Image-based phenotyping for non-des

Image-based phenotyping for non-destructive screening of different salinity tolerance traits in
Rice
Abstract
Background: Soil salinity is an abiotic stress wide spread in rice producing areas, limiting both plant growth and
yield. The development of salt-tolerant rice requires efficient and high-throughput screening techniques to identify
promising lines for salt affected areas. Advances made in image-based phenotyping techniques provide an
opportunity to use non-destructive imaging to screen for salinity tolerance traits in a wide range of germplasm in a
reliable, quantitative and efficient way. However, the application of image-based phenotyping in the development
of salt-tolerant rice remains limited.

Results: A non-destructive image-based phenotyping protocol to assess salinity tolerance traits of two rice cultivars
(IR64 and Fatmawati) has been established in this study. The response of rice to different levels of salt stress was
quantified over time based on total shoot area and senescent shoot area, calculated from visible red-green-blue
(RGB) and fluorescence images. The response of rice to salt stress (50, 75 and 100 mM NaCl) could be clearly
distinguished from the control as indicated by the reduced increase of shoot area. The salt concentrations used
had only a small effect on the growth of rice during the initial phase of stress, the shoot Na+ accumulation
independent phase termed the ‘osmotic stress’ phase. However, after 20 d of treatment, the shoot area of salt
stressed plants was reduced compared with non-stressed plants. This was accompanied by a significant increase
in the concentration of Na+ in the shoot. Variation in the senescent area of the cultivars IR64 and Fatmawati in
response to a high concentration of Na+ in the shoot indicates variation in tissue tolerance mechanisms between
the cultivars.

Conclusions: Image analysis has the potential to be used for high-throughput screening procedures in the
development of salt-tolerant rice. The ability of image analysis to discriminate between the different aspects of
salt stress (shoot ion-independent stress and shoot ion dependent stress) makes it a useful tool for genetic and
physiological studies to elucidate processes that contribute to salinity tolerance in rice. The technique has the
potential for identifying the genetic basis of these mechanisms and assisting in pyramiding different tolerance
mechanisms into breeding lines.
Keywords: Rice (Oryza sativa L.); Salinity tolerance; Phenotyping; Image analysis; Growth; Senescence

Results and discussion
Imaging as a surrogate for rice shoot biomass
measurements
Non-destructive imaging of plants allows multiple measurements
of plant growth and plant health on the same
individual over time, without having to harvest plant material
for analysis (Rajendran et al. 2009; Furbank and
Tester 2011; Berger et al. 2012b; Fiorani and Schurr 2013).
Non-destructive imaging is important when measuring
the dynamic response of individual plants to the onset of
an environmental stress such as salinity and water deficit.
It is also important to use non-destructive techniques
when plants are unique, such as early generation transgenics,
which need to be phenotyped but also maintained
for seed collection. Key to the success of this technique is
that the measurements obtained are quantitative, quick to
obtain and a good surrogate for important traits, such as
determination of plant biomass.
A number of studies have used projected shoot area
to estimate the shoot biomass of different crops, such
as wheat and barley under conditions of salinity stress
(Rajendran et al. 2009; Harris et al. 2010; Golzarian
et al. 2011).
To determine whether shoot biomass of rice plants correlated
with the measurements of projected shoot area,
and is therefore a quantifiable parameter that can be used
to measure plant biomass, RGB images were obtained of
plants that had been exposed to various salt stress levels
for 20 d (Figure 1) before the fresh weight of each plant
was determined by destructive harvest. The projected
shoot area was calculated based on two side view images
(at 90° from each other) and one top view image (Figure 1).
There was a strong positive correlation between the projected
shoot area obtained by image analysis and shoot
fresh weight in the two rice cultivars, Fatmawati (R2 =
0.97) and IR64 (R2 = 0.98) (Figure 2) and there was no indication
of any deviation from a linear relationship even at
the highest biomasses measured in this experiment. Projected
shoot area is therefore a suitable surrogate for rice
shoot biomass up to six weeks of age and 24 g of shoot
fresh weight (Figure 2). It is possible that the correlation

Figure 2 Relationship between projected shoot areas and
shoot fresh weight of rice. A positive linear relationship was
observed in both rice cv. Fatmawati (R2 = 0.97, n = 56) and IR64
(R2 = 0.98, n = 56). The projected shoot area of rice cv. Fatmawati
(blue) and IR64 (red) growing under moder

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ภาพที่ใช้สำหรับการคัดกรอง phenotyping ไม่ทำลายลักษณะความเค็มความอดทนที่แตกต่างกันใน
ข้าว
บทคัดย่อ
พื้นหลัง: ดินเค็มเป็นความเครียด abiotic แพร่กระจายกว้างในพื้นที่ผลิตข้าว จำกัด ทั้งการเจริญเติบโตและ
ผลผลิต การพัฒนาของข้าวทนเค็มต้องใช้เทคนิคที่มีประสิทธิภาพและการตรวจคัดกรองสูงผ่านการระบุ
เส้นแนวโน้มสำหรับพื้นที่ที่ได้รับผลกระทบเกลือ ความก้าวหน้าที่เกิดขึ้นในภาพที่ใช้เทคนิค phenotyping ให้
โอกาสที่จะใช้ในการถ่ายภาพที่ไม่ทำลายไปยังหน้าจอสำหรับลักษณะความเค็มความอดทนในความหลากหลายของเชื้อพันธุกรรมใน
วิธีที่เชื่อถือได้, เชิงปริมาณและมีประสิทธิภาพ อย่างไรก็ตามการประยุกต์ใช้ phenotyping ภาพที่ใช้ในการพัฒนา
ข้าวทนเค็มยังคง จำกัด . ผล: ภาพตามไม่ทำลายโปรโตคอล phenotyping เพื่อประเมินลักษณะความเค็มความอดทนของพันธุ์ข้าวสอง(IR64 และ Fatmawati) ได้รับการจัดตั้งขึ้นในปีนี้ ศึกษา. การตอบสนองของข้าวให้อยู่ในระดับที่แตกต่างกันของความเครียดเกลือวัดในช่วงเวลาที่อยู่บนพื้นฐานของพื้นที่ทั้งหมดและพื้นที่ยิงยิงมีอายุซึ่งคำนวณได้จากที่มองเห็นสีแดงเขียวน้ำเงิน(RGB) และภาพเรืองแสง การตอบสนองของข้าวกับความเครียดเกลือ (50, 75 และ 100 มิลลิเมตรโซเดียมคลอไรด์) อาจจะเห็นได้ชัดว่าแตกต่างไปจากการควบคุมตามที่ระบุโดยการเพิ่มขึ้นของการลดลงของพื้นที่ยิง ความเข้มข้นของเกลือที่ใช้มีเพียงขนาดเล็กผลต่อการเจริญเติบโตของข้าวในช่วงเริ่มต้นของความเครียดยิง na + สะสมเฟสอิสระที่เรียกว่า 'ความเครียดออสโมติก' เฟส อย่างไรก็ตามหลังจากที่ 20 D ของการรักษาพื้นที่ยิงของเกลือพืชเน้นลดลงเมื่อเทียบกับพืชที่ไม่เครียด นี้มาพร้อมกับการเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในความเข้มข้นของ Na + ในการถ่ายทำ การเปลี่ยนแปลงในพื้นที่มีอายุของ IR64 พันธุ์และ Fatmawati ในการตอบสนองต่อความเข้มข้นสูงของ Na + ในการถ่ายทำแสดงให้เห็นการเปลี่ยนแปลงในกลไกความอดทนเนื้อเยื่อระหว่างพันธุ์. สรุปผลการวิจัย: การวิเคราะห์ภาพที่มีศักยภาพที่จะนำมาใช้สำหรับการคัดกรองสูง throughput ในการพัฒนาข้าวทนเค็ม ความสามารถในการวิเคราะห์ภาพที่จะแยกแยะระหว่างด้านต่างๆของความเครียดเกลือ (ความเครียดไอออนอิสระยิงและยิงไอออนความเครียดขึ้น) ทำให้มันเป็นเครื่องมือที่มีประโยชน์สำหรับทางพันธุกรรมและการศึกษาทางสรีรวิทยาเพื่ออธิบายกระบวนการที่นำไปสู่การทนทานต่อความเค็มในข้าว เทคนิคที่มีศักยภาพสำหรับการระบุพื้นฐานทางพันธุกรรมของกลไกเหล่านี้และให้ความช่วยเหลือใน pyramiding ความอดทนที่แตกต่างกันกลไกในสายการปรับปรุงพันธุ์. คำสำคัญ: ข้าว (Oryza sativa L. ); ทนทานต่อความเค็ม; phenotyping; การวิเคราะห์ภาพ; การเจริญเติบโต; ชราภาพและอภิปรายผลการถ่ายภาพเป็นตัวแทนสำหรับการถ่ายข้าวชีวมวลวัดการถ่ายภาพแบบไม่ทำลายของพืชช่วยให้หลายวัดของการเจริญเติบโตของพืชและสุขภาพพืชเดียวกันของแต่ละบุคคลเมื่อเวลาผ่านไปได้โดยไม่ต้องวัสดุปลูกการเก็บเกี่ยวสำหรับการวิเคราะห์ (Rajendran, et al. 2009; Furbank และTester ปี 2011 เบอร์เกอร์ et al, 2012b;.. Fiorani และไบโอซิสเต็มส์ 2013) การถ่ายภาพแบบไม่ทำลายเป็นสิ่งสำคัญเมื่อวัดการตอบสนองแบบไดนามิกของพืชแต่ละจะเริ่มมีอาการของความเครียดสิ่งแวดล้อมเช่นความเค็มและน้ำขาดดุล. นอกจากนี้ยังเป็นสิ่งสำคัญที่จะ ใช้เทคนิคแบบไม่ทำลายเมื่อพืชที่เป็นเอกลักษณ์เช่น transgenics รุ่นเริ่มต้นที่จะต้อง phenotyped แต่ยังเก็บรักษาไว้สำหรับเก็บเมล็ด กุญแจสู่ความสำเร็จของเทคนิคนี้คือว่าการวัดที่ได้รับเป็นเชิงปริมาณที่รวดเร็วในการขอรับและตัวแทนที่ดีสำหรับลักษณะที่สำคัญเช่นการกำหนดชีวมวลพืช. จากการศึกษาได้ใช้พื้นที่ถ่ายทำที่คาดการณ์ในการประมาณชีวมวลยิงของพืชที่แตกต่างกัน เช่นข้าวสาลีและข้าวบาร์เลย์ภายใต้เงื่อนไขของความเครียดความเค็ม(Rajendran et al, 2009. แฮร์ริส et al, 2010. Golzarian . et al, 2011). การตรวจสอบว่าชีวมวลยิงของต้นข้าวมีความสัมพันธ์กับขนาดของพื้นที่ยิงฉาย, และเป็น จึงพารามิเตอร์เชิงปริมาณที่สามารถใช้ในการวัดชีวมวลพืชภาพ RGB ได้รับของพืชที่ได้รับการสัมผัสกับระดับความเครียดเกลือต่างๆสำหรับ 20 D (รูปที่ 1) ก่อนที่จะมีน้ำหนักสดของพืชแต่ละชนิดถูกกำหนดโดยการเก็บเกี่ยวการทำลายล้าง ที่คาดการณ์พื้นที่ยิงที่คำนวณได้ขึ้นอยู่กับสองภาพมุมมองด้านข้าง(ที่ 90 °จากแต่ละอื่น ๆ ) และภาพมุมมองด้านบนหนึ่ง (รูปที่ 1). มีความสัมพันธ์ในเชิงบวกที่แข็งแกร่งระหว่างที่ฉายเป็นพื้นที่ถ่ายภาพที่ได้จากการวิเคราะห์ภาพและถ่ายน้ำหนักสดใน ทั้งสองสายพันธุ์ข้าว Fatmawati (R2 = 0.97) และ IR64 (R2 = 0.98) (รูปที่ 2) และมีข้อบ่งชี้ของการเบี่ยงเบนใด ๆ จากความสัมพันธ์เชิงเส้นแม้ในสารชีวมวลสูงสุดที่วัดในการทดลองนี้ คาดการณ์พื้นที่ยิงจึงเป็นตัวแทนที่เหมาะสมสำหรับข้าวยิงชีวมวลได้ถึงหกสัปดาห์ของอายุและ 24 กรัมของการถ่ายน้ำหนักสด (รูปที่ 2) มันเป็นไปได้ที่ความสัมพันธ์รูปที่ 2 ความสัมพันธ์ระหว่างพื้นที่ที่คาดการณ์ยิงและยิงน้ำหนักสดของข้าว ความสัมพันธ์เชิงเส้นบวกสังเกตในทั้งพันธุ์ข้าว fatmawati (R2 = 0.97, N = 56) และ IR64 (R2 = 0.98, N = 56) พื้นที่ยิงที่คาดการณ์ของพันธุ์ข้าว fatmawati (สีฟ้า) และ IR64 (สีแดง) ที่เติบโตภายใต้แม่