2.2. DNA extraction and amplificati

2.2. DNA extraction and amplification
Genomic DNA was extracted with filter column based extraction kits from Qiagen and Macherey–Nagel, following the manufacturers’ protocols.

A fragment with a maximum length of 420 bp of the mitochondrial control region (CR) was amplified by PCR with the primers CR-A (TTC CAC CTC TAA CTC CCA AAG CTA G) and CR-E (CCT GAA GTA GGA ACC AGA TG) (Lee et al., 1995). PCR was performed in a Perkin Elmer and Eppendorf Ep S Mastercycler with the following thermo-profile: 95 _C for 2 min, followed by 35 cycles of 95 _C for 30 s, 50 _C for 30 s and 72 _C for 60 s. The Terminal elongation
was at 72 _C for 2 min. 25 ll reactions contained 2.5 ll 10_ PCR buffer, 0.075 lmol Mg2+, 0.25 lmol dNTP mix, 10 pmol of each primer and 0.5 U Taq polymerase.






Between 10 and 30 ng genomic DNA was used of each sample as template.
For a subset of samples of each species cytochrome b (cyt b)
sequences were obtained (Table 1).


This fragment of the mitochondrial genome is suitable for resolving phylogenetic patterns on
intraspecific (Nelson et al., 2000) to intrageneric level (Kocher et al., 1989).


For the amplification of the cyt b fragment of around 400 bp length, the primers tRNAgluF (AAAACCACCGTTGTTATTCAACTACA; Nelson et al., 2000) and H15149 (AAACTGCAGCCCCTCAGAATGA TATTTGTCCTCA; Kocher et al., 1989) were used.


PCR was performed in Eppendorf Ep Mastercyclers in 25 ll reaction mix, containing
2.5 ll 10_ PCR buffer, 0.0625 lmol Mg2+, 0.25 lmol dNTP mix, 10 pmol of each primer and 0.5 U Taq polymerase. Again 10–30 ng genomic DNA was used of each sample. The thermo-profile
was 95 _C for 5 min, 35 cycles of 95 _C for 45 s, 58 _C for 45 s and 72 _C for 60 s. The final elongation was 72 _C for 5 min.



All PCR products were purified with the QIA-quick PCR Purification Kit (Qiagen). Sequencing of both strands was conducted with the PCR primers using the Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (ver. 1.3 and ver. 3.1; Applied Bioscience) according to the manufacturer’s
recommendations and an ABI 310 and 3100 automated sequencer.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.2. ดีเอ็นเอแยกและขยายGenomic DNA ถูกสกัด ด้วยชุดแยกตามคอลัมน์กรอง Qiagen และ Macherey – Nagel ต่อโปรโตคอลของผู้ผลิตส่วนความยาวสูงสุดของ 420 bp ของภูมิภาค mitochondrial ควบคุม (CR) ถูกขยาย โดย PCR กับไพรเมอร์ CR-A (ทีทีซีจำกัด CAC CTC แหลมยายณี CTC CCA เอเอจี CTA G) และ CR-E (CCT เฒ่า GTA GGA บัญชีนี้ TG) (Lee et al., 1995) PCR ทำให้เพอร์เอลเมอและ Eppendorf Ep S Mastercycler กับเทอร์โมโพรไฟล์ต่อไปนี้: _C 95 สำหรับ 2 นาที ตาม ด้วยรอบ 35 ของ 95 _C สำหรับ 30 s, _C 50 สำหรับ 30 s และ _C 72 60 s Elongation เทอร์มินัลถูกที่ _C 72 สำหรับ 2 นาที 25 จะปฏิกิริยาอยู่ 2.5 จะ 10_ PCR บัฟเฟอร์ lmol 0.075 Mg2 + 0.25 lmol dNTP ผสม 10 pmol พื้นแต่ละ และพอลิเมอเรส U Taq 0.5 ระหว่าง 10 และ 30 ng genomic DNA ใช้ของแต่ละอย่างเป็นต้นสำหรับชุดย่อยของตัวอย่างของแต่ละสปีชีส์ cytochrome b (cyt b)ลำดับได้รับ (ตารางที่ 1) ส่วนนี้ของจีโนม mitochondrial เหมาะสำหรับการแก้ไขรูปแบบ phylogenetic บนintraspecific (เนลสันและ al., 2000) ระดับ intrageneric (Kocher et al., 1989)การขยายของส่วน b cyt ความยาวประมาณ 400 bp, tRNAgluF ไพรเมอร์ (AAAACCACCGTTGTTATTCAACTACA เนลสันและ al., 2000) และ H15149 (AAACTGCAGCCCCTCAGAATGA TATTTGTCCTCA Kocher et al., 1989) ก็ PCR ทำใน Eppendorf Ep Mastercyclers ใน 25 จะปฏิกิริยาผสม ประกอบด้วย2.5 จะ 10_ PCR บัฟเฟอร์ lmol 0.0625 Mg2 + 0.25 lmol dNTP ผสม 10 pmol พื้นแต่ละ และพอลิเมอเรส U Taq 0.5 อีก 10-30 ng genomic DNA ถูกใช้ของแต่ละอย่าง โพเทอร์โมถูก _C 95 สำหรับ 5 นาที รอบ 35 ของ 95 _C สำหรับ 45 s, _C 58 สำหรับ 45 s และ _C 72 60 s Elongation สุดท้าย _C 72 สำหรับ 5 นาทีได้ผลิตภัณฑ์ PCR ทั้งหมดก็บริสุทธิ์ ด้วยชุดฟอก PCR QIA ด่วน (Qiagen) วิธีการจัดลำดับของทั้งสองกับไพรเมอร์ PCR ที่ใช้ขนาดใหญ่ย้อมเทอร์มิเนเตอร์วงจรลำดับเบสชุด (ไม่ 1.3 และไม่ 3.1 ใช้ซื้อ) ตามของผู้ผลิตคำแนะนำ และการ 310 ABI และ sequencer 3100 อัตโนมัติ

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.2 สกัดดีเอ็นเอและการขยาย
ดีเอ็นเอจีโนมถูกสกัดด้วยคอลัมน์กรองตามชุดสกัดจาก Qiagen และ Macherey-แจคกี้ต่อไปนี้โปรโตคอลของผู้ผลิต. ส่วนที่มีความยาวสูงสุด 420 bp ของภูมิภาคควบคุมยล (CR) ได้รับการขยายโดยวิธี PCR กับ ไพรเมอร์ CR-A (TTC CAC CTC TAA CTC CCA AAG CTA G) และ CR-E (CCT GAA GTA GGA ACC AGA TG) (Lee et al., 1995) PCR ได้รับการดำเนินการใน Perkin Elmer และ Eppendorf Ep S Mastercycler ดังต่อไปนี้ความร้อนรายละเอียด: 95 _C 2 นาทีตามด้วย 35 รอบ 95 _C 30 วินาที, 50 _C 30 และ 72 _C 60 S การยืดตัวเทอร์อยู่ที่ 72 _C 2 นาที 25 LL ปฏิกิริยาที่มีอยู่ 2.5 LL 10_ บัฟเฟอร์ PCR, 0.075 lmol Mg2 + 0.25 lmol ผสม dNTP, 10 pmol ของแต่ละรองพื้นและ 0.5 U โพลิเมอร์ Taq. ระหว่าง 10 และ 30 ng ดีเอ็นเอถูกนำมาใช้ของแต่ละตัวอย่างเป็นแม่แบบ. สำหรับย่อยของกลุ่มตัวอย่าง ของแต่ละสายพันธุ์ cytochrome ข (CYT ข) ลำดับที่ได้รับ (ตารางที่ 1). ส่วนของจีโนมยลนี้เหมาะสำหรับการแก้ไขรูปแบบการวิวัฒนาการในสำนวน (เนลสัน et al., 2000) ในระดับ intrageneric (Kocher et al., 1989) . สำหรับการขยายของ CYT ส่วนขของความยาวประมาณ 400 bp ไพร tRNAgluF (AAAACCACCGTTGTTATTCAACTACA. เนลสัน, et al, 2000) และ H15149 (AAACTGCAGCCCCTCAGAATGA TATTTGTCCTCA. Kocher, et al, 1989) ถูกนำมาใช้. PCR ได้รับการดำเนินการใน Eppendorf อี Mastercyclers ใน 25 LL ผสมปฏิกิริยาที่มี2.5 LL 10_ บัฟเฟอร์ PCR, 0.0625 lmol Mg2 + 0.25 lmol ผสม dNTP, 10 pmol ของแต่ละรองพื้นและ 0.5 U Taq polymerase อีกครั้ง 10-30 ศึกษาดีเอ็นเอถูกนำมาใช้ของแต่ละตัวอย่าง เทอร์โมละเอียด95 _C เวลา 5 นาที, 35 รอบ 95 _C 45 วินาที, 58 _C 45 และ 72 _C 60 S การยืดตัวสุดท้ายคือ 72 _C 5 นาที. ผลิตภัณฑ์พีซีอาร์ทั้งหมดถูกทำให้บริสุทธิ์ด้วยวิธี PCR QIA อย่างรวดเร็วบริสุทธิ์ Kit (Qiagen) ลำดับของเส้นทั้งสองได้รับการดำเนินการกับไพรเมอร์โดยใช้วิธี PCR Terminator ย้อมชุดใหญ่ลำดับวงจร (เวอร์ชั่น 1.3 และเวอร์ชั่น 3.1.. ประยุกต์ Bioscience) ตามที่ผู้ผลิตแนะนำและ ABI 310 และ 3100 ซีเควนอัตโนมัติ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.2 . การสกัดดีเอ็นเอและเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอ
สารสกัดจากคอลัมน์กรองและชุดเพิ่ม macherey –นาเกล ตามผู้ผลิตระบบ

ส่วนกับความยาวสูงสุด 420 BP ของภูมิภาคการควบคุม ( CR ) คือการขยายโดยวิธี PCR กับไพรเมอร์ ทา cr-a ( TTC the CTC CTC CCA AAG CTA กรัม และ cr-e ( CCT GAA GTA ก๊ะบัญชีอย่างไรก็ตาม TG ) ( ลี et al . ,1995 ) ร่วมแสดงในเพอร์กินเอลเมอร์ และเพนดอร์ฟ EP ด้วย mastercycler กับโปรไฟล์ร้อนต่อไปนี้ : 95 _c เป็นเวลา 2 นาที ตามด้วย 35 รอบ 95 _c 30 , 50 _c 30 และ 60 72 _c S terminal ยืดตัว
อยู่ที่ 72 _c 2 นาที 25 จะปฏิกิริยาที่มีอยู่ 2.5 จะ 10_ PCR buffer , 0.075 lmol mg2 0.25 lmol dntp ผสม 10 pmol ของแต่ละสีและ 0.5 U ได้ดีโดย .






ระหว่าง 10 และ 30 ของ genomic DNA ของแต่ละตัวอย่างถูกใช้เป็นแม่แบบ
สำหรับย่อยของตัวอย่างแต่ละชนิด - B ( cyt b )
) ได้ ( ตารางที่ 1 )


นี้ส่วนของจีโนมยลเหมาะสำหรับการแก้ไข ซึ่งลวดลายบน
เซ็นต์ ( Nelson et al . , 2000 ) ในระดับ intrageneric ( โคเชอร์ et al . , 1989 ) .

สำหรับการเพิ่มปริมาณของ cyt B ส่วนของความยาวประมาณ 400 คู่เบส ไพรเมอร์ trnagluf ( aaaaccaccgttgttattcaactaca ; Nelson et al . , 2000 ) และ h15149 ( aaactgcagcccctcagaatga tatttgtcctca ; โคเชอร์ et al . , 1989 ) สถิติที่ใช้


เพื่อแสดงในเพนดอร์ฟ EP mastercyclers 25 จะเกิดปฏิกิริยาผสม ประกอบด้วย
2.5 จะ 10_ PCR buffer , ผล lmol mg2 0.25 lmol dntp ผสม 10 pmol ของแต่ละสีและ 0 .5 U ได้ดีโดย . อีก 10 – 30 นาโนดีเอ็นเอถูกใช้ในแต่ละตัวอย่าง
โปรไฟล์ร้อน 95 _c นาน 5 นาที 35 รอบ 95 _c 45 , 58 _c 45 และ 72 _c 60 วินาทีสุดท้ายการยืดตัวเป็น 72 _c 5 นาที



ทุกผลิตภัณฑ์มีความบริสุทธิ์ด้วยวิธี PCR PCR Kit ( QIAGEN มั่นอย่างรวดเร็วบริสุทธิ์ )ลำดับของทั้งสองเส้น ได้ศึกษากับ PCR ไพรเมอร์โดยใช้วงจรการใหญ่สี Terminator Kit ( Ver . 1.3 และ Ver . 3.1 ; ประยุกต์วิทยาศาสตร์ชีวภาพ ) ตามข้อเสนอแนะของ
ผู้ผลิตและ ABI 310 และ 3100 มูลค่า .