- ข้อความ
- ประวัติศาสตร์
2. Materials and Methods2.1. Partic
2. Materials and Methods
2.1. Participant Recruitment and Serologic Screening for HIV Infection
Self-completed questionnaires and blood samples were collected from anonymous participants at commercial male homosexual venues of Taipei and NewTaipei City on weekends. The questionnaires included measures of demographics, HIV testing history and sexual risk behavior(Supplementary Table 1). A total of 1200 study participants received
pretest counseling, were informed about the purpose of this study and gave written informed consent.
HIV diagnosis was made using a recombinant HIV enzyme immunoassay (Murex Diagnostics Limited,Dartford, UK). Positive test results were confirmed by HIV western blot 2.2 (Genelab Technologies, Inc., Singapore). In addition, positive
blood samples were tested for HIV-1 subtype. Based on the regular blood sampling every 3 months, 89 participants were infected with HIV-1. Of the subjects who were identified to be seroconverted within
prior 6 months, 20 of themwere recruited to join thisMRJ-L evaluation study. Another 30 uninfected subjects were randomly recruited as controls.This study was conducted with the approval of the institutional review
board of the Mackay Memorial Hospital, Taipei, Taiwan.
2.2. Cell Lines and Cell Preparations
After obtaining informed consent, CD4+T lymphocytes and CD14+ monocytes were isolated from PBMCs from healthy donors and HIV infected patients by Ficoll-Paque gradient (GE Healthcare Life Sciences,Pittsburgh, PA, USA) using CD4+/CD14+ magnetic microbeads(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany). Laboratory personnel were blind to the identity and HIV-1 infection status of blood donors.To induce macrophage differentiation, monocytes isolated from donors
were maintained in RPMI1640 supplemented with 10% human AB serum, 5% fetal bovine serum (FBS), and 50 ng/mL M-CSF(PeproTech,Rocky Hill, NJ, USA) for seven days. Jurkat cells were cultured in RPMI1640 supplemented with 10% FBS. In addition, phytohaemagglutinin(PHA) was added to stimulate Jurkat cells. THP-1 (a monocyte cell line) and U937 cells were cultured in RPMI1640 (Life Technologies, Grand Island, NY, USA) supplemented with 10% FBS and 2 mM DMSO. 293 T cells were cultured in DMEM (Life Technologies) supplemented with 10% FBS. To induce differentiation of U937 cells into macrophage-like cells, 200 μM phorbol myristate acetate (PMA) mitogen was added to the culture medium, and the cells were harvested after 48 h.
2.3. Plasmids
The plasmid pEGFP–Vpr was constructed by inserting the Vpr gene amplified from the HIV-1 pNL4-3 clone into the appropriate vectors.The HA-MRJ-L and HA-MRJ-S plasmids were constructed in the pcDNA vector. The lentiviral expression vector of MRJ-L was constructed in the pLKO_AS3w.puro vector. The MRJ-L 3′UTR shRNA (shJ8_5'-GCGCAGATGGCTAACTGAGTA) was designed using InvivoGen siRNA Wizard v3.1 software, and was constructed in the pLKO.1-puro vector (obtained from the National RNAi Core Facility, Academia Sinica, Taiwan). All construct identities were confirmed by sequencing the entire insert.
2.4. HIV-1 Virus Production and Viral Infection
293 T cells (2 × 106) were transfected with 2 μg of p125 (M-tropic,ADA strain) plasmids using Lipofectamine 2000, and the supernatants were harvested at 48 h post-transfection. Viruses were pretreated with 2 U/mL DNase I (Life Technologies) at 37 °C for 30 min before infection,and the viral titer was quantified using the p24 ELISA assay(PerkinElmer, Waltham, MA,USA). Cells with over-expressed or reduced levels of MRJ-L were titrated to adjust for equal cell numbers, and 1 × 106 cells were infected with M-tropic strain of HIV-1 (equivalent to 25 ng of p24 antigen) at 37 °C for 2 h. After washing three times with PBS, cells were maintained in RPMI1640/2% FBS and half of the medium was replaced every three days. Culture supernatants were collected every three days for quantification of p24 antigen by HIV-1 p24 ELISA(PerkinElmer).
2.5. Statistical Analysis
The significance level was set at 0.05, and all p values were twotailed.Risk factors for HIV-1 infection were analyzed using simple logistic regression, followed by Bayesian multiple logistic regression because of sparse data. The simple logistic regression was performed using the software Stata (version 13, StataCorp, College Station, Texas) or
WinBUGS (version 1.4.3; MRC Biostatistics Unit, Cambridge, England) when there were sparse data. Bayesian multiple regression analysis was undertaken using the software package WinBUGS.
2.6. Ethical Research Conduct
This study conformed to the provisions of the 1975 Helsinki Declaration and was approved by the institutional review board of the National Taiwan University Hospital (NTUH-201102003RC) and Mackay Memorial Hospital (13MMHIS039).
All patients gave written consents before they participated in this study.
2.1. Participant Recruitment and Serologic Screening for HIV Infection
Self-completed questionnaires and blood samples were collected from anonymous participants at commercial male homosexual venues of Taipei and NewTaipei City on weekends. The questionnaires included measures of demographics, HIV testing history and sexual risk behavior(Supplementary Table 1). A total of 1200 study participants received
pretest counseling, were informed about the purpose of this study and gave written informed consent.
HIV diagnosis was made using a recombinant HIV enzyme immunoassay (Murex Diagnostics Limited,Dartford, UK). Positive test results were confirmed by HIV western blot 2.2 (Genelab Technologies, Inc., Singapore). In addition, positive
blood samples were tested for HIV-1 subtype. Based on the regular blood sampling every 3 months, 89 participants were infected with HIV-1. Of the subjects who were identified to be seroconverted within
prior 6 months, 20 of themwere recruited to join thisMRJ-L evaluation study. Another 30 uninfected subjects were randomly recruited as controls.This study was conducted with the approval of the institutional review
board of the Mackay Memorial Hospital, Taipei, Taiwan.
2.2. Cell Lines and Cell Preparations
After obtaining informed consent, CD4+T lymphocytes and CD14+ monocytes were isolated from PBMCs from healthy donors and HIV infected patients by Ficoll-Paque gradient (GE Healthcare Life Sciences,Pittsburgh, PA, USA) using CD4+/CD14+ magnetic microbeads(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany). Laboratory personnel were blind to the identity and HIV-1 infection status of blood donors.To induce macrophage differentiation, monocytes isolated from donors
were maintained in RPMI1640 supplemented with 10% human AB serum, 5% fetal bovine serum (FBS), and 50 ng/mL M-CSF(PeproTech,Rocky Hill, NJ, USA) for seven days. Jurkat cells were cultured in RPMI1640 supplemented with 10% FBS. In addition, phytohaemagglutinin(PHA) was added to stimulate Jurkat cells. THP-1 (a monocyte cell line) and U937 cells were cultured in RPMI1640 (Life Technologies, Grand Island, NY, USA) supplemented with 10% FBS and 2 mM DMSO. 293 T cells were cultured in DMEM (Life Technologies) supplemented with 10% FBS. To induce differentiation of U937 cells into macrophage-like cells, 200 μM phorbol myristate acetate (PMA) mitogen was added to the culture medium, and the cells were harvested after 48 h.
2.3. Plasmids
The plasmid pEGFP–Vpr was constructed by inserting the Vpr gene amplified from the HIV-1 pNL4-3 clone into the appropriate vectors.The HA-MRJ-L and HA-MRJ-S plasmids were constructed in the pcDNA vector. The lentiviral expression vector of MRJ-L was constructed in the pLKO_AS3w.puro vector. The MRJ-L 3′UTR shRNA (shJ8_5'-GCGCAGATGGCTAACTGAGTA) was designed using InvivoGen siRNA Wizard v3.1 software, and was constructed in the pLKO.1-puro vector (obtained from the National RNAi Core Facility, Academia Sinica, Taiwan). All construct identities were confirmed by sequencing the entire insert.
2.4. HIV-1 Virus Production and Viral Infection
293 T cells (2 × 106) were transfected with 2 μg of p125 (M-tropic,ADA strain) plasmids using Lipofectamine 2000, and the supernatants were harvested at 48 h post-transfection. Viruses were pretreated with 2 U/mL DNase I (Life Technologies) at 37 °C for 30 min before infection,and the viral titer was quantified using the p24 ELISA assay(PerkinElmer, Waltham, MA,USA). Cells with over-expressed or reduced levels of MRJ-L were titrated to adjust for equal cell numbers, and 1 × 106 cells were infected with M-tropic strain of HIV-1 (equivalent to 25 ng of p24 antigen) at 37 °C for 2 h. After washing three times with PBS, cells were maintained in RPMI1640/2% FBS and half of the medium was replaced every three days. Culture supernatants were collected every three days for quantification of p24 antigen by HIV-1 p24 ELISA(PerkinElmer).
2.5. Statistical Analysis
The significance level was set at 0.05, and all p values were twotailed.Risk factors for HIV-1 infection were analyzed using simple logistic regression, followed by Bayesian multiple logistic regression because of sparse data. The simple logistic regression was performed using the software Stata (version 13, StataCorp, College Station, Texas) or
WinBUGS (version 1.4.3; MRC Biostatistics Unit, Cambridge, England) when there were sparse data. Bayesian multiple regression analysis was undertaken using the software package WinBUGS.
2.6. Ethical Research Conduct
This study conformed to the provisions of the 1975 Helsinki Declaration and was approved by the institutional review board of the National Taiwan University Hospital (NTUH-201102003RC) and Mackay Memorial Hospital (13MMHIS039).
All patients gave written consents before they participated in this study.
0/5000
2. วัสดุและวิธีการ2.1. ผู้เข้าร่วมสรรหาและการคัดกรอง Serologic สำหรับเชื้อเอชไอวี แบบสอบถามที่เสร็จสมบูรณ์ด้วยตนเองและตัวอย่างเลือดได้รวบรวมจากผู้เข้าร่วมแบบที่ค้าชายเกย์แห่งไทเปและเมือง NewTaipei เสาร์ แบบสอบถามรวมวัดข้อมูลประชากร เอชไอวีประวัติและพฤติกรรมเสี่ยงทางเพศ (เสริมตาราง 1) จำนวนผู้เข้าร่วมศึกษา 1200 รับpretest ให้คำปรึกษา ได้ทราบเกี่ยวกับวัตถุประสงค์ของการศึกษานี้ และให้เขียนแจ้งความยินยอม ทำการวินิจฉัยเชื้อเอชไอวีใช้ immunoassay การเอนไซม์เอชไอวีเป็น recombinant (มูเร็กซ์ จำกัดวินิจฉัย ดราฟท์ฟอร์ด UK) ผลการทดสอบเป็นบวกถูกยืนยันจากเอชไอวีเวสเทิร์นคืนในตา 2.2 (Genelab เทคโนโลยี อิงค์ สิงคโปร์) นอกจากนี้ บวกเลือดตัวอย่างที่ทดสอบสำหรับชนิดย่อยของเชื้อเอชไอวี-1 ร่วม 89 ตามเลือดสม่ำเสมอทุก 3 เดือนในการสุ่มตัวอย่าง ได้ติดเชื้อเอชไอวี 1 เรื่องที่ระบุจะเป็น seroconverted ภายในก่อน 6 เดือน 20 themwere พิจารณาเข้าศึกษาประเมิน thisMRJ-L อีกเรื่องเชื้อ 30 ถูกสุ่มคัดเป็นตัวควบคุมการศึกษานี้ได้ดำเนินการ โดยการอนุมัติของสถาบันการตรวจทานคณะแมคเคย์เมโมเรียล ไทเป ไต้หวัน 2.2. บรรทัดเซลล์ และเซลล์เตรียม หลังจากได้รับแจ้งความยินยอม CD4 + T lymphocytes และ CD14 + monocytes ถูกแยกต่างหากจาก PBMCs จากผู้บริจาคมีสุขภาพดีและผู้ป่วยติดเชื้อเอชไอวี โดย Ficoll Paque การไล่ระดับสี (วิทยาศาสตร์สุขภาพสุขอนามัย GE พิตส์เบิร์ก PA สหรัฐอเมริกา) ใช้ CD4 + /mts CD14 + แม่เหล็ก microbeads (ไบโอเทค Miltenyi, Bergisch Gladbach เยอรมนี) บุคลากรห้องปฏิบัติการซ่อนตัวตนและสถานะการติดเชื้อเอชไอวี-1 ของผู้บริจาคเลือดได้เพื่อก่อให้เกิดการสร้างความแตกต่าง macrophage, monocytes แยกต่างหากจากผู้บริจาคถูกจัดเก็บอยู่ใน RPMI1640 เสริม ด้วยเซรั่ม AB มนุษย์ 10%, 5% และทารกในครรภ์วัวซีรั่ม (FBS), และ 50 ng/mL M CSF(PeproTech,Rocky Hill, NJ, USA) 7 วัน Jurkat เซลล์มีอ่างใน RPMI1640 เสริม ด้วย 10% FBS นอกจากนี้ phytohaemagglutinin(PHA) ถูกเพิ่มเพื่อกระตุ้นเซลล์ Jurkat THP-1 (โมโนไซต์เซลล์บรรทัด) และเซลล์ U937 ได้อ่างใน RPMI1640 (เทคโนโลยีชีวิต เกาะแกรนด์ NY, USA) เสริม ด้วย 10% FBS และ DMSO 2 มม. 293 T เซลล์มีอ่างใน DMEM (ชีวิตเทคโนโลยี) เสริม ด้วย 10% FBS เพื่อก่อให้เกิดการสร้างความแตกต่างของเซลล์ U937 ลงในเซลล์ macrophage เหมือน เพิ่ม myristate 200 μM phorbol acetate (PMA) mitogen ปานกลางวัฒนธรรม และเซลล์เก็บเกี่ยวผลผลิตหลังจาก 48 h2.3 plasmids PEGFP – Vpr plasmid ถูกสร้างขึ้น โดยการใส่ยีน Vpr ขยายเป็นเวกเตอร์ที่เหมาะสมจากโคลน pNL4 3 เอชไอวี-1ฮา MRJ L และ S ฮา MRJ plasmids ถูกสร้างในเวกเตอร์ pcDNA เวกเตอร์นิพจน์ lentiviral ของ MRJ L ถูกสร้างในเวกเตอร์ pLKO_AS3w.puro ShRNA 3′UTR MRJ L (shJ8_5'-GCGCAGATGGCTAACTGAGTA) ถูกออกแบบโดยใช้ตัวช่วยสร้าง InvivoGen siRNA v3.1 ซอฟต์แวร์ และถูกสร้างในเวกเตอร์ใช้ pLKO.1 (ได้รับจากการชาติ RNAi หลักสิ่งอำนวยความสะดวก Academia Sinica ไต้หวัน) รหัสประจำตัวโครงสร้างทั้งหมดถูกยืนยัน โดยลำดับเบสแทรกทั้งหมด2.4 การผลิตไวรัสเอชไอวี-1 และติดเชื้อไวรัส 293 T เซลล์ (2 × 106) มี transfected กับ μg 2 ของ p125 (M-ทรอปิก ต้องใช้ ADA) plasmids ใช้ Lipofectamine 2000 และ supernatants ได้เก็บเกี่ยวที่ transfection หลัง 48 h ไวรัสถูก pretreated กับ DNase U/mL 2 ฉัน (ชีวิตเทคโนโลยี) ที่ 37 ° C สำหรับ 30 นาทีก่อนที่จะติดเชื้อ และ titer ไวรัสถูก quantified ใช้ p24 การทดสอบ ELISA (PerkinElmer, Waltham, MA สหรัฐอเมริกา) เซลล์แสดงมากเกินไป หรือลดระดับของ MRJ L ที่ titrated ปรับเลขเซลล์เท่า และ 1 × 106 เซลล์ติดเชื้อต้องใช้ M-ทรอปิกของเอชไอวี-1 (เทียบเท่ากับ 25 ng ตรวจหา p24) ที่ 37 ° C สำหรับ 2 h หลังจากซักสามครั้งด้วย PBS เซลล์ถูกจัดเก็บอยู่ใน RPMI1640/2% FBS และครึ่งหนึ่งของสื่อถูกแทนทุกสามวัน Supernatants วัฒนธรรมได้รวบรวมทุกวันนับของการตรวจหา p24 สาม โดย ELISA(PerkinElmer) p24 เอชไอวี-12.5. สถิติวิเคราะห์ มีการตั้งค่าระดับนัยสำคัญที่ 0.05 และค่า p ทั้งหมดมี twotailedปัจจัยเสี่ยงต่อการติดเชื้อเอชไอวี-1 ได้วิเคราะห์โดยใช้การถดถอยโลจิสติกอย่าง ตามทฤษฎีหลายถดถอยโลจิสติก เพราะข้อมูลบ่อ ถดถอยโลจิสติกอย่างถูกดำเนินการโดยใช้ซอฟต์แวร์ Stata (รุ่น 13, StataCorp วิทยาลัยสถานี เท็กซัส) หรือWinBUGS (ฉบับปรุง 1.4.3 หน่วยชีวสถิติ MRC เคมบริดจ์ อังกฤษ) เมื่อมีข้อมูลบ่อ ทฤษฎีการวิเคราะห์การถดถอยหลายดำเนินใช้ชุดซอฟต์แวร์ WinBUGS2.6. จริยธรรมวิจัยปฏิบัติ การศึกษานี้ตามบทบัญญัติของปฏิญญาเฮลซิงกิ 1975 และได้รับการอนุมัติ โดยคณะกรรมการตรวจสอบสถาบันแห่งชาติไต้หวัน (NTUH-201102003RC) โรงพยาบาลมหาวิทยาลัยและโรงพยาบาลแมคเคย์ (13MMHIS039) ผู้ป่วยทั้งหมดให้ consents เขียนก่อนที่จะเข้าร่วมในการศึกษานี้
การแปล กรุณารอสักครู่..
2. วัสดุและวิธีการ
2.1 การสรรหาผู้เข้าร่วมการศึกษาเรื่องเซรุ่มและการคัดกรองการติดเชื้อเอชไอวีสำหรับ
แบบสอบถามเสร็จตนเองและการเก็บตัวอย่างเลือดจากผู้เข้าร่วมที่ไม่ระบุชื่อในสถานที่มีพฤติกรรมรักร่วมเพศในเชิงพาณิชย์ชายของไทเปและ NewTaipei เมืองวันหยุดสุดสัปดาห์ แบบสอบถามรวมมาตรการของกลุ่มผู้เข้าชมประวัติศาสตร์การทดสอบเอชไอวีและพฤติกรรมเสี่ยงทางเพศ (เสริมตารางที่ 1) รวม 1200 เข้าร่วมการศึกษาที่ได้รับ
การให้คำปรึกษาก่อนการทดลองได้รับการแจ้งเกี่ยวกับวัตถุประสงค์ของการศึกษาครั้งนี้และให้ยินยอมเป็นลายลักษณ์อักษร.
การวินิจฉัยโรคเอชไอวีได้รับการทำโดยใช้อิมมูโนเอนไซม์เอชไอวี recombinant (สังข์วินิจฉัย จำกัด เบอรี, สหราชอาณาจักร) ผลการทดสอบในเชิงบวกได้รับการยืนยันจากเอชไอวีดวงตะวัน 2.2 (Genelab Technologies, Inc, สิงคโปร์) นอกจากนี้บวก
ตัวอย่างเลือดได้รับการตรวจ HIV-1 subtype ขึ้นอยู่กับการเก็บตัวอย่างเลือดปกติทุก 3 เดือน 89 ผู้เข้าร่วมมีการติดเชื้อเอชไอวี-1 ของอาสาสมัครที่ได้รับการระบุที่จะ seroconverted ภายใน
ก่อน 6 เดือน, 20 ของ themwere ได้รับคัดเลือกให้เข้าร่วมการศึกษาการประเมินผล thisMRJ-L อีก 30 วิชาที่ไม่ติดเชื้อได้รับคัดเลือกโดยการสุ่มการศึกษา controls.This ได้ดำเนินการด้วยความเห็นชอบการตรวจสอบสถาบัน
คณะกรรมการของโรงพยาบาลแมคเคย์, ไทเป, ไต้หวัน. 2.2 เซลล์และการเตรียมเซลล์หลังจากได้รับความยินยอม, CD4 + T lymphocytes และ CD14 + monocytes ถูกแยกจาก PBMCs จากผู้บริจาคที่มีสุขภาพดีและผู้ป่วยที่ติดเชื้อเอชไอวีโดยการไล่ระดับสี Ficoll-Paque (GE Healthcare วิทยาศาสตร์เพื่อชีวิต, พิตส์เบิร์ก, PA, USA) โดยใช้ CD4 + / CD14 + แม่เหล็ก Microbeads (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, เยอรมนี) ห้องปฏิบัติการบุคลากรตาบอดกับตัวตนและสถานะการติดเชื้อเอชไอวี 1 ของเลือดทำให้เกิดความแตกต่าง donors.To macrophage, monocytes แยกได้จากผู้บริจาคได้รับการเก็บรักษาไว้ใน RPMI1640 เสริมด้วย 10% ซีรั่มของมนุษย์ AB, 5% ซีรั่มวัวของทารกในครรภ์ (FBS) และ 50 เส้นทาง / mL M-CSF (PeproTech, ร็อคกี้ฮิลล์, นิวเจอร์ซีย์สหรัฐอเมริกา) เป็นเวลาเจ็ดวัน เซลล์ Jurkat มาเพาะเลี้ยงใน RPMI1640 เสริมด้วย 10% FBS นอกจากนี้ phytohaemagglutinin (PHA) ถูกเพิ่มเข้ามาในการกระตุ้นเซลล์ Jurkat THP-1 (เซลล์ monocyte) และเซลล์ U937 มาเพาะเลี้ยงใน RPMI1640 (ไลฟ์เทคโนโลยีส์, แกรนด์ไอส์แลนด์, NY, USA) เสริมด้วย FBS 10% และ 2 มิลลิ DMSO 293 T เซลล์ที่ถูกเลี้ยงใน DMEM (ไลฟ์เทคโนโลยีส์) เสริมด้วย 10% FBS เพื่อก่อให้เกิดความแตกต่างของเซลล์ U937 เข้าสู่เซลล์ macrophage เหมือน 200 ไมครอน phorbol myristate acetate (PMA) mitogen ถูกบันทึกอยู่ในอาหารเลี้ยงเชื้อและเซลล์ที่ถูกเก็บเกี่ยวหลังจาก 48 ชั่วโมง. 2.3 พลาสมิดพลาสมิด pEGFP-Vpr ถูกสร้างขึ้นโดยการใส่ยีน Vpr ขยายจากพลาสมิดเอชไอวี 1 pNL4-3 โคลนเข้าไปในที่เหมาะสม vectors.The HA-MRJ-L และ HA-MRJ-S ถูกสร้างขึ้นในเวกเตอร์ pcDNA เวกเตอร์ lentiviral การแสดงออกของ MRJ-L ถูกสร้างขึ้นในเวกเตอร์ pLKO_AS3w.puro MRJ-L 3'UTR shRNA (shJ8_5'-GCGCAGATGGCTAACTGAGTA) ได้รับการออกแบบโดยใช้ซอฟแวร์ InvivoGen siRNA Wizard v3.1 และได้รับการสร้างขึ้นในเวกเตอร์ pLKO.1-บริสุทธิ์ (ที่ได้รับจากสิ่งอำนวยความสะดวกแห่งชาติ RNAi แกน Academia Sinica ไต้หวัน) . ทั้งหมดสร้างอัตลักษณ์ได้รับการยืนยันโดยลำดับแทรกทั้งหมด. 2.4 เอชไอวี 1 การผลิตไวรัสและการติดเชื้อไวรัส293 T เซลล์ (2 × 106) ถูก transfected มี 2 ไมโครกรัมของ P125 (M-เขตร้อนความเครียด ADA) พลาสมิดใช้ Lipofectamine 2000 และ supernatants ถูกเก็บเกี่ยวใน 48 ชั่วโมงหลังการ transfection ไวรัสที่ถูกปรับสภาพมี 2 U / มิลลิลิตร DNase ฉัน (ไลฟ์เทคโนโลยีส์) ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 นาทีก่อนที่จะติดเชื้อและ titer ไวรัสที่ถูกวัดโดยใช้การทดสอบ ELISA p24 (PerkinElmer, เคมบริดจ์, ประเทศสหรัฐอเมริกา) เซลล์ที่มีระดับการแสดงออกหรือการลดลงของ MRJ-L ถูกปรับขนาดเพื่อปรับหมายเลขโทรศัพท์มือเท่ากันและ 1 × 106 เซลล์มีการติดเชื้อความเครียด M-เขตร้อนของเชื้อ HIV-1 (เทียบเท่ากับ 25 เส้นทางของแอนติเจน p24) ที่ 37 ° C เป็นเวลา 2 ชั่วโมง หลังจากล้างสามครั้งกับพีบีเอสเซลล์ได้รับการเก็บรักษาไว้ใน RPMI1640 / 2% FBS และครึ่งหนึ่งของกลางถูกเปลี่ยนทุกสามวัน supernatants วัฒนธรรมถูกเก็บรวบรวมทุกสามวันสำหรับปริมาณของแอนติเจน p24 โดยเอชไอวี 1 p24 วิธี ELISA (PerkinElmer). 2.5 การวิเคราะห์ทางสถิติระดับนัยสำคัญตั้งอยู่ที่ 0.05 และค่า P เป็นปัจจัย twotailed.Risk เชื้อเอชไอวี 1 ที่ได้มาวิเคราะห์โดยใช้การถดถอยโลจิสติกที่เรียบง่ายตามแบบเบย์หลายถดถอยโลจิสติเพราะข้อมูลที่เบาบาง ถดถอยโลจิสติง่ายได้รับการดำเนินการโดยใช้ซอฟแวร์ Stata (รุ่น 13 StataCorp, คอลเลจสเตชัน) หรือWinBUGS (เวอร์ชัน 1.4.3; MRC ชีวสถิติหน่วยเคมบริดจ์ประเทศอังกฤษ) เมื่อมีข้อมูลที่เบาบาง การวิเคราะห์การถดถอยพหุคูณแบบเบย์ได้ดำเนินการโดยใช้แพคเกจซอฟต์แวร์ WinBUGS. 2.6 วิจัยจริยธรรมการศึกษาครั้งนี้เป็นไปตามบทบัญญัติของปฏิญญาเฮลซิงกิ 1975 และได้รับการอนุมัติจากคณะกรรมการตรวจสอบของสถาบันแห่งชาติไต้หวันโรงพยาบาลมหาวิทยาลัย (NTUH-201102003RC) และแม็คเคย์อนุสรณ์โรงพยาบาล (13MMHIS039). ผู้ป่วยทุกรายให้ความยินยอมเป็นลายลักษณ์อักษรก่อนที่พวกเขามีส่วนร่วมใน การศึกษาครั้งนี้
2.1 การสรรหาผู้เข้าร่วมการศึกษาเรื่องเซรุ่มและการคัดกรองการติดเชื้อเอชไอวีสำหรับ
แบบสอบถามเสร็จตนเองและการเก็บตัวอย่างเลือดจากผู้เข้าร่วมที่ไม่ระบุชื่อในสถานที่มีพฤติกรรมรักร่วมเพศในเชิงพาณิชย์ชายของไทเปและ NewTaipei เมืองวันหยุดสุดสัปดาห์ แบบสอบถามรวมมาตรการของกลุ่มผู้เข้าชมประวัติศาสตร์การทดสอบเอชไอวีและพฤติกรรมเสี่ยงทางเพศ (เสริมตารางที่ 1) รวม 1200 เข้าร่วมการศึกษาที่ได้รับ
การให้คำปรึกษาก่อนการทดลองได้รับการแจ้งเกี่ยวกับวัตถุประสงค์ของการศึกษาครั้งนี้และให้ยินยอมเป็นลายลักษณ์อักษร.
การวินิจฉัยโรคเอชไอวีได้รับการทำโดยใช้อิมมูโนเอนไซม์เอชไอวี recombinant (สังข์วินิจฉัย จำกัด เบอรี, สหราชอาณาจักร) ผลการทดสอบในเชิงบวกได้รับการยืนยันจากเอชไอวีดวงตะวัน 2.2 (Genelab Technologies, Inc, สิงคโปร์) นอกจากนี้บวก
ตัวอย่างเลือดได้รับการตรวจ HIV-1 subtype ขึ้นอยู่กับการเก็บตัวอย่างเลือดปกติทุก 3 เดือน 89 ผู้เข้าร่วมมีการติดเชื้อเอชไอวี-1 ของอาสาสมัครที่ได้รับการระบุที่จะ seroconverted ภายใน
ก่อน 6 เดือน, 20 ของ themwere ได้รับคัดเลือกให้เข้าร่วมการศึกษาการประเมินผล thisMRJ-L อีก 30 วิชาที่ไม่ติดเชื้อได้รับคัดเลือกโดยการสุ่มการศึกษา controls.This ได้ดำเนินการด้วยความเห็นชอบการตรวจสอบสถาบัน
คณะกรรมการของโรงพยาบาลแมคเคย์, ไทเป, ไต้หวัน. 2.2 เซลล์และการเตรียมเซลล์หลังจากได้รับความยินยอม, CD4 + T lymphocytes และ CD14 + monocytes ถูกแยกจาก PBMCs จากผู้บริจาคที่มีสุขภาพดีและผู้ป่วยที่ติดเชื้อเอชไอวีโดยการไล่ระดับสี Ficoll-Paque (GE Healthcare วิทยาศาสตร์เพื่อชีวิต, พิตส์เบิร์ก, PA, USA) โดยใช้ CD4 + / CD14 + แม่เหล็ก Microbeads (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, เยอรมนี) ห้องปฏิบัติการบุคลากรตาบอดกับตัวตนและสถานะการติดเชื้อเอชไอวี 1 ของเลือดทำให้เกิดความแตกต่าง donors.To macrophage, monocytes แยกได้จากผู้บริจาคได้รับการเก็บรักษาไว้ใน RPMI1640 เสริมด้วย 10% ซีรั่มของมนุษย์ AB, 5% ซีรั่มวัวของทารกในครรภ์ (FBS) และ 50 เส้นทาง / mL M-CSF (PeproTech, ร็อคกี้ฮิลล์, นิวเจอร์ซีย์สหรัฐอเมริกา) เป็นเวลาเจ็ดวัน เซลล์ Jurkat มาเพาะเลี้ยงใน RPMI1640 เสริมด้วย 10% FBS นอกจากนี้ phytohaemagglutinin (PHA) ถูกเพิ่มเข้ามาในการกระตุ้นเซลล์ Jurkat THP-1 (เซลล์ monocyte) และเซลล์ U937 มาเพาะเลี้ยงใน RPMI1640 (ไลฟ์เทคโนโลยีส์, แกรนด์ไอส์แลนด์, NY, USA) เสริมด้วย FBS 10% และ 2 มิลลิ DMSO 293 T เซลล์ที่ถูกเลี้ยงใน DMEM (ไลฟ์เทคโนโลยีส์) เสริมด้วย 10% FBS เพื่อก่อให้เกิดความแตกต่างของเซลล์ U937 เข้าสู่เซลล์ macrophage เหมือน 200 ไมครอน phorbol myristate acetate (PMA) mitogen ถูกบันทึกอยู่ในอาหารเลี้ยงเชื้อและเซลล์ที่ถูกเก็บเกี่ยวหลังจาก 48 ชั่วโมง. 2.3 พลาสมิดพลาสมิด pEGFP-Vpr ถูกสร้างขึ้นโดยการใส่ยีน Vpr ขยายจากพลาสมิดเอชไอวี 1 pNL4-3 โคลนเข้าไปในที่เหมาะสม vectors.The HA-MRJ-L และ HA-MRJ-S ถูกสร้างขึ้นในเวกเตอร์ pcDNA เวกเตอร์ lentiviral การแสดงออกของ MRJ-L ถูกสร้างขึ้นในเวกเตอร์ pLKO_AS3w.puro MRJ-L 3'UTR shRNA (shJ8_5'-GCGCAGATGGCTAACTGAGTA) ได้รับการออกแบบโดยใช้ซอฟแวร์ InvivoGen siRNA Wizard v3.1 และได้รับการสร้างขึ้นในเวกเตอร์ pLKO.1-บริสุทธิ์ (ที่ได้รับจากสิ่งอำนวยความสะดวกแห่งชาติ RNAi แกน Academia Sinica ไต้หวัน) . ทั้งหมดสร้างอัตลักษณ์ได้รับการยืนยันโดยลำดับแทรกทั้งหมด. 2.4 เอชไอวี 1 การผลิตไวรัสและการติดเชื้อไวรัส293 T เซลล์ (2 × 106) ถูก transfected มี 2 ไมโครกรัมของ P125 (M-เขตร้อนความเครียด ADA) พลาสมิดใช้ Lipofectamine 2000 และ supernatants ถูกเก็บเกี่ยวใน 48 ชั่วโมงหลังการ transfection ไวรัสที่ถูกปรับสภาพมี 2 U / มิลลิลิตร DNase ฉัน (ไลฟ์เทคโนโลยีส์) ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 นาทีก่อนที่จะติดเชื้อและ titer ไวรัสที่ถูกวัดโดยใช้การทดสอบ ELISA p24 (PerkinElmer, เคมบริดจ์, ประเทศสหรัฐอเมริกา) เซลล์ที่มีระดับการแสดงออกหรือการลดลงของ MRJ-L ถูกปรับขนาดเพื่อปรับหมายเลขโทรศัพท์มือเท่ากันและ 1 × 106 เซลล์มีการติดเชื้อความเครียด M-เขตร้อนของเชื้อ HIV-1 (เทียบเท่ากับ 25 เส้นทางของแอนติเจน p24) ที่ 37 ° C เป็นเวลา 2 ชั่วโมง หลังจากล้างสามครั้งกับพีบีเอสเซลล์ได้รับการเก็บรักษาไว้ใน RPMI1640 / 2% FBS และครึ่งหนึ่งของกลางถูกเปลี่ยนทุกสามวัน supernatants วัฒนธรรมถูกเก็บรวบรวมทุกสามวันสำหรับปริมาณของแอนติเจน p24 โดยเอชไอวี 1 p24 วิธี ELISA (PerkinElmer). 2.5 การวิเคราะห์ทางสถิติระดับนัยสำคัญตั้งอยู่ที่ 0.05 และค่า P เป็นปัจจัย twotailed.Risk เชื้อเอชไอวี 1 ที่ได้มาวิเคราะห์โดยใช้การถดถอยโลจิสติกที่เรียบง่ายตามแบบเบย์หลายถดถอยโลจิสติเพราะข้อมูลที่เบาบาง ถดถอยโลจิสติง่ายได้รับการดำเนินการโดยใช้ซอฟแวร์ Stata (รุ่น 13 StataCorp, คอลเลจสเตชัน) หรือWinBUGS (เวอร์ชัน 1.4.3; MRC ชีวสถิติหน่วยเคมบริดจ์ประเทศอังกฤษ) เมื่อมีข้อมูลที่เบาบาง การวิเคราะห์การถดถอยพหุคูณแบบเบย์ได้ดำเนินการโดยใช้แพคเกจซอฟต์แวร์ WinBUGS. 2.6 วิจัยจริยธรรมการศึกษาครั้งนี้เป็นไปตามบทบัญญัติของปฏิญญาเฮลซิงกิ 1975 และได้รับการอนุมัติจากคณะกรรมการตรวจสอบของสถาบันแห่งชาติไต้หวันโรงพยาบาลมหาวิทยาลัย (NTUH-201102003RC) และแม็คเคย์อนุสรณ์โรงพยาบาล (13MMHIS039). ผู้ป่วยทุกรายให้ความยินยอมเป็นลายลักษณ์อักษรก่อนที่พวกเขามีส่วนร่วมใน การศึกษาครั้งนี้
การแปล กรุณารอสักครู่..
2. Materials and Methods
2.1. Participant Recruitment and Serologic Screening for HIV Infection
Self-completed questionnaires and blood samples were collected from anonymous participants at commercial male homosexual venues of Taipei and NewTaipei City on weekends. The questionnaires included measures of demographics, HIV testing history and sexual risk behavior(Supplementary Table 1). A total of 1200 study participants received
pretest counseling, were informed about the purpose of this study and gave written informed consent.
HIV diagnosis was made using a recombinant HIV enzyme immunoassay (Murex Diagnostics Limited,Dartford, UK). Positive test results were confirmed by HIV western blot 2.2 (Genelab Technologies, Inc., Singapore). In addition, positive
ตัวอย่างเลือดถูกทดสอบในกลุ่ม . ตามปกติเลือดทุก 3 เดือน จำนวน 89 ผู้ติดเชื้อเอดส์ . ของกลุ่มตัวอย่างระบุเป็น seroconverted ภายใน
ก่อน 6 เดือน 20 ของอำนาจการคัดเลือกเข้าร่วมการศึกษาการประเมิน thismrj-l . อีก 30 คน สุ่มเลือกมาก่อน อย่างใกล้ชิดการศึกษานี้ดำเนินการด้วยความเห็นชอบของคณะกรรมการสถาบันทบทวน
ของ Mackay โรงพยาบาลเมโมเรียล , ไทเป , ไต้หวัน .
. . เซลล์มะเร็งและเซลล์การเตรียม
หลังจากที่ได้รับความยินยอม , CD4 T เม็ดเลือดขาว cd14 โมโนไซทและที่แยกได้จากเลือดและนำไปตรวจสุขภาพผู้ติดเชื้อเอชไอวี โดยการ ficoll ปั๊ก ( GE Healthcare ชีวิตวิทยาศาสตร์ , Pittsburgh , PA , USA) using CD4 /CD14 magnetic microbeads(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany). Laboratory personnel were blind to the identity and HIV-1 infection status of blood donors.To induce macrophage differentiation, monocytes isolated from donors
were maintained in RPMI1640 supplemented with 10% human AB serum, 5% fetal bovine serum (FBS), and 50 ng/mL M-CSF(PeproTech,Rocky Hill, NJ,สหรัฐอเมริกา ) เจ็ดวัน jurkat เซลล์เพาะเลี้ยงในอาหารที่มี rpmi1640 10% FBS นอกจากนี้ phytohaemagglutinin ( PHA ) ถูกเพิ่มเพื่อกระตุ้น jurkat เซลล์ thp-1 ( monocyte เซลล์เส้น ) และ u937 เซลล์เพาะเลี้ยงใน rpmi1640 ( เทคโนโลยี , ชีวิตในเกาะแกรนด์ , นิวยอร์ก , สหรัฐอเมริกา ) เสริมด้วย FBS 10% และ DMSO 2 มิลลิเมตร 293 T เซลล์เพาะเลี้ยงใน dmem ( เทคโนโลยี ) เสริมด้วย 10% FBS To induce differentiation of U937 cells into macrophage-like cells, 200 μM phorbol myristate acetate (PMA) mitogen was added to the culture medium, and the cells were harvested after 48 h.
2.3. Plasmids
The plasmid pEGFP–Vpr was constructed by inserting the Vpr gene amplified from the HIV-1 pNL4-3 clone into the appropriate vectors.การ ha-mrj-l ha-mrj-s ) และถูกสร้างขึ้นในช่วง pcdna เวกเตอร์ การ lentiviral การแสดงออกของเวกเตอร์ mrj-l ก่อสร้างใน plko_as3w.puro เวกเตอร์ ที่ได้รับ mrj-l 3 UTR shrna ( shj8_5 ' - gcgcagatggctaactgagta ) ถูกออกแบบโดยใช้ invivogen v3.1 บริษัทซอฟแวร์ตัวช่วยสร้าง และสร้างใน plko.1-puro เวกเตอร์ ( ที่ได้รับจากชาติหาหลักศูนย์วิชาการซินิกา ไต้หวัน )ทั้งหมดได้รับการยืนยันโดยการสร้างอัตลักษณ์แทรกทั้งหมด
2.4 . การผลิตและการติดเชื้อไวรัสเป็นไวรัสเซลล์ T
~ ( 2 × 106 ) transfected 2 μกรัม p125 ( สายพันธุ์ m-tropic , Ada ) เพื่อใช้ lipofectamine 2000 และ supernatants ถูกเก็บเกี่ยวที่อายุ 48 ชั่วโมงหลังค .ไวรัสที่ได้รับ 2 U / ml ( เทคโนโลยีตรวจหา ADNase ชีวิต ) ที่อุณหภูมิ 37 องศา C เป็นเวลา 30 นาทีก่อนที่จะติดเชื้อ และระดับปริมาณไวรัสได้โดยใช้วิธี ELISA ( Perkinelmer ทัม p24 , , MA , USA ) เซลล์ที่มีมาแสดง หรือลดระดับของ mrj-l pH ปรับเบอร์มือถือที่เท่าเทียมกัน and 1 × 106 cells were infected with M-tropic strain of HIV-1 (equivalent to 25 ng of p24 antigen) at 37 °C for 2 h. After washing three times with PBS, cells were maintained in RPMI1640/2% FBS and half of the medium was replaced every three days. Culture supernatants were collected every three days for quantification of p24 antigen by HIV-1 p24 ELISA(PerkinElmer).
2.5. Statistical Analysis
ระดับนัยสำคัญทางสถิติที่ 0.05 และค่า P ( twotailed ปัจจัยความเสี่ยงสำหรับการติดเชื้อ วิเคราะห์ข้อมูลโดยใช้การถดถอยโลจิสติกที่เรียบง่ายตามแบบการถดถอยโลจิสติกเพราะข้อมูลป่าโปร่ง การถดถอยโลจิสติกที่ง่ายโดยใช้ซอฟต์แวร์ Language ( รุ่น 13 statacorp วิทยาลัยสถานีเท็กซัส ) หรือ
winbugs ( รุ่น 1.4.3 ; หน่วยของ MRC ชีวสถิติเคมบริดจ์ , อังกฤษ ) เมื่อมีข้อมูลมาก . และการวิเคราะห์ถดถอยพหุคูณแบบมีวัตถุประสงค์การใช้แพคเกจซอฟต์แวร์ winbugs
2.6 จริยธรรมวิจัย
การศึกษานี้สอดคล้องกับบทบัญญัติของปฏิญญาเฮลซิงกิ 1975 และได้รับการอนุมัติโดยคณะกรรมการของสถาบันของโรงพยาบาลมหาวิทยาลัยแห่งชาติไต้หวัน ( ntuh-201102003rc ) และโรงพยาบาล Mackay Memorial ( 13mmhis039 )
All patients gave written consents before they participated in this study.
2.1. Participant Recruitment and Serologic Screening for HIV Infection
Self-completed questionnaires and blood samples were collected from anonymous participants at commercial male homosexual venues of Taipei and NewTaipei City on weekends. The questionnaires included measures of demographics, HIV testing history and sexual risk behavior(Supplementary Table 1). A total of 1200 study participants received
pretest counseling, were informed about the purpose of this study and gave written informed consent.
HIV diagnosis was made using a recombinant HIV enzyme immunoassay (Murex Diagnostics Limited,Dartford, UK). Positive test results were confirmed by HIV western blot 2.2 (Genelab Technologies, Inc., Singapore). In addition, positive
ตัวอย่างเลือดถูกทดสอบในกลุ่ม . ตามปกติเลือดทุก 3 เดือน จำนวน 89 ผู้ติดเชื้อเอดส์ . ของกลุ่มตัวอย่างระบุเป็น seroconverted ภายใน
ก่อน 6 เดือน 20 ของอำนาจการคัดเลือกเข้าร่วมการศึกษาการประเมิน thismrj-l . อีก 30 คน สุ่มเลือกมาก่อน อย่างใกล้ชิดการศึกษานี้ดำเนินการด้วยความเห็นชอบของคณะกรรมการสถาบันทบทวน
ของ Mackay โรงพยาบาลเมโมเรียล , ไทเป , ไต้หวัน .
. . เซลล์มะเร็งและเซลล์การเตรียม
หลังจากที่ได้รับความยินยอม , CD4 T เม็ดเลือดขาว cd14 โมโนไซทและที่แยกได้จากเลือดและนำไปตรวจสุขภาพผู้ติดเชื้อเอชไอวี โดยการ ficoll ปั๊ก ( GE Healthcare ชีวิตวิทยาศาสตร์ , Pittsburgh , PA , USA) using CD4 /CD14 magnetic microbeads(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany). Laboratory personnel were blind to the identity and HIV-1 infection status of blood donors.To induce macrophage differentiation, monocytes isolated from donors
were maintained in RPMI1640 supplemented with 10% human AB serum, 5% fetal bovine serum (FBS), and 50 ng/mL M-CSF(PeproTech,Rocky Hill, NJ,สหรัฐอเมริกา ) เจ็ดวัน jurkat เซลล์เพาะเลี้ยงในอาหารที่มี rpmi1640 10% FBS นอกจากนี้ phytohaemagglutinin ( PHA ) ถูกเพิ่มเพื่อกระตุ้น jurkat เซลล์ thp-1 ( monocyte เซลล์เส้น ) และ u937 เซลล์เพาะเลี้ยงใน rpmi1640 ( เทคโนโลยี , ชีวิตในเกาะแกรนด์ , นิวยอร์ก , สหรัฐอเมริกา ) เสริมด้วย FBS 10% และ DMSO 2 มิลลิเมตร 293 T เซลล์เพาะเลี้ยงใน dmem ( เทคโนโลยี ) เสริมด้วย 10% FBS To induce differentiation of U937 cells into macrophage-like cells, 200 μM phorbol myristate acetate (PMA) mitogen was added to the culture medium, and the cells were harvested after 48 h.
2.3. Plasmids
The plasmid pEGFP–Vpr was constructed by inserting the Vpr gene amplified from the HIV-1 pNL4-3 clone into the appropriate vectors.การ ha-mrj-l ha-mrj-s ) และถูกสร้างขึ้นในช่วง pcdna เวกเตอร์ การ lentiviral การแสดงออกของเวกเตอร์ mrj-l ก่อสร้างใน plko_as3w.puro เวกเตอร์ ที่ได้รับ mrj-l 3 UTR shrna ( shj8_5 ' - gcgcagatggctaactgagta ) ถูกออกแบบโดยใช้ invivogen v3.1 บริษัทซอฟแวร์ตัวช่วยสร้าง และสร้างใน plko.1-puro เวกเตอร์ ( ที่ได้รับจากชาติหาหลักศูนย์วิชาการซินิกา ไต้หวัน )ทั้งหมดได้รับการยืนยันโดยการสร้างอัตลักษณ์แทรกทั้งหมด
2.4 . การผลิตและการติดเชื้อไวรัสเป็นไวรัสเซลล์ T
~ ( 2 × 106 ) transfected 2 μกรัม p125 ( สายพันธุ์ m-tropic , Ada ) เพื่อใช้ lipofectamine 2000 และ supernatants ถูกเก็บเกี่ยวที่อายุ 48 ชั่วโมงหลังค .ไวรัสที่ได้รับ 2 U / ml ( เทคโนโลยีตรวจหา ADNase ชีวิต ) ที่อุณหภูมิ 37 องศา C เป็นเวลา 30 นาทีก่อนที่จะติดเชื้อ และระดับปริมาณไวรัสได้โดยใช้วิธี ELISA ( Perkinelmer ทัม p24 , , MA , USA ) เซลล์ที่มีมาแสดง หรือลดระดับของ mrj-l pH ปรับเบอร์มือถือที่เท่าเทียมกัน and 1 × 106 cells were infected with M-tropic strain of HIV-1 (equivalent to 25 ng of p24 antigen) at 37 °C for 2 h. After washing three times with PBS, cells were maintained in RPMI1640/2% FBS and half of the medium was replaced every three days. Culture supernatants were collected every three days for quantification of p24 antigen by HIV-1 p24 ELISA(PerkinElmer).
2.5. Statistical Analysis
ระดับนัยสำคัญทางสถิติที่ 0.05 และค่า P ( twotailed ปัจจัยความเสี่ยงสำหรับการติดเชื้อ วิเคราะห์ข้อมูลโดยใช้การถดถอยโลจิสติกที่เรียบง่ายตามแบบการถดถอยโลจิสติกเพราะข้อมูลป่าโปร่ง การถดถอยโลจิสติกที่ง่ายโดยใช้ซอฟต์แวร์ Language ( รุ่น 13 statacorp วิทยาลัยสถานีเท็กซัส ) หรือ
winbugs ( รุ่น 1.4.3 ; หน่วยของ MRC ชีวสถิติเคมบริดจ์ , อังกฤษ ) เมื่อมีข้อมูลมาก . และการวิเคราะห์ถดถอยพหุคูณแบบมีวัตถุประสงค์การใช้แพคเกจซอฟต์แวร์ winbugs
2.6 จริยธรรมวิจัย
การศึกษานี้สอดคล้องกับบทบัญญัติของปฏิญญาเฮลซิงกิ 1975 และได้รับการอนุมัติโดยคณะกรรมการของสถาบันของโรงพยาบาลมหาวิทยาลัยแห่งชาติไต้หวัน ( ntuh-201102003rc ) และโรงพยาบาล Mackay Memorial ( 13mmhis039 )
All patients gave written consents before they participated in this study.
การแปล กรุณารอสักครู่..
ภาษาอื่น ๆ
การสนับสนุนเครื่องมือแปลภาษา: กรีก, กันนาดา, กาลิเชียน, คลิงออน, คอร์สิกา, คาซัค, คาตาลัน, คินยารวันดา, คีร์กิซ, คุชราต, จอร์เจีย, จีน, จีนดั้งเดิม, ชวา, ชิเชวา, ซามัว, ซีบัวโน, ซุนดา, ซูลู, ญี่ปุ่น, ดัตช์, ตรวจหาภาษา, ตุรกี, ทมิฬ, ทาจิก, ทาทาร์, นอร์เวย์, บอสเนีย, บัลแกเรีย, บาสก์, ปัญจาป, ฝรั่งเศส, พาชตู, ฟริเชียน, ฟินแลนด์, ฟิลิปปินส์, ภาษาอินโดนีเซี, มองโกเลีย, มัลทีส, มาซีโดเนีย, มาราฐี, มาลากาซี, มาลายาลัม, มาเลย์, ม้ง, ยิดดิช, ยูเครน, รัสเซีย, ละติน, ลักเซมเบิร์ก, ลัตเวีย, ลาว, ลิทัวเนีย, สวาฮิลี, สวีเดน, สิงหล, สินธี, สเปน, สโลวัก, สโลวีเนีย, อังกฤษ, อัมฮาริก, อาร์เซอร์ไบจัน, อาร์เมเนีย, อาหรับ, อิกโบ, อิตาลี, อุยกูร์, อุสเบกิสถาน, อูรดู, ฮังการี, ฮัวซา, ฮาวาย, ฮินดี, ฮีบรู, เกลิกสกอต, เกาหลี, เขมร, เคิร์ด, เช็ก, เซอร์เบียน, เซโซโท, เดนมาร์ก, เตลูกู, เติร์กเมน, เนปาล, เบงกอล, เบลารุส, เปอร์เซีย, เมารี, เมียนมา (พม่า), เยอรมัน, เวลส์, เวียดนาม, เอสเปอแรนโต, เอสโทเนีย, เฮติครีโอล, แอฟริกา, แอลเบเนีย, โคซา, โครเอเชีย, โชนา, โซมาลี, โปรตุเกส, โปแลนด์, โยรูบา, โรมาเนีย, โอเดีย (โอริยา), ไทย, ไอซ์แลนด์, ไอร์แลนด์, การแปลภาษา.
- คุณแม่ของฉันสามารถทำอาหารได้
- ไพลิน
- six thirty
- fulfilled
- ที่สุดของความฟิน
- เมื่อวันที่ 9 สิงหาคม 2014. มีผู้โดยสารจ
- บรูไน หนึ่งในประเทศสมาชิกอาเซียน มีชื่อป
- เรื่องราวความกลัว
- ลูกอม
- 08.00 น. ออกเดินทางเข้าชม อนุสาวรีย์ปราบ
- และก่อนวันจริงรู้สึกมีความสุขมากเพราะทั้
- เวลาทีคุณแชทมาหาฉัน ฉันยังสนใจคุณแต่เลาฉ
- แบบว่าไง
- และฉันคิดว่าคุณเคยเจอเหตุการณ์นี้เหมือนฉ
- Several recommender algorithms present c
- ประวัติการศึกษา
- Slowry,he moved down the stairs
- ฉันขอเขาเป็นเพื่อนนานแล้วแต่เขาไม่รับ
- การวิจยในคร ั ้ังน้ีมีวตถั ุประสงค์เพื่อ
- sections
- ซาวข้าว
- Part 8—The Gene Technology Technical Adv
- ซาวข้าว
- thx for trade
