themselves have either the in/down

themselves have either the in/down (C290I or
C290V) or the out/down (C290F) conformation
(Fig. 2I–K). Like S288A and S291P, the G289A
alone mutant is modified by dimethyl arsenic adduct
and the conformation of the loop has been significantly
distorted as a result (Fig. 2H).
Cys290 mutations
The Cys290 residue is buried in a hydrophobic
pocket when the loop adopts the in conformation but
is largely solvent exposed when the loop has the out
conformation. We therefore probed its function with
mutations that would energetically stabilize either
state. Mutations to small hydrophobic side chains
such as isoleucine and valine resulted in hyperactive
polymerases with ~ 2- and ~ 3-fold increases in
product formation in the poly(A) template assay.
This suggests that the mutant polymerases may be
faster and/or that they form more stable or processive
ECs than the wild-type enzyme (Table 1). These
non-polar mutants also show efficient stepwise
elongation of the RNA hairpin substrate (Fig. 4A),
and their structures consistently show the in/down
conformation where residue 290 is buried in the
hydrophobic pocket, Ser288 is down, and the
Asp177–Lys61 salt bridge remains intact (Fig. 2B
and c). In contrast, introducing a small polar
residue with a C290S mutation results in a structure
that is essentially identical with native 3Dpol with an
in/up loop conformation (Fig. 2E) but whose
elongation activity is reduced 5-fold (Table 1).
Increasing the polarity of residue 290 thus decreases
activity while more hydrophobic residues
increase activity.
Three mutations that were not expected to be
structurally compatible with the loop in conformation
severely impaired 3Dpol function. First, the large
hydrophobic substitution to phenylalanine at residue
290 leads to an ~ 2.5-fold decrease in product
formation activity that is likely due to a kinetically
slow step of burying the large and conformationally
restricted phenylalanine residue into the hydrophobic
pocket. Consistent with this, the structure of
C290F shows an out/down conformation for the
loop. Second, negatively charged side chains are
unlikely to be buried in the hydrophobic pocket and
would thus prevent the formation of either the in/up
or the in/down loop conformation, and the structure
of C290E reveals an out/down conformation that
places the negatively charged side chain in the polar
environment above the palm (Fig. 2L). Several
attempts to crystallize C290D failed, and thus, the
structure of this mutant is unknown. Both C290E
and C290D mutations also completely abolish both
the processive elongation activity and the ability of
the enzyme to add even a single nucleotide
(Fig. 4D). These mutants also have reduced RNA
affinity, suggesting that there is likely a clash
between a loop that is in the out conformation and
the bound RNA.
Ser291 mutations
At the final residue of the loop, Ser291, a proline
mutation, has previously been shown to significantly
reduce viral growth via a dominant negative mutation
that interfered with wild-type virus replication [17]. In
our in vitro assays, this mutant resulted in a 50-fold
reduction in elongation activity. The mutant polymerase
does incorporate multiple nucleotides in the
stepwise assay, but it does so slowly and inefficiently,
leaving behind a significant amount of starting
material (Fig. 4B). Structurally, this loop mutant
appears to adopt the out/down conformation, but the
loop has been covalently modified by dimethyl
arsenic during crystallization and its true conformation
is unknown (Fig. 2G).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ตัวเองมีทั้งที่ใน/ลง (C290I หรือC290V) หรือ conformation (C290F) ออก/ลง(Fig. 2I – K) เช่น S288A และ S291P, G289Amutant คนเดียวแก้ไข โดยสารหนู dimethyl adductและ conformation ของลูปได้อย่างมากผิดเพี้ยนเป็นผล (Fig. 2 H)การกลายพันธุ์ Cys290สารตกค้าง Cys290 จะฝังในเป็น hydrophobicกระเป๋าเมื่อลูป adopts conformation ใน แต่เป็นตัวทำละลายส่วนใหญ่สัมผัสเมื่อวนได้ออกconformation เราได้พิสูจน์หน้าที่ด้วยดังนั้นกลายพันธุ์ที่จะหรบ ๆ อยู่ดีอย่างใดอย่างหนึ่งรัฐ กลายพันธุ์ไปนิดนึง hydrophobic โซ่เช่น isoleucine และวาลีนทำให้เกิดซุกซนผิดปกติpolymerases กับ ~ 2 - และ ~ 3-fold เพิ่มการสะสมสินค้าในการทดสอบแม่แบบ poly(A)นี้แนะนำว่า อาจจะ polymerases การกลายพันธุ์ได้เร็วขึ้น หรือว่า จะแบบ processive หรือมีเสถียรภาพมากขึ้นECs กว่าเอนไซม์ชนิดป่า (ตารางที่ 1) เหล่านี้สายพันธุ์ไม่ใช่ขั้วโลกยังแสดงประสิทธิภาพ stepwiseelongation ของพื้นผิวกิ๊บอาร์เอ็นเอ (Fig. 4A),และโครงสร้างของพวกเขาอย่างต่อเนื่องแสดงในใน/ลงconformation ที่ 290 ตกค้างฝังอยู่ในตัวกระเป๋า hydrophobic, Ser288 จะลดลง และAsp177 – Lys61 สะพานเกลือยังคง เหมือนเดิม (Fig. 2Bก c) แนะนำขนาดเล็กในทางตรงกันข้าม ขั้วโลกสารตกค้าง มีผลเป็นการกลายพันธุ์ C290S ในโครงสร้างก็เป็นเหมือนกับ 3Dpol พื้นเมืองด้วยการ/ conformation ลูป (Fig. 2E) แต่ที่ในขึ้นลดกิจกรรม elongation 5-fold (ตารางที่ 1)เพิ่มขั้วของสารตกค้าง 290 ลดลงดังนั้นกิจกรรมขณะ hydrophobic ตกเพิ่มเติมเพิ่มกิจกรรมกลายพันธุ์สามที่ไม่ว่าจะเป็นstructurally เข้ากันได้กับลูปใน conformationฟังก์ชัน 3Dpol ความรุนแรง แรก ขนาดใหญ่ทด hydrophobic phenylalanine ที่ตกค้าง290 ที่นำไปสู่การ ~ 2.5-fold ลดลงในผลิตภัณฑ์กิจกรรมก่อที่จะครบกำหนด kineticallyขั้นตอนที่ช้าของ burying ขนาดใหญ่ และ conformationallyสารตกค้างของ phenylalanine จำกัดเป็น hydrophobicกระเป๋า สอดคล้องกับนี้ โครงสร้างของC290F แสดง conformation ออกเคลื่อนที่สำหรับการวน มีโซ่ข้างสอง คิดค่าธรรมเนียมส่งไม่น่าจะถูกฝังอยู่ในกระเป๋า hydrophobic และจึงต้องป้องกันการก่อตัวของอย่างใดอย่างหนึ่งที่ใน/ค่าหรือ ใน/ลงวน conformation และโครงสร้างของ C290E เผยมี conformation ออกเคลื่อนที่ใส่โซ่ด้านลบคิดค่าธรรมเนียมในขั้วโลกสภาพแวดล้อมข้างต้นปาล์ม (Fig. 2 L) หลายพยายามที่จะตกผลึก C290D ล้มเหลว และ การโครงสร้างของ mutant นี้ไม่รู้จัก C290E ทั้งสองและ C290D กลายพันธุ์อย่างสมบูรณ์ยังยุบทั้งสองกิจกรรม processive elongation และความสามารถของเอนไซม์เพิ่มแม้คำเดียวนิวคลีโอไทด์(Fig. โตโยต้า) สายพันธุ์เหล่านี้ยังมีลดอาร์เอ็นเอความสัมพันธ์ แนะนำว่า มีจะความขัดข้องระหว่างวนที่ conformation ออก และอาร์เอ็นเอที่ถูกผูกไว้การกลายพันธุ์ Ser291ที่ตกค้างสุดท้ายของลูป Ser291, proline เป็นกลายพันธุ์ มีก่อนหน้านี้ได้แสดงอย่างมีนัยสำคัญลดการเจริญเติบโตของไวรัสผ่านการกลายพันธุ์ลบเป็นหลักที่ติดกับป่าชนิดไวรัสจำลอง [17] ในassays เราเพาะเลี้ยง mutant นี้ผลในการ 50-foldลดกิจกรรม elongation พอลิเมอเรสกลายพันธุ์รวมนิวคลีโอไทด์หลายในการทดสอบ stepwise แต่มันไม่ได้ช้า และทิ้งไปอย่างสิ้น เปลืองออกหลังยอดเงินสำคัญของการเริ่มต้นวัสดุ (Fig. 4B) วนนี้ mutant structurallyแสดง นำออก/ลง conformation แต่วนถูก covalently แก้ไข โดย dimethylสารหนูในระหว่างการตกผลึกและ conformation ของจริงคือไม่รู้จัก (Fig. 2G)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ตัวเองมีทั้งใน / ลง (C290I หรือ
C290V) หรือออก / ลง (C290F) โครงสร้าง
(รูป. 2I-K) เช่นเดียวกับ S288A และ S291P, G289A
กลายพันธุ์คนเดียวมีการแก้ไขโดยดึงเข้าหาสารหนู dimethyl
และโครงสร้างของวงที่ได้รับอย่างมีนัยสำคัญ
เป็นผลบิดเบี้ยว (รูป. 2H).
การกลายพันธุ์ Cys290
ตกค้าง Cys290 ถูกฝังอยู่ในที่ไม่ชอบน้ำ
กระเป๋าเมื่อวง adopts ในรูปแบบ แต่
เป็นตัวทำละลายส่วนใหญ่สัมผัสเมื่อวงมีออก
โครงสร้าง ดังนั้นเราจึงถูกตรวจสอบหรือฟังก์ชั่นที่มี
การกลายพันธุ์ที่มีพลังที่จะรักษาเสถียรภาพของทั้ง
รัฐ การกลายพันธุ์โซ่ด้านที่ไม่ชอบน้ำขนาดเล็ก
เช่น isoleucine และ valine ผลในสมาธิ
polymerases กับ ~ ~ 2 และเพิ่มขึ้น 3 เท่าใน
การพัฒนาผลิตภัณฑ์โพลี () ในการตรวจแม่แบบ.
นี้แสดงให้เห็นว่า polymerases กลายพันธุ์อาจจะ
เร็วขึ้นและ / หรือที่ พวกเขาเป็นมีเสถียรภาพมากขึ้นหรือ processive
ECs กว่าเอนไซม์ชนิดป่า (ตารางที่ 1) เหล่านี้
กลายพันธุ์ที่ไม่มีขั้วยังแสดงให้เห็นขั้นตอนที่มีประสิทธิภาพ
การยืดตัวของพื้นผิวกิ๊บอาร์เอ็นเอ (รูป. 4A)
และโครงสร้างของพวกเขาอย่างต่อเนื่องแสดงให้เห็นใน / ลง
โครงสร้างที่ตกค้าง 290 ถูกฝังอยู่ใน
กระเป๋าของสารที่เป็น Ser288 ลงและ
Asp177-Lys61 สะพานเกลือยังคงเหมือนเดิม (รูป. 2B
และค) ในทางตรงกันข้ามการแนะนำขั้วขนาดเล็ก
ที่เหลือมีผลการกลายพันธุ์ C290S ในโครงสร้าง
ที่เป็นหลักเหมือนกันกับ 3Dpol พื้นเมืองที่มี
ใน / ขึ้นโครงสร้างห่วง (รูป. 2E) แต่มี
กิจกรรมการยืดตัวจะลดลง 5 เท่า (ตารางที่ 1).
ที่เพิ่มขึ้น ขั้วของสารตกค้าง 290 จึงลดลง
ในขณะที่กิจกรรมที่ตกค้างไม่ชอบน้ำมากขึ้น
เพิ่มกิจกรรม.
สามการกลายพันธุ์ที่ไม่ได้คาดว่าจะเป็น
โครงสร้างที่สามารถทำงานร่วมกับวงในรูปแบบ
ที่มีความบกพร่องอย่างรุนแรงฟังก์ชั่น 3Dpol ครั้งแรกที่มีขนาดใหญ่
ไม่ชอบน้ำเพื่อทดแทนฟีนิลที่ตกค้าง
290 นำไปสู่การลดลง ~ 2.5 เท่าในผลิตภัณฑ์
กิจกรรมการก่อตัวที่น่าจะเกิดจากการเคลื่อนไหวร่างกาย
ขั้นตอนที่ช้าของการฝังขนาดใหญ่และ Conformationally
ตกค้างฟีนิลที่ถูก จำกัด ลงไม่ชอบน้ำ
กระเป๋า สอดคล้องกับเรื่องนี้โครงสร้างของ
C290F แสดงให้เห็นออก / ลงโครงสร้างสำหรับ
วง ประการที่สองประจุลบโซ่ข้างเคียง
ไม่น่าจะถูกฝังอยู่ในกระเป๋าไม่ชอบน้ำและ
จึงจะป้องกันการก่อตัวของทั้งใน / ขึ้น
หรือ / ลงโครงสร้างห่วงและโครงสร้าง
ของ C290E เผยให้เห็นออก / ลงโครงสร้างที่
วางลบ ห่วงโซ่ด้านค่าใช้จ่ายในขั้วโลก
สภาพแวดล้อมดังกล่าวข้างต้นปาล์ม (รูป. 2L) หลายคน
พยายามที่จะตกผลึก C290D ล้มเหลวและทำให้
โครงสร้างของมนุษย์กลายพันธุ์นี้เป็นที่รู้จัก ทั้ง C290E
การกลายพันธุ์และ C290D ยังสมบูรณ์ทั้งยกเลิก
กิจกรรมการยืดตัว processive และความสามารถของ
เอนไซม์ที่จะเพิ่มแม้เบื่อหน่ายเดียว
(รูป. 4D) การกลายพันธุ์เหล่านี้ยังมีการลด RNA
สัมพันธ์ที่ใกล้ชิดบอกว่ามีแนวโน้มการปะทะกัน
ระหว่างวงที่อยู่ในโครงสร้างออกมาและ
อาร์เอ็นเอที่ถูกผูกไว้.
Ser291 การกลายพันธุ์
ที่ตกค้างสุดท้ายของวง Ser291, โพรลีน
กลายพันธุ์ได้รับก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นว่า อย่างมีนัยสำคัญ
ลดการเจริญเติบโตของเชื้อไวรัสผ่านการกลายพันธุ์ที่โดดเด่นในเชิงลบ
ว่าแทรกแซงด้วยการจำลองแบบของไวรัสชนิดป่า [17] ใน
การตรวจในห้องปฏิบัติการของเรากลายพันธุ์นี้ส่งผลใน 50 เท่า
ลดลงในกิจกรรมการยืดตัว โพลิเมอร์กลายพันธุ์
ไม่รวมนิวคลีโอหลายคนใน
การทดสอบแบบขั้นตอน แต่มันไม่ได้ช้าและไม่ได้ผล
ออกหลังจำนวนเงินที่สำคัญของการเริ่มต้น
วัสดุ (รูป. 4B) การก่อสร้างกลายพันธุ์วงนี้
จะปรากฏขึ้นเพื่อนำมาใช้ออก / ลงโครงสร้าง แต่
ห่วงได้รับการแก้ไขโดย covalently dimethyl
สารหนูในระหว่างการตกผลึกและโครงสร้างที่แท้จริงของมัน
เป็นที่รู้จัก (รูป. 2G)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ตัวเองมีทั้งใน / ลง ( c290i หรือ
c290v ) หรือออก / ลง ( c290f ) โครงสร้าง
( รูปที่ 2i ) K ) ชอบ s288a และ s291p , g289a
อยู่คนเดียวกลายพันธุ์ดัดแปลงโดยไดเมทิลสารหนูปุ่มตัวเลือก
และโครงสร้างของลูปได้รับมาก
บิดเบือนผล ( รูปที่ 2H )

cys290 การกลายพันธุ์ cys290 ตกค้างฝังอยู่ในกระเป๋า )
เมื่อห่วง adopts ในโครงสร้างแต่
ส่วนใหญ่เป็นตัวทำละลายเปิดเผยเมื่อวงได้ออก
โครงสร้าง ดังนั้นเราจึงสามารถของฟังก์ชันที่มีการกลายพันธุ์ที่กระฉับกระเฉงมั่นคงเหมือนกัน

สถานะ การกลายพันธุ์ด้านโซ่ขนาดเล็ก เช่น ไอโซลิวซีน และ วาลีน )
( polymerases ไฮเปอร์
~ 2 ~ 3-fold เพิ่มขึ้นในการพัฒนาผลิตภัณฑ์ในโพลี (
3
) แม่แบบนี้แสดงให้เห็นว่า polymerases กลายพันธุ์อาจ
ได้เร็วขึ้นและ / หรือที่พวกเขาฟอร์มมั่นคงหรือ processive
ECS กว่าของเอนไซม์ ( ตารางที่ 1 ) สายพันธุ์นี้ยังแสดงเวลาแบบไม่มีขั้ว

อย่างมีประสิทธิภาพของ RNA กิ๊บ ( รูปที่ 4 ) , พื้นผิวและโครงสร้างของพวกเขาอย่างต่อเนื่องแสดง

/ ลงของที่ตกค้างมีฝังอยู่ในกระเป๋า )
,
ser288 เป็นลงasp177 – lys61 สะพานเกลือยังคงเหมือนเดิม ( รูปที่ 2B
C ) ในทางตรงกันข้าม การแนะนำเล็ก ๆด้วย c290s ขั้วโลก
กาก
การกลายพันธุ์ผลในโครงสร้างที่เป็นหลักที่เหมือนกันกับเจ้าของภาษา 3dpol ด้วย
/ ขึ้นรูปห่วง ( รูปที่ 2 ) แต่ที่
กิจกรรมยืดตัวลดลงผู้อื่น ( ตารางที่ 1 ) .
เพิ่มขั้วของตกค้าง 290 จึงลดลง
กิจกรรมในขณะที่ ) เพิ่มเติม ตกค้าง
เพิ่มกิจกรรม .
3 เรื่องที่ไม่คาดว่าจะ
ซึ่งเข้ากันได้กับวงในโครงสร้าง
บกพร่องอย่างรุนแรง 3dpol ฟังก์ชัน ครั้งแรก มาก

) การแทนที่เบสที่ตกค้าง 290 ที่นำไปสู่การลดลงในผลิตภัณฑ์
~ 2.5-fold กิจกรรมที่น่าจะเกิดจากการจลนศาสตร์
ช้าขั้นตอนที่ฝัง conformationally
ขนาดใหญ่และจำกัดฟีนีกากลงในกระเป๋า )

สอดคล้องกับ โครงสร้างของ
c290f แสดงออก / ลงข้อมูลสำหรับ
วง ที่สอง , ซึ่งมีประจุลบด้านโซ่
ไม่น่าจะอยู่ในกระเป๋า ) และ
จึงป้องกันการก่อตัวของทั้งใน / ขึ้น / ลงรูป
หรือห่วงและโครงสร้าง
ของ c290e เผยออกจากโครงสร้างที่
/ ลงสถานที่ที่ประจุลบด้านห่วงโซ่อุปทานในขั้วโลก
สภาพแวดล้อมข้างต้นปาล์ม ( ภาพ 2L ) หลายครั้ง
ตกผลึก c290d ล้มเหลว ดังนั้น โครงสร้างนี้กลายพันธุ์
ไม่รู้ ทั้ง c290e
c290d การกลายพันธุ์และยังสมบูรณ์ยกเลิกทั้ง processive ยืดยาว

กิจกรรมและความสามารถของเอนไซม์เพิ่มแม้แต่
ซิงเกิลนิวคลีโอไทด์ ( รูป 4D ) สายพันธุ์เหล่านี้ยังได้ลด
.6 แนะนำว่ามีแนวโน้มการปะทะ
ระหว่างวงที่อยู่ในโครงสร้างและออก


ผูกพัน RNA ser291 การกลายพันธุ์ที่ตกค้างสุดท้ายของห่วง ser291 , proline
การศึกษาก่อนหน้านี้ได้ถูกแสดงอย่าง
ลดการเจริญเติบโตของไวรัสผ่านทางเด่นลบการกลายพันธุ์
ที่แทรกแซงของไวรัส [ 17 ] ใน
ในหลอดทดลอง ) ของเรานี้กลายพันธุ์ส่งผล 50 พับ
ลดกิจกรรมการยืดตัว .
การกลายพันธุ์ ไม่รวมหลายคู่ใน
3 คน แต่มันช้ามาก และได้ผล
ทิ้ง , จํานวนวัสดุเริ่มต้น
( รูปที่ 4B ) โครงสร้างนี้ห่วงกลายพันธุ์
ปรากฏอุปการะออก / ลงข้อมูลแล้ว แต่ได้รับการแก้ไขโดย covalently ห่วง

ไดเมทิลสารหนูในโครงสร้างที่แท้จริงของการตกผลึกและ
ไม่ทราบ ( รูปที่ 2G )