4. DiscussionA sensitive, accurate

4. Discussion

A sensitive, accurate and rapid analytical method has been developed in this study. It can be used for the analysis and separation of a mixture of three benzodiazepine compounds; Bromazepam, Medazepam and Midazolam. The chromato- graphic conditions were: reversed phase C18 column was used

and the column temperature was set at 50 1C; the mobile phase
consisted of 25% acetonitrile, 45% methanol and 30% 0.05 M ammonium acetate; the pH ¼ 9 was adjusted by adding an ammonia solution (35%, w/w); the flow rate was 1.3 mL/min and UV detector wavelength was set at 240 nm.
Up to their latest editions, pharmacopoeias (USP 2010 [9], BP 2009 [3], E.P 2007 [10], JP 2006 [11]) had not yet described any HPLC method to analyze any of our studied compounds. International references have adopted many HPLC methods for the separation and the analysis of several benzodiazepine mixtures [15,17–19] but our mixture was not found in any of them. Mobile phases containing one solvent or two did not achieve the separation of the three compounds. Separation
succeeded when a mixture of acetonitrile, methanol and
0.05 M ammonium acetate (25%:45%:30%) was used [15]. Raising column temperature up to 50 1C at a flow rate of
1.3 mL/min led to a decrease in the retention times of the studied compounds. The total analysis time was reduced from 30 to 16 min and the peak shapes were also improved. Increasing the acetonitrile ratio from 10% to 25% reduced the retention times of the three compounds to a total of 9 min. It also improved the symmetry of Medazepam and Midazolam peaks.
Raising the mobile phase pH to 9 improved particularly the symmetry of the three peaks. The tailing factors ranged between 0.9 and 2.5. Statistically, the symmetry of Midazolam and Medazepam peaks became acceptable and their tailing factors were 1.25 and 0.91, respectively. Bromazepam peak symmetry did not improve much and some tailing remained. The tailing factor value was 2.53 (Fig. 6, Table 1). These changes, after raising the mobile phase pH to 9, could be explained by the transformation of the majority of


Medazepam (pKa ¼ 6.2) and Midazolam (pKa ¼ 6.2) mole-
cules to non-ionized form, which increased its affinity to the stationary phase and thus improved
peak separation and symmetry [26]. While for Bromazepam (pKa ¼ 2.9, 11), pH ¼ 9 transformed the
majority of its molecules to ionized form. This in turn may explain the tailing observed in the
Bromazepam peak.
Nevertheless, values of detection and quantification limits for the three compounds indicate a good
sensitivity of the method. Examined raw material samples were acceptable according to the
pharmacopeia [3,11] for the three studied compounds; the active substance percentage values ranged
between 98.57% and 101.30%, which is within the pharma- copeial accepted range (98.5%–101.5%)
[3,11]. Examined pharmaceutical preparation samples of Bromazepam and Medazepam were
pharmacopeially acceptable within the specified range (85%–115%) [3]. Four examined Midazolam
samples from five sources (including a brand company preparation) were acceptable according to the
pharmacopeia [3]. The recovery percentages of serum samples spiked with Bromazepam, Medazepam and
Midazolam ranged between 91.5% and 99.0%.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

4. สนทนาได้รับการพัฒนาวิธีวิเคราะห์สำคัญ ถูกต้อง และรวดเร็วในการศึกษานี้ สามารถใช้สำหรับการวิเคราะห์และการแยกของผสมระหว่างสารประกอบ benzodiazepine ที่สาม Bromazepam, Medazepam และ Midazolam มีเงื่อนไข chromato กราฟิก: ใช้คอลัมน์ C18 กลับเฟสและอุณหภูมิคอลัมน์ถูกตั้งค่าที่ 50 1C ระยะเคลื่อนประกอบด้วย acetonitrile 25% เมทานอล 45% และ 30% 0.05 M แอมโมเนีย acetate pH ¼ 9 ถูกปรับปรุง โดยเพิ่มแก้ปัญหาแอมโมเนีย (35%, w/w); อัตรา flow ถูก 1.3 mL/min และมีการตั้งค่าความยาวคลื่นตรวจจับ UV ที่ 240 nmถึงรุ่นล่าสุดของพวกเขา pharmacopoeias (USP 2010 [9], BP 2009 [3], E.P 2007 [10] 2006 JP [11]) มีไม่ยังอธิบายใด ๆ วิธี HPLC เพื่อวิเคราะห์ของสารประกอบ studied ของเรา อ้างอิงต่างประเทศได้นำมาใช้หลายวิธี HPLC การแยกและการวิเคราะห์ส่วนผสม benzodiazepine หลาย [15,17-19] แต่ส่วนผสมของเราไม่พบในใด ๆ ของพวกเขา ระยะเคลื่อนที่ประกอบด้วยตัวทำละลายหนึ่งหรือสองก็ไม่ได้แยกสารสาม แยกสำเร็จเมื่อส่วนผสมของ acetonitrile เมทานอล และ0.05 M แอมโมเนีย acetate (25%:45%:30%) ถูกใช้ [15] เพิ่มคอลัมน์อุณหภูมิขึ้นไป 50 1C ในอัตรา flow1.3 mL/min นำไปสู่การลดลงในเวลาเก็บรักษาของสาร studied เวลารวมวิเคราะห์ถูกลดจาก 30 นาทีที่ 16 และยังได้พัฒนารูปร่างสูง เพิ่มอัตราส่วน acetonitrile จาก 10% เป็น 25% ลดเวลาเก็บรักษาของสาร 3 รวม 9 นาที นอกจากนี้ยังปรับปรุงการสมมาตรของ Medazepam และ Midazolam พีคส์เพิ่มระยะเคลื่อนที่ pH 9 ปรับปรุงโดยเฉพาะอย่างยิ่งสมมาตร 3 ปัจจัย tailing อยู่ในช่วงระหว่าง 0.9 และ 2.5 ทางสถิติ สมมาตรของยอด Midazolam และ Medazepam กลายเป็นที่ยอมรับได้ และปัจจัยของ tailing มีการ 1.25 และ 0.91 ตามลำดับ สมมาตรสูงสุด Bromazepam ได้ปรับปรุงมาก และยังคง tailing บาง ค่าตัวคูณ tailing 2.53 (Fig. 6 ตารางที่ 1) เปลี่ยนแปลงเหล่านี้ หลังจากเพิ่มระยะเคลื่อนที่ pH 9 อาจจะอธิบาย โดยการเปลี่ยนแปลงของส่วนใหญ่ Medazepam (pKa ¼ 6.2) และตุ่น Midazolam (pKa ¼ 6.2) -cules ไม่ใช่ ionized ฟอร์ม ซึ่งเพิ่มขึ้นเป็น affinity ระยะเครื่องเขียน และปรับปรุงดังนั้น แยกสูงสุดและสมมาตร [26] ขณะที่ค่า pH 9 ¼แปลงสำหรับ Bromazepam (pKa ¼ 2.9, 11), การ ส่วนใหญ่เป็นโมเลกุลแบบฟอร์ม ionized นี้จะอาจอธิบาย tailing สังเกตในการ Bromazepam คอย่างไรก็ตาม ค่าตรวจและขีดจำกัดของ quantification สำหรับสารสามแสดงดี ความไวของวิธีการ ตัวอย่างวัตถุดิบที่กล่าวถึงได้ยอมรับตาม pharmacopeia [3,11] สำหรับสารประกอบ studied สาม ค่าเปอร์เซ็นต์ของสารที่อยู่ในช่วง ระหว่าง 98.57% และ 101.30% ซึ่งอยู่ภายใน pharma - copeial ยอมรับช่วง (98.5%-101.5%) [3,11] . ตัวอย่างยาเตรียม Examined Bromazepam และ Medazepam ดี ยอมรับได้ภายในช่วง specified (85-115%) pharmacopeially [3] . 4 ตรวจสอบ Midazolam ตัวอย่างจากแหล่ง five (รวมถึงการเตรียมบริษัทแบรนด์) ได้ยอมรับตาม pharmacopeia [3] เปอร์เซ็นต์การกู้คืนตัวอย่างซีรั่ม spiked กับ Bromazepam, Medazepam และ Midazolam ที่อยู่ในช่วงระหว่าง 99.0% 91.5%

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

4 . การอภิปราย

ไว ถูกต้อง และวิธีวิเคราะห์แบบรวดเร็วถูกพัฒนาขึ้นในการศึกษานี้ มันสามารถใช้สำหรับการวิเคราะห์และการแยกของผสมของสารประกอบ 3 benzodiazepine ; โบรมาซีแพมเมดาซีแพม , และ บน . การ chromato - เงื่อนไขกราฟิกคือกลับเฟส c18 คอลัมน์ใช้

และคอลัมน์อุณหภูมิถูกกำหนดไว้ที่ 50 c ;
เฟสเคลื่อนที่ประกอบด้วย 25% ไนเมทานอล 45 % และ 30 % 0.05 M แอมโมเนียมอะซิเตท ; พีเอช¼ 9 ปรับโดยเติมสารละลายแอมโมเนีย ( 35 % w / w ) ; flโอ๊ยอัตรา 1.3 มล. / นาทีและเครื่องตรวจจับ UV ความยาวคลื่นเท่ากับ 240 nm .
ถึงรุ่นล่าสุดของพวกเขา เภสัชตำรับ ( USP ) [ 9 ] 2009 BP [ 3 ] , e . P ) [ 10 ] JP 2006 [ 11 ] ) ยังไม่ได้อธิบายใด ๆวิธี HPLC วิเคราะห์ของการศึกษาสารประกอบอ้างอิงระหว่างประเทศได้ใช้วิธี HPLC มากมายสำหรับการแยกและการวิเคราะห์หลายผสมยานอนหลับ [ 19 ] แต่ 15,17 –ส่วนผสมของเราไม่พบในใด ๆของพวกเขา ระยะเคลื่อนที่ที่มีตัวทำละลายหรือสองไม่ได้บรรลุแยก 3 สาร แยก
สำเร็จเมื่อส่วนผสมของไนล
0.05 M แอมโมเนียมอะซิเตท ( 25% : 45 :30 % ) ใช้ [ 15 ] การเพิ่มอุณหภูมิถึง 50 ในคอลัมน์ที่flโอ๊ยอัตรา
1.3 มล. / นาที นำไปสู่การลดลงในเวลากักของศึกษาสารประกอบ เวลาวิเคราะห์รวมลดลงจาก 30 ถึง 16 นาที และสูงสุดรูปร่างยังปรับปรุง การเพิ่มอัตราส่วนไนจาก 10% ถึง 25% ลดความคงทนของสารประกอบ 3 ครั้ง รวมเป็น 9 นาทีนอกจากนี้ยังปรับปรุงความสมมาตรของเมดาซีแพมและยอดเขาบน .
เพิ่ม pH เฟสเคลื่อนที่ 9 ปรับปรุงโดยเฉพาะอย่างยิ่งความสมมาตรของสามยอด การติดตามปัจจัยอยู่ระหว่าง 0.9 และ 2.5 สถิติ , ความสมมาตรของบนยอดเขาและกลายเป็นที่ยอมรับของเมดาซีแพมตามปัจจัยเท่ากับ 1.25 และ 0.91 ตามลำดับโบรมาซิแปมสูงสุดสมมาตรไม่ได้ปรับปรุงมาก และบาง ติดตามอยู่ การติดตามปัจจัยมูลค่า 2.53 ( รูปที่ 6 , ตารางที่ 1 ) การเปลี่ยนแปลงเหล่านี้ หลังจากการเพิ่ม pH เฟสเคลื่อนที่ 9 , สามารถอธิบายได้โดยการเปลี่ยนแปลงของส่วนใหญ่ของ


เมดาซีแพม ( pKa ¼ 6.2 ) และมิดาโซแลม ( pKa ¼ 6.2 ) โมล -
กูเล่ไม่ประจุแบบ ซึ่งเพิ่มขึ้นถึง AF จึงให้เกียรติเฟสอยู่กับที่ และดังนั้นจึง ปรับปรุง
ยอดการแยกและสมมาตร [ 26 ] ในขณะที่สำหรับโบรมาซีแพม ( pKa ¼ 2.9 , 11 ) , pH ¼ 9 แปลง
ส่วนใหญ่ของโมเลกุลประจุแบบ นี้ในการเปิดอาจอธิบายตาม )

แต่โบรมาซิแปมสูงสุด ค่าของการตรวจสอบและการ จำกัด การไฟฟ้าจึงให้สามสารแสดงความไวที่ดี
ของวิธีการทดสอบตัวอย่างวัตถุดิบถูกยอมรับได้ตามมาตรฐาน 3,11
[ ] สำหรับการศึกษาสารประกอบ ; ค่าเปอร์เซ็นต์สารอยู่ระหว่าง 98.57
% และ 101.30 % ซึ่งอยู่ในฟา - copeial ยอมรับช่วง ( 98.5 % – 101.5 % )
[ 3,11 ] ตรวจสอบยาตัวอย่าง และมีการเตรียมโบรมาซีแพม
มีดาซิแปมpharmacopeially ที่ยอมรับได้อยู่ในช่วงกาจึงเอ็ด ( 85% ) 115 % ) [ 3 ] 4 ตรวจสอบบน
ตัวอย่างจากแหล่งจึงได้ ( รวมทั้งบริษัทแบรนด์เตรียม ) ยอมรับได้ตามมาตรฐาน
[ 3 ] การกู้คืนร้อยละของตัวอย่างซีรั่มโบรมาซีแพมเมดาซีแพมและ
C , มิดาโซแลมอยู่ระหว่าง 91.5% และ 99.0
%