเป็น nanomoles ของ DNPH คงต่อ milligram โปรตีน

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.5 ออกซิเดชันโปรตีน
ออกซิเดชันโปรตีนได้รับการประเมินในแต่ละวันการสุ่มตัวอย่างโดยการประมาณปริมาณโปรตีนคาร์บอนิลที่มีอนุพันธ์ของ DNPH ตามที่อธิบายไว้โดยโอลิเวอร์ Ahn, มอร์แมนโกลด์สไตน์และ Stadtman (1987).
ตัวอย่างแกน (ตามที่กำหนดภายใต้ความมุ่งมั่นอกซ์ myoglobin) ถูกเก็บรวบรวมในแต่ละวันการสุ่มตัวอย่างในห่อฟอยล์และสแน็ปแช่แข็งในไนโตรเจนเหลวในการยับยั้งการเกิดออกซิเดชันเพิ่มเติมใด ๆ ที่เก็บแช่แข็งที่อุณหภูมิ -20 องศาเซลเซียสจนถึงการวิเคราะห์ ตัวอย่าง (1 กรัมตัวอย่างแกนแช่แข็ง) ถูกปั่น (P-8, Kinematica AG Littau วิตเซอร์แลนด์) กับ 10 มิลลิลิตร 0.15 M KCl และสองส่วนลงตัวเท่ากับ 0.1 มลถูกนำมาจากการแก้ปัญหา โปรตีนตกตะกอนกับ 1 มิลลิลิตร 10% กรด trichloracetic (TCA) และหมุนเหวี่ยงเวลา 5 นาทีที่ 2240g (Allegra X-22R, Backman โคลเตอร์, เยอรมนี) ใสถูกทิ้งและเป็นหนึ่งเม็ดได้รับการรักษาด้วย 1 มิลลิลิตร 2 N HCl ในขณะที่เม็ดอื่น ๆ ที่ได้รับการรักษาด้วยปริมาณที่เท่ากันของ 2 N HCl กับ 0.2% (w / v) Dinitrophenylhydrazine (DNPH) และบ่มที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 60 นาที กลุ่มตัวอย่างทั้งสองถูกตกตะกอนแล้วด้วย 10% TCA (w / v) และหมุนเหวี่ยงเวลา 5 นาทีที่ 2,240g ใสถูกทิ้งอีกครั้งและเม็ดได้รับการล้างอย่างระมัดระวังเป็นครั้งที่สองที่มีเอทานอล: เอทิลอะซิเต (1: 1) เพื่อขจัด DNPH ส่วนเกินใด ๆ เม็ดถูกกลืนหายไปใน 2 มิลลิลิตร 6 M guanidine HCl และ 20 มมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (pH 6.5) ในการลบเศษที่ไม่ละลายน้ำตัวอย่างถูกปั่น 2 นาทีที่ 2240g เนื้อหาคาร์บอนิลถูกกำหนดโดยการลบการดูดกลืนแสงที่วัดบน Spectrophotometer (CE 2021, เซซิล, เคมบริดจ์ประเทศอังกฤษ) ของกลุ่มตัวอย่างควบคุม HCl จากตัวอย่าง DNPH ที่ 320 นาโนเมตรโดยใช้ 21.0 mm / ซม. เป็นค่าสัมประสิทธิ์การดูดซึม ความเข้มข้นของโปรตีนที่ถูกกำหนดในตัวอย่างการควบคุมและ HCl กรด Bicinchroninic (BCA) ชุดทดสอบโปรตีนและโดยการอ่านดูดกลืนแสงที่ 562 นาโนเมตรบน Spectrophotometer (CE 2021, เซซิล, เคมบริดจ์ประเทศอังกฤษ) ผลการวิจัยแสดงเป็น nanomoles ของ DNPH คงที่ต่อมิลลิกรัมของโปรตีน

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.5 โปรตีนโปรตีนออกซิเดชัน ออกซิเดชัน
ประเมินในแต่ละตัวอย่างวันโดยประมาณโปรตีนคาร์บอนิลพอใจกับของ dnph ตามที่อธิบายไว้โดยโอลิเวอร์ อาน มอร์แมน โกลด์ , , , และ stadtman ( 2530 ) .
ตัวอย่างแกน ( ตามที่กำหนดภายใต้ myoglobin อกซ์ ) ครั้งนี้ของแต่ละคนวันห่อด้วยแผ่นฟอยล์และตะครุบแช่แข็งในไนโตรเจนเหลว เพื่อยับยั้งการเกิดออกซิเดชัน เพิ่มเติมใด ๆ เก็บไว้ที่อุณหภูมิ 20 ° C −จนคน ตัวอย่าง 1 G หลักตัวอย่างแช่แข็ง ) homogenised ( p-8 kinematica AG , ลิททาว สวิตเซอร์แลนด์ ) 10 ml 0.15 M KCl และสองเฉยๆ เท่ากับ 0.1 มิลลิลิตร ถ่ายจากสารละลายโปรตีนที่ตกตะกอนด้วยกรด 1 เป็น 10% trichloracetic acid ( TCA ) และระดับสำหรับ 5 นาทีที่ 2240g ( Allegra x-22r แบ็กเมิน Coulter , เยอรมนี ) และน่านถูกทิ้งและหนึ่งเม็ดก็ถือว่า 1 ml 2 N HCl ส่วนเม็ดอื่น ๆได้รับการเท่ากับปริมาณ 2 N HCl 0.2 % ( w / v ) dinitrophenylhydrazine ( dnph ) และบ่มที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 60 นาทีทั้งสองแล้วตกตะกอนกับ TCA 10% ( w / v ) และระดับสำหรับ 5 นาทีที่ 2240g . น่านอีกครั้งทิ้งและเม็ดเป็นอย่างรอบคอบล้างสองครั้งด้วยเอทานอล : ethyl acetate ( 1 : 1 ) เพื่อขจัดส่วนเกินใด ๆ dnph . เม็ดละลายในกัวนิดีน 6 M HCl และ 20 มม. 2 ml ( โซเดียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ pH 6.5 )เอาเศษที่ไม่ละลายน้ำจำนวนระดับสำหรับ 2 นาทีที่ 2240g . คาร์บอนิลเนื้อหาถูกกำหนดโดยการลบค่า เป็นวัดอยู่บนเครื่อง ( CE 2021 , เซซิล เคมบริดจ์ ประเทศอังกฤษ ) ของตัวอย่างควบคุม HCl จาก dnph ตัวอย่างที่ 320 nm ใช้ 21.0 มม. / ซม. เป็น absorption coefficientระดับโปรตีนในตัวอย่างกำหนดควบคุมกรด HCl และ bicinchroninic ( BCA ) โปรตีน ( kit และการอ่านค่าการดูดกลืนแสงที่ 562 นาโนเมตรบนเครื่อง ( CE 2021 , เซซิล , เคมบริดจ์ , อังกฤษ ) ผลลัพธ์ที่ได้แสดงเป็น nanomoles ของ dnph คงที่ต่อมิลลิกรัมโปรตีน