Site directed mutagenesis was perfo

Site directed mutagenesis was performed using the QuikChange site-directed mutagenesis kit (Stratagene) to introduce the single and double mutations into the EcFbFP gene. Briefly, the FbFP gene was amplified from pEcFbFP using Pfu-X DNA polymerase (Solgent, Daejeon, Korea), resulting in nicked circular strands of the plasmid. The plasmid was digested using DpnI to remove the residual template DNA and transformed into E. coli TOP10 cells by heat shock transformation at 42°C

Mutational Sensitivity Test by Site-directed Mutagenesis

To verify the mutational map, positions with FMN-binding sites were selected and tested by site-directed mutagenesis. In this selection, we selected sites that retained their function despite the change in the amino acid characteristics. The in vivo detection of fluorescence indicated that all the mutants retained fluorescence as expected by the mutational map (Figure 4(c), (i)). However, mutants L65F and N104S showed significant reduction in fluorescence. To quantitatively examine these mutants, we cloned them to an expression vector pET-28a(+), and the protein was purified using Ni-NTA resin for in vitro fluorescent assay (Figure 4(c), (ii)). The relative fluorescent unit (RFU) indicated a pattern similar to that of the in vivo fluorescent assay, except for L65F. L65F showed a very weak fluorescence in the in vivo assay; however, the purified L65F showed clear cyan color. In addition, the excitation peak of L65F was measured to be at 524 nm, showing a 27-nm shift from the wild type (Figure 4(c), (iii), (iv)). We predicted that these results arise from the dramatic amino acid change of leucine into a bulky aromatic amino acid, phenylalanine. First, this change may cause a steric effect on the stability of the FMN binding to L65F mutant and disturb the bound FMN to be released, causing the shift in emission peak close to the FMN emission peak, which is 530 nm. Second, this change may cause structural changes in the FMN binding pocket, changing the energy state of the molecule and thus the changing the emission wavelength.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

เว็บไซต์โดยตรงทำ mutagenesis ใช้ชุด mutagenesis ไซต์โดยตรง QuikChange (Stratagene) แนะนำเดี่ยว และกลายพันธุ์ในยีน EcFbFP สั้น ๆ ยีน FbFP ถูกขยายจาก pEcFbFP ใช้ Pfu X ดีเอ็นเอพอลิเมอเรส (Solgent แทจอน เกาหลี) strands nicked กลมของ plasmid เกิด Plasmid มีต้องใช้ DpnI เอาแบบเหลือดีเอ็นเอ และเปลี่ยนเป็นเซลล์ E. coli TOP10 โดยแปลงไล่ความร้อนที่ 42 องศาเซลเซียสทดสอบความไว mutational โดย Mutagenesis ไซต์โดยตรงการตรวจสอบแผนที่ mutational ตำแหน่ง FMN รวมไซต์ถูกเลือก และทดสอบ โดย mutagenesis ไซต์โดยตรง ในตัวเลือกนี้ เราเลือกเว็บไซต์ที่เก็บไว้การทำงานแม้ มีการเปลี่ยนแปลงในลักษณะกรดอะมิโน การตรวจพบ fluorescence ในสัตว์ทดลองระบุว่า ทุกสายพันธุ์เก็บ fluorescence ตาม ด้วยแผนที่ mutational (รูป 4(c), (i)) อย่างไรก็ตาม สายพันธุ์ L65F และ N104S พบว่าลดลงอย่างมีนัยสำคัญใน fluorescence Quantitatively ตรวจสอบสายพันธุ์เหล่านี้ เรา cloned เหล่านั้นเพื่อการ pET-28a(+) เวกเตอร์นิพจน์ และโปรตีนที่บริสุทธิ์ที่ใช้ยาง Ni NTA วิเคราะห์เรืองแสงในหลอด (รูป 4(c) (ii)) หน่วยเรืองแสงสัมพัทธ์ (RFU) ระบุรูปแบบวิเคราะห์เรืองแสงในสัตว์ทดลอง ยกเว้น L65F แสดงให้เห็นว่า fluorescence อ่อนมากในการทดสอบในสัตว์ทดลอง L65F อย่างไรก็ตาม L65F บริสุทธิ์พบสีล้างสี มีวัดสูงสุด L65F ในการกระตุ้นอย่าง 524 nm การแสดงกะ 27 nm จากชนิดป่า (รูป 4(c), (iii), (iv)) เราคาดการณ์ว่า ผลเหล่านี้เกิดจากการเปลี่ยนแปลงอย่างกรดอะมิโน leucine เป็นแบบขนาดใหญ่หอมกรดอะมิโน phenylalanine ครั้งแรก การเปลี่ยนแปลงนี้อาจทำผล steric บนความมั่นคงของผูก FMN ให้ L65F mutant และรบกวน FMN ถูกผูกไว้จะออก ทำให้เกิดกะในช่วง peak มลพิษใกล้กับ FMN ปล่อยก๊าซสูงสุด ซึ่งเป็น 530 nm สอง การเปลี่ยนแปลงนี้อาจทำให้เปลี่ยนแปลงโครงสร้างในกระเป๋าผูก FMN การเปลี่ยนแปลงสถานะพลังงานของโมเลกุล และดังนั้น การเปลี่ยนแปลงความยาวคลื่นปล่อยก๊าซ

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

เว็บไซต์ฉับกำกับได้รับการดำเนินการโดยใช้เว็บไซต์ที่กำกับชุดฉับ QuikChange (Stratagene) ที่จะแนะนำการกลายพันธุ์เดี่ยวและคู่ในยีน EcFbFP สั้นยีน FbFP ถูกขยายจาก pEcFbFP ใช้ Pfu-X ดีเอ็นเอโพลิเมอร์ (Solgent, แทจอนเกาหลีใต้) ส่งผลให้เส้นวงกลมจับของพลาสมิด พลาสมิดถูกย่อยโดยใช้ DpnI จะเอาดีเอ็นเอแม่คงเหลือและกลายเป็นเซลล์ E. coli TOP10 โดยการเปลี่ยนแปลงช็อกความร้อนที่ 42 ° C mutational ความไวในการทดสอบโดยเว็บไซต์กำกับการกลายพันธุ์ในการตรวจสอบแผนที่ mutational ตำแหน่งกับเว็บไซต์ FMN ปกได้รับการคัดเลือก และทดสอบโดยฉับเว็บไซต์กำกับ ในการเลือกนี้เราเลือกเว็บไซต์ที่ยังคงฟังก์ชั่นของพวกเขาแม้จะมีการเปลี่ยนแปลงในลักษณะกรดอะมิโน การตรวจสอบในร่างกายเรืองแสงที่ชี้ให้เห็นว่าการกลายพันธุ์ทั้งหมดยังคงเรืองแสงตามที่คาดไว้โดยแผนที่ mutational (รูปที่ 4 (ค) (i)) อย่างไรก็ตามกลายพันธุ์ L65F และ N104S แสดงให้เห็นลดความสำคัญในการเรืองแสง เพื่อตรวจสอบปริมาณการกลายพันธุ์เหล่านี้เราโคลนพวกเขาไปยังเวกเตอร์การแสดงออกของสัตว์เลี้ยง 28a (+) และโปรตีนบริสุทธิ์โดยใช้ Ni-NTA เรซินสำหรับในหลอดทดลองทดสอบเรืองแสง (รูปที่ 4 (c), (ii)) หน่วยเรืองญาติ (RFU) ชี้ให้เห็นรูปแบบที่คล้ายกับว่าการทดสอบในร่างกายเรืองแสงยกเว้น L65F L65F แสดงให้เห็นการเรืองแสงอ่อนมากในการทดสอบในร่างกาย; แต่บริสุทธิ์ L65F แสดงให้เห็นสีฟ้าที่ชัดเจน นอกจากนี้ยอดการกระตุ้นของ L65F วัดจะอยู่ที่ 524 นาโนเมตรซึ่งแสดงให้เห็นการเปลี่ยนแปลง 27 นาโนเมตรจากป่าประเภท (รูปที่ 4 (ค) (III), (iv)) เราคาดว่าผลเหล่านี้เกิดขึ้นจากการเปลี่ยนแปลงของกรดอะมิโนที่น่าทึ่งของ Leucine เป็นกรดอะมิโนขนาดใหญ่มีกลิ่นหอม, ฟีนิล ครั้งแรกของการเปลี่ยนแปลงนี้อาจทำให้เกิดผลกระทบต่อเสถียรภาพ steric ของ FMN ผูกพันกับ L65F กลายพันธุ์และรบกวนผูกพัน FMN ที่จะออกก่อให้เกิดการเปลี่ยนแปลงในจุดสูงสุดปล่อยใกล้กับยอดเขาที่ปล่อย FMN ซึ่งเป็น 530 นาโนเมตร ประการที่สองการเปลี่ยนแปลงนี้อาจทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างในกระเป๋า FMN ผูกพันเปลี่ยนสถานะพลังงานของโมเลกุลจึงเปลี่ยนความยาวคลื่นปล่อย

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

เว็บไซต์โดยตรงของการใช้ quikchange เว็บไซต์กำกับการ Kit ( stratagene ) แนะนำเดี่ยวและคู่ ecfbfp การกลายพันธุ์ในยีน สั้น ๆ , fbfp ยีนที่ถูกขยายจาก pecfbfp โดยใช้ดีเอ็นเอพอลิเมอเรส pfu-x ( solgent , Daejeon , เกาหลีใต้ ) ส่งผลให้แหว่งเป็นวงกลมเส้นของพลาสมิดที่ย่อยด้วยพลาสมิด dpni ลบตกค้างแม่แบบดีเอ็นเอ และเปลี่ยนเป็นเซลล์ E . coli TOP10 ฮีตช็อกแปลงที่ 42 ° C

ซึ่งเปลี่ยนแปลงความไวของการทดสอบโดยเว็บไซต์โดยตรง

เพื่อตรวจสอบเกี่ยวกับการเปลี่ยนแปลงแผนที่ตำแหน่ง fmn ผูกพันเว็บไซต์สุ่มและการทดสอบโดยเว็บไซต์กำกับการ . ในการเลือกนี้เราเลือกเว็บไซต์ที่ฟังก์ชันที่มีการสะสมของพวกเขาแม้จะมีการเปลี่ยนแปลงในลักษณะของกรดอะมิโน มีฤทธิ์ในการตรวจหาสารพบว่าสายพันธุ์ทั้งหมด การสะสม ตามความคาดหวังของแผนที่ซึ่งเปลี่ยนแปลง ( รูปที่ 4 ( C ) , ( ผม ) ) อย่างไรก็ตาม สายพันธุ์ และ l65f n104s อย่างมีนัยสำคัญลดการเกิดฟลูออเรสเซนซ์ เพื่อศึกษาปริมาณสายพันธุ์เหล่านี้เราโคลนพวกเขากับนิพจน์เวกเตอร์ pet-28a ( ) และโปรตีนบริสุทธิ์โดยใช้เรซิน ผมค้าขายใน fluorescent assay ( รูปที่ 4 ( C ) ( 2 ) ) หน่วยฟลูออเรสเซนต์สัมพัทธ์ ( RFU ) พบรูปแบบคล้ายกับที่ของชนิดเรืองแสง ( ยกเว้น l65f . l65f พบเรืองอ่อนมากในการทดสอบ ในสัตว์ทดลอง อย่างไรก็ตาม บริสุทธิ์ l65f แสดงชัดเจนสีฟ้าสี นอกจากนี้ไทเทเนียมสูงสุดของ l65f วัดอยู่ที่ 524 nm แสดงกะ 28 nm จากประเภทของป่า ( รูปที่ 4 ( C ) , ( 3 ) , ( 4 ) เราคาดการณ์ว่าผลลัพธ์เหล่านี้เกิดขึ้นจากการเปลี่ยนแปลงของกรดอะมิโนลิวซีนดราม่าเข้าไปเกะกะอะโรมาติกกรดอะมิโนฟีนิลอะลานีน . ก่อน การเปลี่ยนแปลงนี้อาจก่อให้เกิดผลเอต่อเสถียรภาพของ fmn ผูก l65f กลายพันธุ์และรบกวนผูก fmn จะถูกปล่อยตัวสาเหตุในการเปลี่ยนยอดใกล้เคียงกับ fmn มลพิษสูงสุดซึ่งเป็น 530 nm . ประการที่สอง การเปลี่ยนแปลงนี้อาจทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างใน fmn ผูกกระเป๋า เปลี่ยนพลังงานสถานะของโมเลกุลและจึงเปลี่ยนการปล่อยความยาวคลื่น