Estimation of 1-Aminocyclopropane-1

Estimation of 1-Aminocyclopropane-1-Carboxylate Deaminase (ACC Deaminase) Activity
For the measurement of ACC deaminase activity, selected isolates were grown overnight in 10 mL of NB medium and thereafter
harvested by centrifugation. The pellet was washed with normal saline and suspended in 7.5 mL of JNFb- medium containing 5
mM of 1-aminocyclopropane-1-carboxylate (ACC). Tubes were incubated at 28oC with shaking (120 rpm) for growth. ACC
served as the sole source of nitrogen in the medium. After 24h of growth, cells were centrifuged at 8000 rpm at 4oC for 10 min.
The pellet was suspended in 1 mL of 0.1M Tris-HCl (pH 7.6) and again centrifuged at 15000 rpm for 15 min. Pellet was collected
and supernatant discarded. The pellet was re-suspended in 600 μL of 0.1 M Tris-HCl (pH 8.5). 30 μL of toluene was added to
the cell suspension and vortexed at higher setting for 30 s. Tube was kept at 4oC for 1h and then centrifuged at 1200 rpm for 10
min at 4oC. The thin layer of toluene was aspirated by micro-pipette gently. Now, the toluenized cells were equally distributed
in two eppendroff tubes. First part was stored at 4oC for protein assay and other part was used for ACC deaminase assay
immediately. 200 L of toluenized cells was transferred in a fresh 1.5 mL microcentrifuge tube and 20 L of 0.5 M ACC was
added to the suspension. It was briefly vortexed and incubated at 30oC for 15 min. 1.0 mL of 0.56 M HCl was added, vortexed
and centrifuged for 10 min at 12000 rpm. Now, 1mL of the supernatant was taken in another tube and 800 L of 0.56 M HCl
was added and vortexed briefly. Thereafter 300 L of 2,4, dinitrophenylhydrazine (2 % w/v) was added to the tube. It was mixed
properly by vortexing and incubated at 30oC for 30 min. 2L of 2M NaOH was added and after mixing absorbance was recorded
at 540 nm. The amount of μmol of α-ketobutyrate produced by this reaction was determined and compared with a standard curve
of α-ketobutyrate ranging between 0.1 and 1.0 μmol. For the purpose of standard curve generation a sock solution of 100 mM α-
ketobutyrate (Sigma-Aldrich Co., USA) was prepared in 0.1M Tris-HCl pH 8.5 and stored at 4oC. Enzyme activity was expressed
as  mol/mg protein/h

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

การประมาณค่าของกิจกรรม 1-Aminocyclopropane-1-Carboxylate Deaminase (ACC Deaminase)สำหรับการประเมินของ ACC deaminase กิจกรรม แยกเลือกถูกปลูกข้ามคืน 10 ml ของ NB กลาง และหลังจากนั้นเก็บเกี่ยว โดยการหมุนเหวี่ยง เม็ดล้าง ด้วยน้ำเกลือปกติ และระงับใน 7.5 mL ขนาดกลาง JNFb ประกอบด้วย 5มม.ของ 1-aminocyclopropane-1-carboxylate (ACC) หลอดได้รับการกกที่ 28oC มีสั่น (120 rpm) การเจริญเติบโต ACCทำหน้าที่เป็นแหล่งเดียวของไนโตรเจนในสื่อ หลังจาก 24 ชั่วโมงการเจริญเติบโต เซลล์ถูกจากที่ 8000 rpm ที่ 4oC 10 นาทีเม็ดใน 1 มิลลิลิตรของ 0.1 M (pH 7.6) ทริสเรทติ้ง HCl และอีก ผลิตภัณฑ์เก็บเม็ดที่ 15000 rpm สำหรับ 15 นาทีและละทิ้ง supernatant เม็ดถูกเลื่อนออกไปอีกครั้งใน μL 600 ของ 0.1 M ทริสเรทติ้ง HCl (pH 8.5) ถูก 30 μL ของโทลูอีนระงับเซลล์และ vortexed ที่สูงกว่าการตั้งค่าสำหรับหลอดปา 30 เก็บที่ 4oC สำหรับ 1h แล้ว จากที่ 1200 rpm 10นาทีที่ 4oC ชั้นบาง ๆ ของโทลูอีนคือสำลักเบา ๆ ด้วยไมโครปิเปต ตอนนี้ เซลล์ toluenized ถูกแจกจ่ายอย่างเท่าเทียมกันในสอง eppendroff ท่อ ส่วนแรกจัดเก็บที่ 4oC สำหรับทดสอบโปรตีน และส่วนอื่น ๆ ใช้สำหรับ ACC deaminase assayในทันที โอนย้าย 200 L toluenized เซลล์ในท่อไมโครสด 1.5 mL และ L 20 M ACC คือ 0.5เพิ่มระบบกันสะเทือน มันสั้น ๆ vortexed และรับการกกที่ 30oC สำหรับ 15 นาที 1.0 มิลลิลิตร 0.56 M HCl เพิ่ม vortexedและเหวี่ยงที่ 12000 rpm 10 นาที ตอนนี้ 1 มิลลิลิตรของ supernatant ที่ถ่ายหลอดและ L 800 ของ 0.56 M HClเพิ่ม และ vortexed สั้น ๆ หลังจากนั้น 300 L ของ 2, 4, dinitrophenylhydrazine (2% w/v) ถูกหลอด มันถูกผสมอย่างถูกต้อง โดย vortexing และได้รับการกกที่ 30oC สำหรับเพิ่ม 30 นาที 2L ของ 2 M NaOH และหลัง จากผสมค่าบันทึกที่ 540 nm เมื่อเทียบกับเส้นโค้งมาตรฐาน และกำหนดจำนวนไมโครโมลของα-ketobutyrate ผลิต โดยปฏิกิริยานี้ของα-ketobutyrate ตั้งแต่ 0.1 ถึง 1.0 ไมโครโมล เพื่อวัตถุประสงค์ในการสร้างกราฟมาตรฐานถุงเท้าละลาย 100 มม.α -ketobutyrate (บริษัท Sigma Aldrich สหรัฐอเมริกา) ถูกจัดทำใน pH ทริสเรทติ้ง HCl 0.1M 8.5 และเก็บไว้ที่ 4oC เอนไซม์ได้แสดงออกเป็น mol/mg โปรตีน/h

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การประมาณ 1 Aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase (ACC deaminase) กิจกรรม
สำหรับการตรวจวัดของกิจกรรม deaminase แม็ก, ไอโซเลทที่เลือกปลูกค้างคืนใน 10 มิลลิลิตรของกลาง NB และหลังจาก
เก็บเกี่ยวโดยการหมุนเหวี่ยง เม็ดถูกล้างด้วยน้ำเกลือและระงับใน 7.5 มิลลิลิตรของกลาง JNFb- มี 5
มิลลิเมตร 1 aminocyclopropane-1-carboxylate (ACC) ท่อถูกบ่มที่ 28oC เขย่า (120 รอบต่อนาที) สำหรับการเจริญเติบโต แม็ก
ทำหน้าที่เป็นแหล่งเดียวของไนโตรเจนในระยะกลาง หลังจาก 24 ชั่วโมงของการเจริญเติบโตของเซลล์ที่ถูกหมุนเหวี่ยงที่ 8000 รอบต่อนาทีที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 นาที.
เม็ดถูกระงับใน 1 มิลลิลิตรของ 0.1M Tris-HCl (pH 7.6) และหมุนเหวี่ยงที่ 15,000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 15 นาทีอีกครั้ง เม็ดถูกเก็บรวบรวม
และใสทิ้ง เม็ดเป็นอีกครั้งที่ลอยอยู่ใน 600 ไมโครลิตร 0.1 M Tris-HCl (pH 8.5) 30 ไมโครลิตรของโทลูอีนถูกเพิ่มเข้าไปใน
เซลล์แขวนลอยและหมุนวนในการตั้งค่าที่สูงขึ้นสำหรับ 30 วินาที หลอดถูกเก็บไว้ที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียสสำหรับ 1H แล้วหมุนเหวี่ยงที่ 1200 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 10
นาทีที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส ชั้นบาง ๆ ของโทลูอีนถูกสำลักโดยไมโครปิเปตเบา ๆ ตอนนี้เซลล์ toluenized ถูกกระจายอย่างเท่าเทียมกัน
ในสองหลอด eppendroff ส่วนแรกถูกเก็บไว้ที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียสสำหรับการทดสอบโปรตีนและส่วนอื่น ๆ ที่ใช้สำหรับแม็ก deaminase ทดสอบ
ทันที 200 Lของเซลล์ toluenized ถูกย้ายในหลอด 1.5 มลไมโครสดและ 20 L 0.5 M แม็กถูก
เพิ่มลงในการระงับ มันก็หมุนวนในเวลาสั้น ๆ และบ่มที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียสนาน 15 นาที 1.0 มล 0.56 M HCl ถูกเพิ่มเข้ามาหมุนวน
และปั่นเป็นเวลา 10 นาทีที่ 12000 รอบต่อนาที ตอนนี้ 1 mL ของสารละลายถูกนำในหลอดอีกและ 800 L 0.56 M HCl
ถูกเพิ่มเข้ามาและหมุนวนในเวลาสั้น ๆ หลังจากนั้น 300 L 2,4, dinitrophenylhydrazine (2% w / v) ถูกเพิ่มเข้าไปในท่อ มันได้รับการผสม
อย่างถูกต้องโดย vortexing และบ่มที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 นาที 2Lของ 2M NaOH ถูกบันทึกและหลังการผสมการดูดกลืนแสงที่ถูกบันทึกไว้
ที่ 540 นาโนเมตร ปริมาณของไมโครโมลของα-ketobutyrate ผลิตโดยปฏิกิริยานี้ถูกกำหนดและเมื่อเทียบกับเส้นโค้งมาตรฐาน
ของα-ketobutyrate ระหว่าง 0.1 และ 1.0 ไมโครโมล สำหรับวัตถุประสงค์ของการสร้างเส้นโค้งมาตรฐานวิธีการแก้ปัญหาของถุงเท้า 100 มิลลิเมตรα-
ketobutyrate (Sigma-Aldrich Co. , USA) ได้รับการจัดทำขึ้น 0.1M Tris-HCl ค่า pH 8.5 และเก็บไว้ที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส กิจกรรมของเอนไซม์ถูกแสดงออกมา
เป็นโมล / โปรตีนมิลลิกรัม / ชั่วโมง