To alleviate the limitations discus

To alleviate the limitations discussed above, we developed a novel PCR-based application – coamplification at lower denaturation temperature (COLD)-PCR [24], that preferentially enriches minority alleles from mixtures of wild-type and mutation-containing sequences, irrespective of mutation type and location within the amplicon. COLD-PCR amplification yields amplicons containing enriched proportions of mutant (or variant) alleles, thus permitting the discrete detection and identification of minority alleles by downstream applications.

As PCR is typically an integral step in most genetic analyses, COLD-PCR can be used in place of PCR as a fundamental platform to improve the sensitivity of downstream or combinatorial technologies, including techniques such as Sanger sequencing, pyrosequencing, next-generation sequencing, mutation scanning and mutation genotyping. COLD-PCR is one of relatively few methods that are capable of simultaneously enriching both known and unknown mutations [23]; as such, COLD-PCR is highly advantageous owing to its ability to enrich nearly all low-abundance mutations, regardless of whether they are known or unknown mutations [24,25].

The unique attribute of COLD-PCR is that the selective enrichment of low-abundance mutations (or variants) within a target amplicon is achieved by exploiting a small, but critical and reproducible, difference in amplicon melting temperature (Tm). A single nucleotide variation or mismatch at any position along a double-stranded DNA sequence changes the amplicon Tm. The Tm for amplicons up to 200 bp in length may vary by approximately 0.2–1.5°C and is dependent on the sequence composition [26]. Just below the Tm there is a critical denaturation temperature (Tc) wherein PCR efficiency drops abruptly as a result of the limited number of denatured amplicons. This difference in PCR efficiency, at specifically defined denaturation temperatures, can be used to selectively enrich minority (or low-abundance mutant) alleles throughout the course of PCR.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

เพื่อบรรเทาข้อ จำกัด ที่กล่าวข้างต้นเราพัฒนาโปรแกรม pcr ตามนวนิยาย - coamplification ที่อุณหภูมิ denaturation ต่ำ (เย็น)-pcr [24] ที่พิเศษเสริมสร้างอัลลีลชนกลุ่มน้อยจากส่วนผสมของป่าประเภทและลำดับการกลายพันธุ์ที่มีโดยไม่คำนึงถึงการกลายพันธุ์ ประเภทและที่ตั้งภายใน ampliconขยายเย็น pcr ทำให้ amplicons ที่มีสัดส่วนของการกลายพันธุ์ที่อุดมด้วย (หรือตัวแปร) อัลลีลจึงอนุญาตให้ตรวจสอบต่อเนื่องและบัตรประจำตัวของอัลลีลชนกลุ่มน้อยโดยการใช้งานล่อง.

เป็น pcr โดยทั่วไปจะมีขั้นตอนที่สำคัญในการวิเคราะห์ทางพันธุกรรมมากที่สุดเย็น PCR สามารถใช้ในสถานที่ของ pcr เป็นแพลตฟอร์มพื้นฐานในการปรับปรุงความไวของเทคโนโลยีล่องหรือ combinatorial รวมทั้งเทคนิคเช่นลำดับแซงเจอร์ pyrosequencing, รุ่นถัดไปของลำดับการกลายพันธุ์และการกลายพันธุ์สแกน genotyping เย็น pcr เป็นหนึ่งในวิธีที่ค่อนข้างไม่กี่คนที่มีความสามารถในการกลายพันธุ์สมบูรณ์พร้อมกันทั้งรู้จักและไม่รู้จัก [23];เช่นเย็น pcr เป็นประโยชน์อย่างมากเนื่องจากความสามารถในการเสริมสร้างเกือบทั้งหมดกลายพันธุ์ต่ำอุดมสมบูรณ์โดยไม่คำนึงถึงว่าพวกเขาเป็นที่รู้จักกันหรือไม่รู้จักการกลายพันธุ์ [24,25].

คุณลักษณะที่เป็นเอกลักษณ์ของเย็น pcr ที่เลือก เพิ่มคุณค่าของการกลายพันธุ์ที่อุดมสมบูรณ์ต่ำ (หรือสายพันธุ์) ภายใน amplicon เป้าหมายจะทำได้โดยการใช้ประโยชน์จากขนาดเล็ก แต่ที่สำคัญและซ้ำแตกต่างของอุณหภูมิหลอมละลาย amplicon (TM) รูปแบบเบื่อหน่ายเดียวหรือไม่ตรงกันในตำแหน่งตามลำดับดีเอ็นเอเกลียวคู่ใดเปลี่ยนแปลง TM amplicon TM เพื่อ amplicons ถึง 200 bp ในระยะเวลาอาจแตกต่างกันโดยประมาณ 0.2-1.5 องศาเซลเซียสและจะขึ้นอยู่กับองค์ประกอบลำดับ [26]ด้านล่าง TM มีอุณหภูมิ denaturation สำคัญ (TC) นั้นมีประสิทธิภาพลดลงทันที pcr เป็นผลมาจากจำนวนที่ จำกัด ของ amplicons เอทิลแอลกอฮอล์ ความแตกต่างในประสิทธิภาพ pcr นี้ที่กำหนดไว้โดยเฉพาะอุณหภูมิ denaturation, สามารถใช้ในการเสริมสร้างการคัดเลือกผู้ถือหุ้นส่วนน้อย (หรือต่ำอุดมสมบูรณ์กลายพันธุ์) อัลลีลตลอดหลักสูตรของ pcr

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

เพื่อลดข้อจำกัดที่กล่าวถึงข้างต้น เราพัฒนานวนิยายผลประยุกต์ – coamplification ที่ต่ำ denaturation อุณหภูมิ (เย็น) -PCR [24], ที่โน้ตเพิ่มคุณค่าแก่ชนกลุ่มน้อย alleles จากส่วนผสมของ ชนิดป่า และการกลายพันธุ์ประกอบด้วยลำดับ โดยไม่คำนึงถึงชนิดของการกลายพันธุ์และตำแหน่งภายใน amplicon เย็น-PCR ขยายทำให้ประกอบด้วยสัดส่วนค่อนของ mutant (หรือตัวแปร) alleles จึง อนุญาตให้ตรวจสอบแยกกันและรหัสของชนกลุ่มน้อย alleles โดยปลายน้ำใช้งานของ amplicons

เป็น PCR จะมีขั้นตอนสำคัญในการวิเคราะห์ทางพันธุกรรมมากที่สุด เย็น-PCR สามารถใช้ PCR เป็นพื้นฐานเพื่อปรับปรุงความไวของเทคโนโลยีปลายน้ำ หรือปัญหา รวมเทคนิค Sanger ลำดับ pyrosequencing ลำดับรุ่นต่อไป การกลายพันธุ์ที่สแกน และ genotyping กลายพันธุ์ เย็น-PCR เป็นวิธีค่อนข้างน้อยที่สามารถเสริมพร้อมทั้งรู้จัก และไม่รู้จักกลายพันธุ์ [23]; เช่น เย็น-PCR เป็นข้อได้เปรียบสูงเนื่องจากความสามารถในการบริการกลายพันธุ์ความอุดมสมบูรณ์ต่ำเกือบทั้งหมด ไม่ว่าจะรู้จัก หรือไม่รู้จักกลายพันธุ์ [24,25]

เป็นคุณลักษณะเฉพาะของ PCR เย็นว่าขอเลือกของความอุดมสมบูรณ์ต่ำกลายพันธุ์ (ย่อย) ภายใน amplicon เป้าหมายทำได้ โดย exploiting ขนาดเล็ก แต่สำคัญ และ จำลอง ความแตกต่างใน amplicon ละลายอุณหภูมิ (Tm) นิวคลีโอไทด์หนึ่งเปลี่ยนแปลงหรือไม่ตรงที่ตำแหน่งใด ๆ ตามลำดับดีเอ็นเอคู่ stranded เปลี่ยน amplicon Tm Tm สำหรับ amplicons ถึง 200 bp ความยาวอาจแตกต่างกัน โดยประมาณ 0.2–1.5 ° C และจะขึ้นอยู่กับองค์ประกอบลำดับ [26] ด้านล่าง Tm มีอุณหภูมิวิกฤต denaturation (Tc) นั้นประสิทธิภาพ PCR หยดกะทันหันจากจำนวน denatured amplicons จำกัด สามารถใช้ความแตกต่างนี้ใน PCR ประสิทธิภาพ ที่เฉพาะกำหนด denaturation อุณหภูมิ เลือกกายส่วนน้อย (หรือความอุดมสมบูรณ์ต่ำ mutant) alleles ตลอดหลักสูตรของ PCR ได้

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ข้อจำกัดเพื่อบรรเทาความเดือดร้อนที่ได้กล่าวไปแล้วเราพัฒนาขึ้นมาใหม่ที่ pcr ซึ่งใช้แอปพลิเคชัน - coamplification ที่ อุณหภูมิ ต่ำกว่า denaturation (เย็น) - pcr [ 24 ]ที่ระบุกันไว้ก่อนสำหรับเพิ่มความอุดมสมบูรณ์ alleles ส่วนน้อยจากส่วนผสมของซีเควนซ์ของป่า - พิมพ์และคือมันมีไม่ต้องคำนึงถึงการพิมพ์คือมันและมีที่ตั้งที่อยู่ ภายใน amplicon ได้ความหนาวเย็น - pcr การขยายอัตราผลตอบแทน amplicons ประกอบด้วยเพื่อเพิ่มสัดส่วนของ mutant (หรือรุ่น) alleles ซึ่งให้บริการเมื่อ สภาพ อากาศเอื้ออำนวยที่แยกต่างหากและการตรวจจับการระบุตัวตนของชนกลุ่มน้อย alleles โดยปลายน้ำแอปพลิเคชัน.

pcr โดยปกติแล้วจะเป็นตัวที่มากที่สุดในขั้นตอนการวิเคราะห์ทางพันธุกรรม,ความหนาวเย็น - pcr สามารถใช้ในที่ของ pcr เป็นแพลตฟอร์มพื้นฐานที่จะช่วยปรับปรุงความไวของเทคโนโลยีปลายน้ำหรือ combinatorial รวมถึงเทคนิคเช่นการจัดลำดับ sanger genotyping คือมันคือมันและการสแกนการจัดลำดับถัดไป - รุ่น pyrosequencing ความหนาวเย็น - pcr เป็นหนึ่งในวิธีการค่อนข้างน้อยมากที่จะสามารถรองรับเพิ่มสีสันให้กับชีวิตที่รู้จักและไม่รู้จักเข้าไปเปลี่ยนแปลงรหัส[ 23 ]ทั้งสองเมื่อเป็นเช่นนี้,เย็น - pcr เป็นที่แนะนำอย่างสูงเป็นพิเศษเพราะการที่ความสามารถในการช่วยยกระดับต่ำเกือบทั้งหมด - จำนวนมากเข้าไปเปลี่ยนแปลงรหัส,โดยไม่คำนึงถึงว่าจะเป็นที่รู้จักกันดีในเรื่องหรือไม่รู้จักเข้าไปเปลี่ยนแปลงรหัส[ 24,25 ].

แอตทริบิวต์ที่เป็นเอกลักษณ์ของเย็น - pcr เป็นที่ที่มีความร่ำรวยของต่ำ - ความหลากหลายเข้าไปเปลี่ยนแปลงรหัส(หรือเวอร์ชัน) ภายใน ที่เป้าหมาย amplicon ทำได้โดยการแสวงประโยชน์จากที่ขนาดเล็กแต่มีความสำคัญสูงและเกิดขึ้นซ้ำเดิมได้,ความแตกต่างใน อุณหภูมิ ละลาย amplicon ( TM ) ไม่ตรงกันหรือการเปลี่ยนแปลง nucleotide เดียวที่ตำแหน่งใดก็ได้ตามลำดับดีเอ็นเอดับเบิลคลิกที่สายตีเกลียวที่การเปลี่ยนแปลง amplicon ที่ tm. TM สำหรับ amplicons ได้ถึง 200 BP ในความยาวอาจแตกต่างกันไปโดยประมาณ 0.2 - 1.5 ° C และขึ้นอยู่กับการเขียนตามลำดับ[ 26 ]อยู่ทางด้านล่าง TM ที่มี อุณหภูมิ denaturation ที่สำคัญ( Tc )ซึ่งมี ประสิทธิภาพ pcr ลดลงทันทีเป็นผลมาจากจำนวนที่จำกัดของ amplicons สำหรับจุดไฟ ความแตกต่างของ ประสิทธิภาพ pcr denaturation โดยเฉพาะในที่ที่มี อุณหภูมิ สูงเกินกำหนดสามารถใช้ในการช่วยยกระดับเสียงข้างน้อย(หรือต่ำ - ความอุดมสมบูรณ์ mutant ) alleles ตลอดทั่วทั้งพื้นที่ของ pcr. สุ่มเลือก