Allsoyproteinsampleswereanalyzedbys

Allsoyproteinsampleswereanalyzedbysodium-dodecylsulfate-polyacrylamidegelelectrophoresis(SDS-PAGE).Then, pig immune reaction to soy proteins was analyzed in 2 ways. First, plasma from pigs fed the FSBM-0 diet was exposed to thesoyproteinsoftheeightsoybeansourcesbyaWesternblotanalysis;thisanalysiswasqualitativeandprovidedavisual determination of the immune reactive proteins. Secondly, a pooled plasma sample of 16 pigs per treatment was assayed in triplicate for the quantification of immunoreactivity to soy proteins by indirect enzyme linked immunosorbent assay (ELISA); the control plasma was from pigs fed the diet without soy protein (PCON). Analysis of soy protein samples by SDS-PAGE used 16.5% Tris–tricine–polypeptide ready gels in Mini Protean Cell III (BioradLaboratories,Hercules,CA)withTris–tricine–SDSbufferastherunningbuffer.Samples(45gprotein)werediluted with tricine sample buffer (Biorad Laboratories, Hercules, CA) with 2% -mercaptoethanol and boiled for 4min prior to loading. A pre-stained Kaleidoscope polypeptide standard (Biorad Laboratories, Hercules, CA) was used. Two gels were run simultaneously (100V, 100min), one was fixed with 10% acetic acid and 40% methanol for 30min, stained with BioSafeTM Coomasie G250 (Biorad Laboratories, Hercules, CA) for at least 1h and destained with 10% acetic acid for 30min. The destained gel was washed with deionized water and the gel picture was taken with a Kodak Image station 440 CF (Eastman Kodak Company, New Haven, CT). The other gel was transblotted onto a polyvinylidene fluoride membrane for Western blot analysis. Proteins for Western blot analysis were transferred to a polyvinylidene fluoride membrane (Biorad Laboratories,Hercules,CA)intransferbuffer(25mMTris,pH8.3,192mMglycine)usingWesternsandwichassemblyfor1h at4◦Cusing100V.Afterthetransfer,themembranewasblockedwith5%non-fatdrymilkinTris-bufferedsalinecontaining 0.1% Tween 20 (TBST) for 1h. Then, the membrane was washed twice for 15min with TBST buffer and incubated for 1h with individual plasmas (1:20) from pigs fed different diets. The membrane was washed twice for 15min with TBST and the secondary antibody rabbit-anti-pig-IgG alkaline phosphatase (1:1000) was incubated for 1h. Then the membrane was washed with TBST and prepared for detection using an Immun-Star Chemiluminescent Substrate solution (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) following the manufacturer’s instructions. Intensity of the bands was visualized in a Kodak Image Station440CF(EastmanKodakCo.,NewHaven,CT).Fordetectionofnon-specificbinding,afreeze-driedIgGwholemolecule (Sigma, St. Louis, MO) was used (1:20). For indirect ELISA, 100L of diluted soy protein extract (1:2) were plated on a 96-well plate and stored at 4◦C for at least14h.Theplatewasthenwashedwith0.01MPBSwith0.05%Tween20,pH7.4,usingELX50AutoStripWasher(Biotek Instruments, Winooski, VT). Immediately after that, the plate was blocked by incubating with 300L of 5% BSA in TBS1% Tween 20 (TBST) for 1h. The plate was washed and incubated with 100L of pig plasma (1:5) for 1h at 37◦C. After washing, the plate was incubated with 100L of rabbit-anti-pig-IgG alkaline phosphatase (Sigma, St. Louis, MO) (1:5000) for 1h at room temperature. After washing, the color was developed by adding 100L of color reagent p-nitrophenyl phosphate (Sigma, St. Louis, MO). The absorbance was read at 405nm after 20min incubation using an ELISA plate reader ELX 808 IU (Biotek Instruments, Winooski, VT). The reaction was stopped by adding 100L of 3N NaOH at 25min and read again at 35min. All washings were done with 300L of washing solution, 6 times per well at the lowest dispensing rate (150L/well/s) and aspiration rate (5mm/s) to avoid protein detachment.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

Allsoyproteinsampleswereanalyzedbysodium-dodecylsulfate-polyacrylamidegelelectrophoresis(SDS-PAGE) แล้ว ปฏิกิริยาภูมิคุ้มกันของหมูกับโปรตีนถั่วเหลืองถูกวิเคราะห์ใน 2 วิธี ครั้งแรก จากสุกรที่เลี้ยงด้วยอาหาร FSBM-0 ษทมัความ thesoyproteinsoftheeightsoybeansourcesbyaWesternblotanalysis กำหนด thisanalysiswasqualitativeandprovidedavisual ของโปรตีนปฏิกิริยาภูมิคุ้มกัน ประการที่สอง ตัวอย่างพลาสม่า pooled 16 สุกรต่อการรักษาถูก assayed ลข้อสำหรับ quantification ของ immunoreactivity กับโปรตีนถั่วเหลือง โดยเอนไซม์ทางอ้อมเชื่อมโยง immunosorbent assay (ELISA); พลาสม่าควบคุมมาจากสุกรที่เลี้ยงด้วยอาหารไม่ มีโปรตีนถั่วเหลือง (PCON) วิเคราะห์ตัวอย่างโปรตีนถั่วเหลืองโดย SDS-หน้าใช้เจลพร้อมทริสเรทติ้ง – tricine – polypeptide 16.5% ในมินิ Protean เซลล์ III (werediluted (45 gprotein) BioradLaboratories,Hercules,CA)withTris–tricine–SDSbufferastherunningbuffer.Samples กับ tricine ตัวอย่างบัฟเฟอร์ (Biorad Laboratories เฮอร์คิวลิส CA) กับ 2% - mercaptoethanol และต้มสำหรับ 4 นาทีก่อนโหลด ใช้ย้อมก่อนลานตา polypeptide มาตรฐาน (ห้องปฏิบัติการ Biorad เฮอร์คิวลิส CA) สองเจถูกเรียกใช้พร้อมกัน (100V, 100 นาที), คือ fixed กับ 10% กรดอะซิติกและ 40% เมทานอล 30 นาที ย้อม ด้วย BioSafeTM Coomasie G250 (Biorad Laboratories เฮอร์คิวลิส CA) อย่างน้อย 1 ชั่วโมง และ destained กับกรดอะซิติก 10% 30 นาที เจ destained ถูกล้างจุน้ำ และถ่ายภาพเจกับ CF สถานี 440 ภาพ Kodak (บริษัทอีสต์แมนโกดัก New Haven, CT) เจอื่น ๆ ก็ transblotted ลงบนเยื่อ fluoride polyvinylidene วิเคราะห์ตะวันตกน้า โปรตีนสำหรับการวิเคราะห์น้าตะวันตกถูกโอนย้ายไป polyvinylidene fluoride เมมเบรน (Biorad Laboratories เฮอร์คิวลิส CA) intransferbuffer (25mMTris, pH8.3, 192mMglycine) usingWesternsandwichassemblyfor1h at4◦Cusing100V.Afterthetransfer,themembranewasblockedwith5%non-fatdrymilkinTris-bufferedsalinecontaining 0.1% แต่ 20 (TBST) สำหรับ 1h แล้ว เมมเบรนล้างสองครั้งสำหรับ 15 นาทีด้วยบัฟเฟอร์ TBST และได้รับการกก h 1 กับ plasmas ละ (1:20) จากสุกรที่เลี้ยงด้วยอาหารที่แตกต่างกัน เมมเบรนถูกล้างสองครั้งสำหรับ 15 นาทีด้วย TBST และการรองแอนติบอดีกระต่ายป้องกันหมู-IgG ด่าง phosphatase (1: 1000) incubated สำหรับ 1 h แล้ว เมมเบรนถูกล้าง ด้วย TBST และเตรียมพร้อมสำหรับการตรวจจับโดยใช้พื้นผิว Chemiluminescent Immun ดาวโซลูชั่น (GE แพทย์ บักกิงแฮมเชอร์ UK) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ความเข้มของวงดนตรีถูกแสดงเป็นภาพใน Station440CF(EastmanKodakCo.,NewHaven,CT) เป็นภาพ Kodak Fordetectionofnon-specificbinding, afreeze-driedIgGwholemolecule (ซิกม่า เซนต์หลุยส์ MO) ถูกใช้ (1:20) สำหรับอ้อม ELISA, L 100 ของสารสกัดจากโปรตีนถั่วเหลืองที่เจือจาง (1:2) ได้ชุบบนจานหลุม 96 และเก็บไว้ที่ 4◦C สำหรับที่ least14h Theplatewasthenwashedwith0.01MPBSwith0.05%Tween20,pH7.4,usingELX50AutoStripWasher (เครื่องมือ Biotek, Winooski, VT) ทันทีหลังจากที่ จานถูกบล็อก โดย incubating กับ L 300 ของบีเอสเอ 5% TBS1% 20 โลก (TBST) สำหรับ 1h แผ่นล้าง และรับการกกกับ L 100 ของพลาสม่าหมู (1:5) สำหรับ h 1 ที่ 37◦C หลังจากซักผ้า จาน incubated มี L 100 ของกระต่ายป้องกันหมู-IgG ด่าง phosphatase (ซิกม่า เซนต์หลุยส์ MO) (1:5000) สำหรับ 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง หลังจากซักผ้า สีที่ถูกพัฒนาขึ้น โดยเพิ่ม 100 L ของสีน้ำยาฟอสเฟต p nitrophenyl (ซิกม่า เซนต์หลุยส์ MO) ค่าที่ถูกอ่านที่ 405nm หลังกกไข่ประมาณ 20 นาทีโดยใช้ตัวอ่านแผ่น ELISA ELX 808 IU (เครื่องมือ Biotek, Winooski, VT) ปฏิกิริยาถูกหยุด โดยการเพิ่ม L 100 ของ NaOH 3 คืนเวลา 25 นาที และอ่านอีกครั้งที่ 35 นาที ซักทั้งหมดถูกทำกับ L 300 ล้างโซลูชัน 6 ครั้งต่อที่ราคาจ่ายต่ำสุด (150 L/เช่น/s) และอัตราความทะเยอทะยาน (5mm/s) เพื่อหลีกเลี่ยงโปรตีนออก

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

หมูปฏิกิริยาภูมิคุ้มกันโปรตีนเกษตรได้รับการวิเคราะห์ใน 2 วิธี ครั้งแรก, พลาสม่าจากสุกรอาหาร FSBM-0 ได้สัมผัสกับ ความมุ่งมั่นของโปรตีนปฏิกิริยาภูมิคุ้มกัน ประการที่สองตัวอย่างพลาสม่า 16 pooled สุกรต่อการรักษาได้รับการวิเคราะห์ในเพิ่มขึ้นสามเท่าสำหรับไอออนบวก Fi quanti ของภูมิคุ้มกันโปรตีนถั่วเหลืองโดยเอนไซม์อิมมูโนอ้อมที่เชื่อมโยง assay (ELISA); ควบคุมพลาสม่ามาจากการรับประทานอาหารสุกรโดยไม่ต้องโปรตีนถั่วเหลือง (PCON) การวิเคราะห์ตัวอย่างโปรตีนถั่วเหลืองโดยวิธี SDS-PAGE ใช้ 16.5% Tris-tricine-polypeptide เจลพร้อมในมินิ Protean มือถือ III กับบัฟเฟอร์ตัวอย่าง tricine (Biorad ห้องปฏิบัติการ, Hercules, CA) กับ 2%? -mercaptoethanol และต้มก่อนที่จะ 4min โหลด ก่อนการย้อมสี Kaleidoscope polypeptide มาตรฐาน (Biorad ห้องปฏิบัติการ, Hercules, CA) ถูกนำมาใช้ สองเจลวิ่งไปพร้อม ๆ กัน (100V, 100min) หนึ่ง Fi ถูกคงมีกรดอะซิติก 10% และเมทานอล 40% สำหรับ 30min, ย้อมด้วยสี BioSafeTM Coomasie G250 (Biorad ห้องปฏิบัติการ, Hercules, CA) อย่างน้อย 1H และ destained ด้วยกรดอะซิติก 10% สำหรับ 30 นาที เจล destained ถูกล้างด้วยน้ำปราศจากไอออนและภาพเจลที่ถูกถ่ายด้วยกล้อง Kodak Station ภาพที่ 440 CF (Eastman Kodak Company, New Haven, CT) เจลอื่น ๆ ได้รับการ transblotted บน Polyvinylidene เมมเบรน uoride ชั้นสำหรับการวิเคราะห์ดวงตะวัน โปรตีนสำหรับการวิเคราะห์ดวงตะวันถูกโอนไปยัง Polyvinylidene FL uoride เมมเบรน (Biorad 0.1% Tween 20 (TBST) สำหรับ 1H. แล้วเมมเบรนถูกล้างสองครั้งสำหรับ 15 นาทีกับบัฟเฟอร์ TBST และบ่ม 1H กับพลาสม่าของแต่ละบุคคล (01:20) จากสุกรที่เลี้ยงด้วยอาหารที่แตกต่างกัน. เมมเบรนถูกล้างสองครั้งสำหรับ 15 นาทีกับ TBST และ แอนติบอดีรองกระต่ายป้องกันหมู IgG อัลคาไลน์ฟอสฟา (1: 1000). ได้รับการบ่ม 1H แล้วเมมเบรนถูกล้างด้วย TBST และเตรียมความพร้อมสำหรับการตรวจสอบการใช้วิธีการแก้ปัญหา IMMUN-Star chemiluminescent พื้นผิว (GE Healthcare, Buckinghamshire สหราชอาณาจักร) ดังต่อไปนี้ คำแนะนำของผู้ผลิต. ความรุนแรงของวงดนตรีที่ได้รับการมองเห็นในภาพ Kodak (Sigma, St. Louis, มิสซูรี) ถูกนำมาใช้ (01:20) สำหรับทางอ้อม ELISA 100 L ของสารสกัดจากโปรตีนถั่วเหลืองปรับลด (1: 2). ถูกชุบบนแผ่น 96 หลุมและเก็บไว้ที่4◦Cอย่าง least14h.Theplatewasthenwashedwith0.01MPBSwith0.05% Tween20, pH7.4, usingELX50AutoStripWasher (Biotek เครื่องดนตรี, นุ, VT). ทันทีหลังจากที่จานถูกบล็อกโดยฟักกับ 300 ลิตร 5% BSA ใน TBS1% Tween 20 (TBST) . สำหรับ 1H จานถูกล้างและบ่มด้วย 100 ลิตรพลาสม่าหมู (1: 5)?. สำหรับ 1H ที่37◦Cหลังจากล้างจานถูกบ่มด้วย 100 ลิตร phosphatase กระต่ายป้องกันหมู IgG อัลคาไลน์ (? Sigma, St. Louis, มิสซูรี) (1:. 5000) สำหรับ 1H ที่อุณหภูมิห้องหลังจากล้างสีได้รับการพัฒนาโดยการเพิ่ม 100 ลิตรน้ำยาสี P-Nitrophenyl ฟอสเฟต (Sigma, St. Louis, มิสซูรี) ค่าการดูดกลืน?. ได้อ่านที่ 405nm หลังจากการบ่ม 20min ใช้อ่านวิธี ELISA แผ่น ELX 808 IU (Biotek เครื่องดนตรี, นุ, VT). ปฏิกิริยาก็หยุดโดยการเพิ่ม 100 ลิตร 3N NaOH ใน 25 นาทีและอ่านอีกครั้งที่ 35min. ล้างทั้งหมดถูกทำด้วย 300 ? L ของการแก้ปัญหาซักผ้า, 6 ครั้งต่อกันในอัตราจ่ายต่ำสุด (150 L / ดี / s) และอัตราความทะเยอทะยาน (5mm / s) เพื่อหลีกเลี่ยงการปลดโปรตีน

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

allsoyproteinsampleswereanalyzedbysodium dodecylsulfate polyacrylamidegelelectrophoresis ( SDS-PAGE ) แล้ว หมูภูมิคุ้มกันปฏิกิริยากับโปรตีนถั่วเหลืองถูกวิเคราะห์ใน 2 วิธี แรก , พลาสมาจากสุกรที่ได้รับอาหาร fsbm-0 เปิดเผย thesoyproteinsoftheeightsoybeansourcesbyawesternblotanalysis การหา thisanalysiswasqualitativeandprovidedavisual ของภูมิคุ้มกันรีแอกทีฟโปรตีน ประการที่สอง รวมพลาสมาตัวอย่าง 16 หมูต่อการเอนไซม์ทั้งสามใบสำหรับการแลกเปลี่ยนของการไฟฟ้าจึงให้โปรตีนถั่วเหลืองโดยเอนไซม์เชื่อมโยงทางอ้อม immunosorbent assay ( ELISA ) ; พลาสม่าควบคุมจากสุกรที่ได้รับอาหารที่ไม่มีโปรตีนถั่วเหลือง ( pcon ) การวิเคราะห์โปรตีนของถั่วเหลืองตัวอย่างถูกใช้ 16.5% ณไตรซีน–– polypeptide พร้อมเจลในขนาดเล็กเซลล์ซึ่งเปลี่ยนแปลงได้มาก 3 ( bioradlaboratories , Hercules , CA ) withtris –ไตรซีน– sdsbufferastherunningbuffer ตัวอย่าง ( 45gprotein ) werediluted กับไตรซีนบัฟเฟอร์ตัวอย่าง ( biorad ห้องปฏิบัติการ , Hercules , CA ) ร้อยละ 2 - mercaptoethanol และต้มให้ 4min ก่อนโหลด . ก่อนย้อมมาตรฐาน polypeptide Kaleidoscope ( biorad ห้องปฏิบัติการ , Hercules , CA ) คือใช้ 2 เจลถูกเรียกพร้อมกัน ( 100V 100min , ) เป็นกรดจึง xed 10% และ 40% เมทานอลเป็นเวลา 30 นาที ย้อมด้วย biosafetm coomasie g250 ( biorad ห้องปฏิบัติการ , Hercules , CA ) สำหรับที่ 1 น้อยที่สุด และ destained 10% กรดสำหรับ 30 นาทีที่ destained เจลล้างด้วยน้ำคล้ายเนื้อเยื่อประสานและ เจล ภาพนี้ถูกถ่ายด้วย Kodak ภาพสถานี 440 CF ( Eastman Kodak บริษัท ท่าใหม่ , CT ) เจลอื่น ๆคือ transblotted บนีนfl uoride เมมเบรนสำหรับการวิเคราะห์ Western blot . โปรตีนสำหรับการวิเคราะห์ Western blot ถูกโอนไปยังีนfl uoride เมมเบรน ( biorad ห้องปฏิบัติการ , Hercules , CA ) intransferbuffer ( 25mmtris ph8.3192mmglycine , ) usingwesternsandwichassemblyfor1h at4 ◦ cusing100v . afterthetransfer themembranewasblockedwith5 % , ไม่ fatdrymilkintris bufferedsalinecontaining 0.1% Tween 20 ( tbst ) สำหรับ 1 ชั่วโมง จากนั้น เยื่อแผ่นล้างสองครั้งสำหรับ 15 นาทีกับ tbst บัฟเฟอร์โดยสำหรับ 1 คน ( 1 : 20 ) กับพลาสมาจากสุกรที่ได้รับอาหารที่แตกต่างกัน เยื่อแผ่นล้างสองครั้งสำหรับ 15 นาทีกับ tbst และระดับแอนติบอดีต่อต้านกลุ่มกระต่ายหมู alkaline phosphatase ( 000 ) คือ บ่มให้ 1 ชั่วโมง แล้วล้างด้วย tbst เตรียมเมมเบรนและการตรวจหาภูมิต้านทานดาวใช้ chemiluminescent พื้นผิวโซลูชั่น ( GE สุขภาพ , เหมือนเดิม , UK ) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ความเข้มของวงถูกมองเห็นใน Kodak ภาพ station440cf ( eastmankodakco . Newhaven , CT ) fordetectionofnon กาจึง cbinding afreeze , driediggwholemolecule ( Sigma , St . Louis , MO ) คือใช้ ( 1 ) สำหรับวิธี indirect ELISA 100L เมื่อ , โปรตีนถั่วเหลือง ( 2 ) ชุบใน 96 ดีจานและเก็บไว้ที่ 4 ◦ C ที่ least14h . theplatewasthenwashedwith0.01mpbswith0.05 % tween20 ph7.4 usingelx50autostripwasher , , ( biotek เครื่องมือ Winooski , VT ) ทันทีหลังจากนั้น จานถูกบล็อกโดยการแช่ด้วย 300L บีเอสเอ 5% ใน tbs1 tween 20 ( tbst ) 1 . จานซักและบ่มกับ 100L พลาสมาสุกร ( 1 : 5 ) สำหรับ 1 ที่ 37 ◦ C หลังจากการล้างจาน บ่มกับ 100L ของ IgG อัลคาไลน์ ฟอสฟาเตส ( หมูกระต่าย ป้องกัน Sigma , St . Louis , MO ) ( 1:5000 ) สำหรับ 1 ที่อุณหภูมิห้อง หลังจากการล้างสีถูกพัฒนาขึ้น โดยการเพิ่ม 100L สีฟอสเฟต p-nitrophenyl Reagent ( Sigma , St . Louis , MO ) นได้อ่านที่ 405nm หลังจากบ่ม 20 นาทีใช้อ่านแผ่น ELISA Elx 808 IU ( biotek เครื่องมือ Winooski , VT ) ปฏิกิริยาที่ถูกหยุดโดยการเพิ่ม 100L ของ 3N NaOH ที่ 25min และอ่านอีกครั้งที่ 35min ทั้งหมด 300L washings เสร็จล้างโซลูชั่น 6 ครั้งต่อได้ดีที่สุด 4 อัตรา ( 150l / ดี / s ) และอัตราการดูด ( 5 mm / s ) เพื่อหลีกเลี่ยงการปลดโปรตีน